Una plataforma de microfluidos para el procesamiento de precisión de pequeño volumen de la muestra y su uso para Tamaño partículas biológicas separadas con un Microdevice acústica

El objetivo general de este procedimiento es realizar separaciones automatizadas de partículas de pequeño volumen utilizando un dispositivo fótico microfluídico. Este método puede permitir procedimientos clave en el campo de la ingeniería biomédica, incluido el procesamiento y la separación robustos de muestras para aplicaciones de biodetección e investigación clínica. Las principales ventajas de esta técnica son la modularidad, la precisión, la robustez y la automatización, lo que la hace adaptable y flexible no solo para la separación retical, sino para una amplia variedad de flujos a través de dispositivos de separación microfluídica.

Primero reconocimos la necesidad de esta capacidad para realizar separaciones de forma rutinaria y fiable en volúmenes de muestras biológicas submilimétricas sin dilución significativa o pérdida de analito. La integración de la medición de muestras y el enrutamiento automatizado desde la fuente hasta los archivos de recolección, junto con las operaciones estándar de la bomba de jeringa, es fundamental para trabajar con éxito a esta escala. Para comenzar, diseñe el dispositivo acústico retic y la disposición de las dos máscaras fotográficas como se describe en la sección uno del protocolo de texto adjunto.

A continuación, modele los puertos de fluido de la parte trasera en una oblea de silicio 1 0 0 pulida de doble cara. Uso de fotolitografía de resistencia positiva estándar Grabe esta geometría utilizando grabado iónico reactivo profundo a una profundidad de 350 a 400 micrómetros. A continuación, dé la vuelta a la oblea y modele la geometría del canal de fluido de la parte frontal.

Nuevamente, usando fotolitografía de resistencia positiva estándar, luego monte la oblea estampada en una segunda oblea portadora de silicio en blanco. Usando fotorresistencia, grabe los canales expuestos a una profundidad de 200 micrómetros. Usando un grabado iónico de reacción profunda, luego sumerja la oblea del dispositivo en una solución de extracción resistente para separarla de la oblea de silicio en blanco.

A continuación, limpie la oblea del dispositivo y una oblea de vidrio de silicato de boro de 0,5 milímetros de grosor sin rasgos distintivos con una solución de piraña. Una vez limpio, selle los canales de fluido que unen iónicamente el vidrio y la oblea de silicona utilizando las condiciones que se muestran aquí. Por último, corte las virutas individuales con un disco de diamante en una sierra para cortar en cubitos de un kit de epoxi de baja viscosidad de dos componentes.

Pesa la proporción recomendada de ambos componentes y mézclalos bien. A continuación, coloque el titanato de plomo Zirkin eight o la piezocerámica PCT en una plantilla adecuada y utilice una pipeta para esparcir aproximadamente 10 microlitros de la mezcla epoxi de manera uniforme a través de ella para crear una capa fina y uniforme. A continuación, coloque el chip en la plantilla y alinee el lado epoxi de la cerámica de pizo con el chip microfluídico.

Puede ser necesario sujetar el chip con cinta adhesiva para mantenerlo en su lugar mientras se alinea. Sujete el conjunto en un tornillo de banco teniendo cuidado de no agrietar ninguno de los componentes y cure la temperatura y la duración recomendadas por el fabricante del epoxi. Después de que el epoxi se haya curado, use un soldador de punta fina para conectar cables de calibre fino a cada lado de la cerámica pizo.

Si es necesario, use el fundente adecuado para preparar la superficie del pizo. Tenga cuidado de hacer el contacto más breve posible con el pizo para evitar despolarizarlo térmicamente. Fije el chip a una placa de pruebas fluida utilizando accesorios de sujeción.

Además, conecte un ventilador de enfriamiento a la placa de pruebas para regular la temperatura durante los experimentos acústicos. A continuación, atornille el chip a los conectores mundiales. Monte la placa de pruebas en la platina del microscopio y únase al mundo para conectar los conectores a los tubos adicionales en las entradas y salidas.

Usando uniones roscadas estándar de cuarto 28. Para un tubo de 16 pulgadas, conecte el chip microfluídico a la bomba de jeringa, las válvulas de selección multipuerto controladas por computadora, los medidores de flujo interconectados por PC y la tubería como se muestra aquí y se describe en la figura cuatro del protocolo de texto adjunto. Antes de ejecutar la separación, llene los depósitos de reactivos de limpieza y cebe sus líneas de fluido correspondientes.

También coloque las válvulas tres y cuatro en las salidas de virutas para que fluyan inicialmente a los depósitos de desechos. A continuación, encienda el ventilador de refrigeración. Conecte los cables cerámicos pizo al amplificador de potencia y ajuste el generador de funciones a la frecuencia de resonancia para el chip acústico que se está utilizando.

Ajuste el punto de ajuste de voltaje en el generador de funciones para que el amplificador de RF emita entre 12 y 25 voltios de pico a pico según corresponda para la separación deseada. A continuación, conecte los viales de recogida adecuados y el vial de entrada del tampón al sistema. Utilice el tampón de muestra adecuado para las células o partículas que se van a separar o según lo requiera el ensayo de análisis que se utilizará después de la separación.

A continuación, cargue el software de control y utilícelo para controlar las válvulas, los sensores de flujo y la bomba para llevar a cabo la rutina de cebado y separación totalmente automática. Inmediatamente antes de iniciar el procedimiento de separación, agite brevemente el vial de muestra para volver a suspender las partículas que puedan haberse depositado. Alternativamente, pipetea la muestra hacia arriba y hacia abajo 10 veces para mezclar muestras biológicas que son más susceptibles a daños o aglomeración por vórtice.

A continuación, conecte el vial de muestra a la línea de entrada e inicie la rutina de cebado y separación sin demora. Comience usando el software para cebar la entrada de aire de las válvulas uno y dos para asegurarse de que la tubería no contenga fluido. Prepare simultáneamente el tubo que conecta el vial de entrada del tampón a la válvula dos y el vial de entrada de muestra a la válvula uno.

Haga que la bomba de jeringa extraiga aproximadamente 15 microlitros de ambos viales para llenar completamente el tubo, conectándolos a las válvulas. Por último, cambie las válvulas uno y dos a la basura para expulsar cualquier exceso de líquido o aire que haya entrado en el serpentín de carga. A continuación, configure el programa para cargar la bobina de muestra extrayendo primero 25 microlitros de aire a 50 microlitros por minuto.

Luego se cargan 250 microlitros de muestra a 200 microlitros por minuto, seguidos de 35 microlitros de tampón principal a 200 microlitros por minuto y, finalmente, otros 25 microlitros de aire a 50 microlitros por minuto. A continuación, configure las bombas de jeringa para infundir los tapones de fluido cargados a 100 microlitros por minuto y controle los caudales en las salidas de partículas pequeñas y grandes mediante sensores de flujo. La relación de flujo adecuada se puede determinar como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Cuando los sensores de caudal detecten un pico en el caudal que indique el paso del primer espacio de aire, cambie la válvula de salida correspondiente del vial de residuos a un vial de recogida de muestras. Asegúrese de que el flujo sea estable a medida que la muestra transita por el chip y se separe observando las lecturas del sensor de flujo. A medida que la muestra pasa a través del chip, las fracciones separadas se recogen en las válvulas de salida.

Al final del tapón de muestra, observe el sensor de flujo, detecte el segundo espacio de aire. En este punto, vuelva a desagüe las válvulas de salida. Después de dispensar el volumen completo, detenga la infusión de la bomba de jeringa y finalice la rutina de automatización.

Una vez finalizado el experimento de separación, desconecte los viales de recolección de muestras de partículas pequeñas y grandes y guárdelos adecuadamente para su posterior análisis. Asegure el tubo de recogida de muestras en viales vacíos para recoger el exceso de soluciones de limpieza que se eliminarán a través de los tubos. A continuación, inicie la rutina de limpieza automatizada del sistema como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Durante este proceso, el programa controlará las válvulas y la bomba de jeringa para cargar secuencialmente la bobina de retención con reactivos de limpieza y enjuagarlos a través del sistema. Una vez finalizado el proceso automatizado de limpieza y descontaminación, deseche el exceso de soluciones de lavado y los viales en los que se recogieron, siguiendo los procedimientos adecuados para el manejo de residuos biológicos o químicos. Aquí se muestra un escaneo de frecuencia representativo de un pizo bien acoplado y un dispositivo microfluídico.

Cuando el acoplamiento entre el pizo y el dispositivo microfluídico es bueno, las partículas se enfocan firmemente en la frecuencia de resonancia, lo que resulta en un pico claro en la intensidad fluorescente y la migración a la posición de enfoque esperada. Por el contrario, cuando hay un acoplamiento deficiente, las partículas no se enfocarán bien y el dispositivo no es adecuado cuando el enfoque de alta calidad o el flujo rápido son críticos para la aplicación requerida. Cada línea de este gráfico representa los resultados de la separación utilizando varios tamaños de partículas de poliestireno y voltajes de conducción de pizo.

En general, se requieren voltajes más altos para extraer partículas más pequeñas. Sin embargo, los voltajes secos no se pueden aumentar indefinidamente debido a una mayor disipación de calor y a los efectos crecientes de la transmisión acústica. Para demostrar la utilidad de esta plataforma para la separación biológica de partículas, se añadieron células raji humanas con un diámetro promedio de ocho a 10 micrómetros con el virus del dengue con un diámetro aproximado de 50 nanómetros y luego se separaron utilizando el dispositivo microfluídico acústico.

Una vez que se ensambla y programa un sistema como este, las separaciones se pueden llevar a cabo de forma rutinaria en aproximadamente cinco minutos. Se pueden procesar alrededor de tres muestras por hora con una limpieza y descontaminación completas entre muestras. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el recuento de células, la transferencia occidental o la secuenciación de próxima generación, con el fin de confirmar la pureza de la separación y dilucidar el significado biológico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un dispositivo de separación microfluídica típico. Utilice las conexiones del mundo al chip para interactuar con el hardware y ejecute un procedimiento de separación automatizado de forma precisa y robusta. No olvide que el trabajo con materiales infecciosos puede ser extremadamente peligroso y solo debe ser realizado por personal debidamente capacitado que utilice el equipo y los procedimientos adecuados prescritos institucionalmente para la seguridad biológica.