Una plataforma de microfluidos para el procesamiento de precisión de pequeño volumen de la muestra y su uso para Tamaño partículas biológicas separadas con un Microdevice acústica

El objetivo general de este procedimiento es realizar separaciones automatizadas de partículas en pequeños volúmenes utilizando un dispositivo microfluídico fotónico. Este método puede permitir procedimientos clave en el campo de la ingeniería biomédica, incluyendo el procesamiento robusto y la separación de muestras para aplicaciones de detección biológica e investigación clínica. Las principales ventajas de esta técnica son la modularidad, la precisión, la robustez y la automatización, lo que la hace adaptable y flexible no solo para la separación de retículos, sino también para una amplia variedad de dispositivos de separación microfluídicos de flujo continuo.

Primero reconocimos la necesidad de esta capacidad para realizar rutinariamente separaciones de forma confiable en volúmenes de muestras biológicas submilimétricos sin una dilución significativa ni pérdida de analito. La integración del dosificado de muestras y la derivación automatizada desde los archivos de origen hasta los de recolección, junto con las operaciones estándar de la bomba de jeringa, es fundamental para trabajar con éxito a esta escala. Para comenzar el diseño, el dispositivo acústico reticulado y la distribución de las dos máscaras fotolitográficas se describen en la sección uno del protocolo de texto adjunto.

Luego, patronee los puertos de fluido del lado posterior sobre un sustrato de silicio 1 0 0 pulido por ambas caras. Utilizando litografía fotolitográfica convencional con resist positivo, grabe esta geometría mediante grabado iónico reactivo profundo hasta una profundidad de 350 a 400 micrómetros. A continuación, gire el sustrato e invierta su orientación y patronee la geometría del canal de fluido del lado frontal.

Una vez más, utilizando litografía fotográfica estándar con resistencia positiva, monte la oblea patroneada sobre una segunda oblea de silicio portadora en blanco. Utilizando la resistencia fotosensible, grave ahora los canales expuestos hasta una profundidad de 200 micrómetros. Mediante grabado reactivo profundo, sumerja luego la oblea del dispositivo en una solución desechadora de resistencia para separarla de la oblea de silicio en blanco.

A continuación, limpie la oblea del dispositivo y una oblea de vidrio de borosilicato sin características de 0,5 milímetros de espesor utilizando solución de piraña. Una vez limpia, selle los canales de fluido mediante unión iónica de la oblea de vidrio y silicio utilizando las condiciones mostradas aquí. Finalmente, corte los chips individuales con una cuchilla de diamante en una cortadora, utilizando un kit de epoxi de baja viscosidad de dos componentes.

Pese la proporción recomendada de ambos componentes y mézclelos completamente. Luego, coloque el cerámico piezoeléctrico de titanato de circonio de plomo o PCT en un soporte adecuado y use una pipeta para distribuir aproximadamente 10 microlitros de la mezcla de epoxi uniformemente sobre él, creando una capa delgada y homogénea. A continuación, coloque el chip en el soporte y alinee el lado con epoxi del cerámico piezoeléctrico con el chip microfluídico.

Puede ser necesario fijar el chip con cinta para mantenerlo en su lugar durante la alineación. Sujete el conjunto en una morsa teniendo cuidado de no agrietar ninguno de los componentes, y cure a la temperatura y durante el tiempo recomendados por el fabricante del epoxi. Después de que el epoxi haya curado, utilice un soldador de punta fina para conectar cables delgados a cada lado del cerámico piezoeléctrico.

Si es necesario, utilice el flujo adecuado para preparar la superficie de pizo. Tenga cuidado de mantener el contacto más breve posible con el pizo para evitar despolarlo térmicamente. Sujete el chip a una placa de fluidos mediante accesorios de sujeción.

Además, sujete un ventilador de enfriamiento a la placa de pruebas para regular la temperatura durante los experimentos acústicos. A continuación, atornille los conectores del chip a los conectores externos. Monte la placa de pruebas sobre la platina del microscopio y conecte los conectores externos a los conectores del chip mediante tubos adicionales en las entradas y salidas.

Utilizando uniones roscadas estándar de cuarto de pulgada 28. Para un tubo de dieciseisavo de pulgada, conecte el chip microfluídico a la bomba de jeringa, a las válvulas de selección multipuerto controladas por computadora, a los medidores de flujo conectados a la PC y a los tubos, como se muestra aquí y se describe en la figura cuatro del protocolo de texto adjunto. Antes de realizar la separación, llene los depósitos de reactivos de limpieza y purgue las líneas de fluido correspondientes.

Asimismo, configure las válvulas tres y cuatro en las salidas del chip para que inicialmente fluyan hacia los depósitos de desecho. A continuación, encienda el ventilador de enfriamiento. Conecte los cables del cerámico piezoeléctrico al amplificador de potencia y ajuste el generador de funciones a la frecuencia resonante del chip acústico que se esté utilizando.

Ajuste el punto de ajuste de voltaje en el generador de funciones para que el amplificador de RF emita entre 12 y 25 voltios de pico a pico, según sea apropiado para la separación deseada. Luego, conecte los viales de recolección adecuados y el vial de entrada del tampón al sistema. Utilice el tampón de muestra adecuado para las células o partículas que se van a separar o según lo requiera el ensayo de análisis que se utilizará después de la separación.

A continuación, cargue el software de control y utilícelo para controlar las válvulas, los sensores de flujo y la bomba con el fin de realizar la rutina de cebado y separación completamente automática. Inmediatamente antes de iniciar el procedimiento de separación, agite brevemente el vial de muestra en vórtex para resuspender cualquier partícula que pueda haberse sedimentado. Alternativamente, aspire y expulse la muestra con una pipeta 10 veces para mezclar muestras biológicas que sean más susceptibles al daño o a la formación de grumos por agitación en vórtex.

Luego, conecte el vial de muestra a la línea de entrada e inicie sin demora la rutina de cebado y separación. Comience utilizando el software para cebar la entrada de aire de las válvulas uno y dos, a fin de asegurar que los tubos no contengan fluido. Al mismo tiempo, cebe los tubos que conectan el vial de entrada del tampón a la válvula dos y el vial de entrada de la muestra a la válvula uno.

Haga que la bomba de jeringa aspire aproximadamente 15 microlitros de ambos viales para llenar completamente el tubo, conectándolos a las válvulas. Finalmente, cambie las válvulas uno y dos hacia el desecho para expulsar cualquier exceso de fluido o aire que haya entrado en la bobina de carga. A continuación, configure el programa para cargar la bobina de muestra primero aspirando 25 microlitros de aire a 50 microlitros por minuto.

Luego cargue 250 microlitros de muestra a 200 microlitros por minuto, seguido de 35 microlitros de tampón líder a 200 microlitros por minuto, y finalmente, otros 25 microlitros de aire a 50 microlitros por minuto. A continuación, configure las bombas de jeringa para infundir los tapones de fluido cargados a 100 microlitros por minuto y supervise las velocidades de flujo en las salidas de partículas pequeñas y grandes mediante sensores de flujo. La proporción de flujo adecuada puede determinarse como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Cuando los sensores de flujo detecten un pico en la velocidad de flujo que indique el paso del primer espacio de aire, cambie la válvula de salida correspondiente del vial de desecho al vial de recolección de muestra. Asegúrese de que el flujo sea estable mientras la muestra atraviesa el chip y se separa, observando las lecturas de los sensores de flujo. A medida que la muestra pasa a través del chip, las fracciones separadas se recogen en las válvulas de salida.

Al final del tapón de muestra, observe el sensor de flujo y detecte el segundo espacio de aire. En este momento, cambie las válvulas de salida nuevamente hacia el desecho. Después de dispensar el volumen completo, detenga la infusión de la bomba de jeringa y finalice la rutina de automatización.

Una vez finalizado el experimento de separación, desconecte los viales de recolección de muestras de partículas pequeñas y grandes y guárdelos adecuadamente para su posterior análisis. Coloque el tubo de recolección de muestras en viales vacíos para recoger las soluciones de limpieza en exceso que se eliminarán a través de los tubos. A continuación, inicie la rutina automatizada de limpieza del sistema según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Durante este proceso, el programa controlará las válvulas y la bomba de jeringa para cargar secuencialmente la bobina de retención con reactivos de limpieza y pasarlos a través del sistema. Una vez finalizado el proceso automatizado de limpieza y descontaminación, deseche las soluciones de lavado en exceso y los viales en los que se recolectaron, siguiendo los procedimientos adecuados para el manejo de residuos biológicos o químicos. Aquí se muestra un barrido de frecuencia representativo de un dispositivo piezo y microfluídico bien acoplado.

Cuando el acoplamiento entre el pizo y el dispositivo microfluídico es bueno, las partículas se enfocan estrechamente en la frecuencia resonante, lo que resulta en un pico claro en la intensidad fluorescente y en la migración hacia la posición de enfoque esperada. En contraste, cuando existe un acoplamiento deficiente, las partículas no se enfocan adecuadamente y el dispositivo no es adecuado cuando un enfoque de alta calidad o un flujo rápido son fundamentales para la aplicación requerida. Cada línea en este gráfico representa los resultados de separación utilizando distintos tamaños de partículas de poliestireno y voltajes de accionamiento del pizo.

En general, se requieren voltajes más altos para extraer partículas más pequeñas. Sin embargo, los voltajes en seco no pueden aumentarse indefinidamente debido a una mayor disipación de calor y a los efectos crecientes del flujo acústico. Para demostrar la utilidad de esta plataforma en la separación de partículas biológicas, se agregaron células humanas Raji, con un diámetro promedio de ocho a 10 micrómetros, junto con el virus del dengue, que tiene un diámetro aproximado de 50 nanómetros, y luego se separaron utilizando el dispositivo microfluídico acústico.

Una vez que se ensambla y programa un sistema como este, las separaciones pueden realizarse rutinariamente en aproximadamente cinco minutos. Se pueden procesar alrededor de tres muestras por hora con limpieza y descontaminación completas entre muestras. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como recuento celular, inmunotransferencia (western blotting) o secuenciación de nueva generación, para confirmar la pureza de la separación y elucidar su significado biológico.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo fabricar un dispositivo típico de separación microfluídico. Utilice conexiones de mundo al chip para interconectarse con el hardware y ejecutar un procedimiento de separación automatizado de manera precisa y robusta. No olvide que trabajar con materiales infecciosos puede ser extremadamente peligroso y debe realizarse únicamente por personal debidamente capacitado, utilizando el equipo y los procedimientos biológicos de seguridad prescritos institucionalmente.