Name: Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-16T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 51 s
Description: Aprende a fabricar y operar un chip microfluídico para el aislamiento de alta eficiencia de células individuales y su cultivo a largo plazo. Esta técnica minimiza el daño celular y permite estudiar la heterogeneidad en poblaciones celulares.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Este trabajo fue apoyado por una subvención de los Institutos Nacionales de Investigación en Salud (03-A1 BNMP11-014).

Nota: Los diseños photomask para nuestra fabricación de dispositivos de microfluidos se elaboraron mediante el uso de un software de diseño asistido por ordenador (CAD). Los diseños fueron luego utilizados para la fabricación de máscaras de cromo utilizando un servicio comercial. Los dispositivos de PDMS se hicieron usando técnicas de litografía blanda. 11 1. La fabricación de moldes por Maestro Litografía <ol><li> Antes de que el proceso de fotolitografía 12, utilizar las obleas de silicio de 4 pulgadas como sustrato y deshidratar las obleas en un horno convencional a 120 ° C durante 10 min. </li><li> Limpiar las obleas de silicio deshidratados mediante el uso de tratamiento con plasma de oxígeno a 100 vatios durante 30 segundos en un limpiador de plasma. </li><li> Precalentar dos placas de cocción a 65 ° C y 95 ° C, respectivamente, para el siguiente proceso de cocción. </li><li> Escudo 5 g de resina fotosensible negativo (PR) sobre las obleas de silicio limpiados por una recubridora de rotación; centrifugado a 1200 rpm (SU-8 50) durante 30 segundos para producir la capa de microcanal. </li><li> Coloque el PRrecubierto de la oblea en una placa caliente precalentado a 65 ° C durante 12 min y la transfiere a otra placa de cocción precalentado a 95 ° C durante 33 min (para 100 micras patrones de espesor) para llevar a cabo un proceso de horneado suave. </li><li> Después de la cocción, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el titular de un alineador de máscara semiautomático y alinearla a una fotomáscara transparencia 25.400 dpi de resolución. </li><li> Exponer el revestido PR oblea de silicio a la luz UV (365 nm) a una dosis de 500 mJ / cm 2 para crear el patrón de PR en la oblea de silicio. </li><li> Retire la oblea del alineador y colocarlo sobre una placa caliente para la post-cocción a 95 ° C durante 12 minutos. </li><li> Remojar las obleas en SU-8 desarrollador de soluciones (acetato de éter monometílico de propilenglicol, PGMEA) para lavar PR no reticulado para 12 min y secar suavemente con gas nitrógeno para exponer las marcas de alineación. </li><li> Una vez más, la capa 5 g de resina fotosensible negativo en las obleas por una recubridora de rotación; centrifugado a 700 rpm (SU-8 100) durante 30 seg y 1.200 rpm (SU-8 10) durante 30 seg para 300 y# 181; m patrón de espesor y 27 micras de espesor, respectivamente patrón para hacer la capa de microplaca. </li><li> Colocar la oblea PR recubierta por una placa caliente a 65 ° C durante 4 min y a 95 ° C durante 8 minutos (de 27 micras capa de captura-pozo profundo); y a 65 ° C durante 40 min ya 95 ° C durante 110 minutos (para 300 micras capa de cultivo de pozo profundo). </li><li> Después de enfriar, colocar la oblea de silicio recubierto de PR en el alineador de máscara equipada con luz UV. </li><li> Exponer la oblea de silicio recubierto de PR a la luz UV (365 nm) a una dosis de 250 mJ / cm 2 (para 27 micras patrón de espesor) y 700 mJ / cm 2 (para 300 micras patrón de espesor). </li><li> Hornear las obleas a 95 ° C durante 5 min (27 m patrón de espesor) y 30 min (300 m patrón de espesor), respectivamente. </li><li> Lavar el PR no reticulado por el PGMEA durante 6 minutos (27 micras patrón de espesor) y 25 min (300 m patrón de espesor), respectivamente, y luego secarlos con gas nitrógeno. </li><li> Medir la altura del modelo ofrece enla oblea con un perfilómetro láser de barrido mediante la colocación de la oblea en el xy etapa de un perfilómetro láser de barrido. <ol><li> Ajustar el plano focal para mostrar claramente el modelo ofrece en la oblea mediante el uso de la &quot;vista de la cámara&quot; modo de observación bajo un lente objetivo de 20X. </li><li> Cambiar el modo de observación a partir de &quot;vista de la cámara&quot; a &quot;vista de láser&quot;, y establecer las posiciones superior e inferior de las características. </li><li> Ajuste el modo de medición, área, calidad, y z-terreno de juego hasta transparente (arriba), 1 línea (1.024 x 1), de alta precisión y 0,5 micras, respectivamente, y luego presione la parte inferior de inicio para comenzar la medición. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de dispositivos PDMS para el aislamiento de células individual <ol><li> Antes de PDMS de colada, se silaniza los moldes maestros con triclorosilano para crear una superficie hidrófoba, que hace que sea más fácil de pelar las réplicas de PDMS de los moldes maestros. <ol><li> Colocar los moldes maestros y un bote que contiene ponderación200 l de triclorosilano en un desecador, y aplicar vacío (-85 kPa) durante 15 min. </li><li> Detener el vacío y luego dejar los moldes maestros en el desecador hasta silaniza los moldes maestros a temperatura ambiente durante al menos 1 hora. </li><li> Retirar los moldes maestros del desecador y coloque cada molde maestro en una placa de Petri de 10 cm. </li></ol></li><li> Mezcle una cantidad total de 17,6 g de polímero PDMS kit que contiene una base y un agente endurecedor en una proporción de 10: 1, y luego verter el PDMS en el molde maestro en la placa de Petri. </li><li> Coloque la placa de Petri en un desecador y aplicar vacío (-85 kPa) durante 1 hora para eliminar las burbujas de aire en el PDMS. </li><li> Retire la placa de Petri del desecador y colocarlo en un horno convencional a 65 ° C por 3 - 6 horas para curar el PDMS. </li><li> Retire las réplicas de PDMS curado de los moldes maestros y perforar dos agujeros como una entrada y una salida en los dos extremos del microcanal en la matriz PDMS réplica de captura-bien por un golpeador con diámetro interno de 0.75 mm para el canal fluídico (Figura 2A). </li><li> Use cinta para limpiar la superficie de las réplicas de PDMS y, a continuación, colocar las réplicas de PDMS en un limpiador de plasma para el tratamiento con plasma de oxígeno breve (100 vatios para 14 seg). </li><li> Retire las réplicas de PDMS de la máquina de plasma de oxígeno. </li><li> Alinear una parte superior (que contiene los pocillos de captura) y un fondo (PDMS que contienen los pocillos de cultivo) réplica de la mano bajo un microscopio estereoscópico y ponerlos en contacto. </li><li> Colocar las réplicas de PDMS alineados en un horno a 65 ° C durante 24 horas para conseguir una unión permanente entre las réplicas de PDMS para formar el dispositivo final. </li><li> Remojar el dispositivo de PDMS en una desionizada (DI) contenedor lleno -agua y colocar el recipiente en un desecador a vacío (-85 kPa) durante 15 minutos para eliminar el aire del microcanal del dispositivo de PDMS. </li><li> Coloque el dispositivo de PDMS lleno de agua DI en una campana de cultivo de tejidos y el uso de la luz ultravioleta (longitud de onda de la luz: 254 nm) para esterilizar del dispositivo de 30 minorte. </li><li> Reemplazar el agua DI en el dispositivo de PDMS con una albúmina de suero bovino 5% (BSA) en solución 1x PBS y se incuba a 37 ° C durante 30 min para evitar que las células se adhieran a la superficie de PDMS. Nota: El revestimiento BSA es crítica para mejorar la eficacia de la transferencia de células aisladas de captura-bien a la cultura pocillos. </li><li> Reemplazar la solución de BSA 5% en el dispositivo de PDMS con solución de 1x PBS esterilizado. </li></ol> 3. Preparación de la suspensión de células individual <ol><li> Cultura Neural vástago KT98 celular, y A549 de células de carcinoma humano y MDA-MB-435 que en placa de Petri en una incubadora de cultivo celular convencional (37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad) para preparar células para el experimento de células dispositivo PDMS . </li><li> Retirar y desechar el medio de cultivo gastado (medio basal DMEM suministrado con 10% de suero bovino fetal y 1% de antibióticos) de la placa de cultivo con las células cultivadas a 70 - 80% de confluencia. </li><li> Lave suavemente las células con PBS tres veces esterilizados. &lt;/ Li&gt; <li> Retirar y desechar el PBS y añadir 2 ml de una mezcla de enzimas proteolíticas, con recombinante, y las actividades de DNasa colagenolıticas (consulte la Lista de materiales para la información detallada). </li><li> Incubar la placa de cultivo a temperatura ambiente durante 5 minutos, y luego pulse en la placa de cultivo para facilitar el desprendimiento de células. </li><li> Añadir 4 ml de PBS esterilizada para dispersar las células, y luego transferir la suspensión celular a un tubo cónico de 15 ml. </li><li> Centrifugar el tubo a 300 xg durante 3 min y separar el sobrenadante. </li><li> Resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS esterilizados y contar el número de células vivas mediante el método de exclusión con azul de tripano estándar de 13. Nota: Este paso de resuspensión es crítica para la preparación de la suspensión de una sola célula así disociado-para mejorar la eficacia de aislamiento de una sola célula. </li></ol> 4. Aislamiento de celda única y Cultura clonal <ol><li> Carga de 50 l de suspensión de células a una concentración de 2.2 a 2.5 x10 <sup&gt; 6 células / ml en el microcanal del dispositivo de PDMS a través de orificio de salida del dispositivo con una pipeta de mano. Nota: La carga de la pipeta suspensión celular tiene que ser detenido y se mantiene en la primera posición de tope para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal. </li><li> Cargar otros 50 l de suspensión celular a través del orificio de entrada para llenar de manera uniforme por todo el microcanal con las células. </li><li> Sellar el orificio de salida con un tapón (a, diámetro de la línea de pesca corte nylon 1 mm 3 mm de largo) para evitar el flujo inducido por la presión hidrostática de las gotitas en orificios de entrada y de salida. Nota: Los tapones eran UV esterilizado dentro de una campana de cultivo de tejido antes de su uso. </li><li> Llenar una jeringa estéril de 1 ml con medio de cultivo, expulsar las burbujas de aire, y lo puso en una bomba de jeringa. </li><li> Conectar la jeringa cargada medio para el orificio de entrada del dispositivo de PDMS a través de un G aguja roma 23 y un tubo de poli-tetrafluoroethene (PTFE). </li><li> Retire el enchufe del orificio de salida y todosow un intervalo de tiempo de 2 minutos para permitir que las células se asiente sobre la captura de una sola célula de pozos por la fuerza gravitatoria. </li><li> Lavar las células no capturadas con 300 l de medio de cultivo a una velocidad de flujo de 600 l / min impulsado por la bomba de jeringa. </li><li> Espere 2 min para estabilizar el dispositivo, y sellar los orificios de entrada y de salida con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado. </li><li> Da la vuelta al dispositivo de mano para transferir las células únicas capturadas a los pocillos de cultivo. </li><li> Coloque el dispositivo de PDMS en una placa de cultivo tisular de 100 mm, y añadir 10 ml de PBS esterilizado alrededor del dispositivo para evitar la evaporación cultura medio del microcanal. </li><li> Mover la placa de cultivo a una incubadora convencional de cultivo de células (37 ° C, 5% de CO 2, y 95% de humedad) para el cultivo clonal de las células individuales. </li></ol> 5. Medio de cultivo Reposición <ol><li> Después de 1 d de la cultura, sustituir el medio de cultivo en el dispositivo de PDMS con un nuevo medio para mejorar la pr celularoliferation. </li><li> Colocar dos gotas de medio de cultivo en la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de las zonas orificios de entrada y de salida para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal en el desempeño de la siguiente etapa. </li><li> Haga dos agujeros de la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de los dos extremos de la microcanal como una entrada y una salida para el microcanal. Nota: No perforar a través enteras las dos capas del dispositivo de PDMS; En su lugar, simplemente perforar a través de la capa superior del PDMS. </li><li> Conectar una jeringa de plástico que contenía 1 ml de medio fresco a la entrada a través de una aguja de punta roma G 23 y el tubo de PTFE. </li><li> El flujo medio de 120 l fresco en el dispositivo durante 5 minutos para reemplazar el medio de edad. </li><li> Inserte dos tapones para sellar la entrada y salida agujeros, y devolver el dispositivo a la incubadora de cultivo celular. </li><li> Refrescar el medio de cultivo cada 2 d durante el período de la cultura mediante la eliminación de los tapones de sellado, seguido de la repetición de los apartados 5.4 a 5,5. </li></ol>

<ol><li>Meacham, C. E., Morrison, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+heterogeneity+and+cancer+cell+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tumour heterogeneity and cancer cell plasticity.</a> Nature. 501 (7467), 328-337 (2013).</li>
<li>Vermeulen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+cloning+of+colon+cancer+stem+cells+reveals+a+multi-lineage+differentiation+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22P+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Single-cell cloning of colon cancer stem cells reveals a multi-lineage differentiation capacity.</a> P Natl Acad Sci USA. 105 (36), 13427-13432 (2008).</li>
<li>Shapiro, H. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aShapiro%2C+HM+%22Practical+flow+cytometry%22">Practical flow cytometry</a>. , John Wiley & Sons. (2005).</li>
<li>Leong, K. G., Wang, B. E., Johnson, L., Gao, W. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+prostate+from+a+single+adult+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of a prostate from a single adult stem cell.</a> Nature. 456 (7223), 804-808 (2008).</li>
<li>Shapiro, E., Biezuner, T., Linnarsson, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing-based+technologies+will+revolutionize+whole-organism+science%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing-based technologies will revolutionize whole-organism science.</a> Nat Rev Genet. 14 (9), 618-630 (2013).</li>
<li>Rettig, J. R., Folch, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+single-cell+trapping+and+imaging+using+microwell+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Large-scale single-cell trapping and imaging using microwell arrays.</a> Anal. Chem. 77 (17), 5628-5634 (2005).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+fibrin+gels+promote+selection+and+growth+of+tumorigenic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Soft fibrin gels promote selection and growth of tumorigenic cells.</a> Nat Mater. 11 (8), 734-741 (2012).</li>
<li>Charnley, M., Textor, M., Khademhosseini, A., Lutolf, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+column%3A+microwell+arrays+for+mammalian+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Integr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Integration column: microwell arrays for mammalian cell culture.</a> Integr. Biol. 1 (11-12), 11-12 (2009).</li>
<li>Lindstrom, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-density+microwell+chip+for+culture+and+analysis+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">High-density microwell chip for culture and analysis of stem cells.</a> PloS one. 4 (9), e6997(2009).</li>
<li>Lin, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+microfluidic+dual-well+device+for+high-throughput+single-cell+capture+and+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">A microfluidic dual-well device for high-throughput single-cell capture and culture.</a> Lab Chip. 15 (14), 2928-2938 (2015).</li>
<li>Xia, Y. N., Whitesides, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soft+lithography%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Edit%22%5BJournal%5D)">Soft lithography.</a> Angew Chem Int Edit. 37 (5), 550-575 (1998).</li>
<li>Shin, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+assay+for+simultaneous+culture+of+multiple+cell+types+on+surfaces+or+within+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Microfluidic assay for simultaneous culture of multiple cell types on surfaces or within hydrogels.</a> Nat Protoc. 7 (7), 1247-1259 (2012).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypan+blue+exclusion+test+of+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Trypan blue exclusion test of cell viability.</a> Curr. Protoc. Immunol. Appendix 3 (Appendix 3B), (2001).</li>
<li>Lindstrom, S., Andersson-Svahn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturization+of+biological+assays+-+Overview+on+microwell+devices+for+single-cell+analyses%5BTitle%5D)+AND+%22Bba-Gen+Subjects%22%5BJournal%5D)">Miniaturization of biological assays - Overview on microwell devices for single-cell analyses.</a> Bba-Gen Subjects. 1810 (3), 308-316 (2011).</li>
<li>Lecault, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+analysis+of+single+hematopoietic+stem+cell+proliferation+in+microfluidic+cell+culture+arrays%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-throughput analysis of single hematopoietic stem cell proliferation in microfluidic cell culture arrays.</a> Nat Methods. 8 (7), 581-593 (2011).</li>
<li>Park, J. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+trapping+in+larger+microwells+capable+of+supporting+cell+spreading+and+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Microfluid+Nanofluid%22%5BJournal%5D)">Single cell trapping in larger microwells capable of supporting cell spreading and proliferation.</a> Microfluid Nanofluid. 8 (2), 263-268 (2010).</li>
<li>Tirino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+in+solid+tumors%3A+an+overview+and+new+approaches+for+their+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization.</a> FASEB J. 27 (1), 13-24 (2013).</li>
<li>Chen, P. C., Huang, Y. Y., Juang, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MEMS+microwell+and+microcolumn+arrays%3A+novel+methods+for+high-throughput+cell-based+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">MEMS microwell and microcolumn arrays: novel methods for high-throughput cell-based assays.</a> Lab Chip. 11 (21), 3619-3625 (2011).</li>
<li>Liang, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+Screening+Using+a+Library+of+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Cardiomyocytes+Reveals+Disease-Specific+Patterns+of+Cardiotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Drug Screening Using a Library of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes Reveals Disease-Specific Patterns of Cardiotoxicity.</a> Circulation. 127 (16), 1677-1691 (2013).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Sistemas de dispositivos basados ​​en micropocillos 6,14 se han utilizado para la manipulación de una sola célula y análisis, como única célula a gran escala atrapando 6 y la proliferación de células madre hematopoyéticas única 15. Aunque el tamaño así, el número y forma se puede ajustar para aplicaciones específicas, la eficacia de aislamiento de una sola célula se ve comprometida siempre cuando se aumenta el tamaño del pozo. 9,15 Para superar est...

Actualmente la colocación de las células individuales de forma individual en un espacio de cultivo se logra comúnmente mediante el uso de la dilución limitante o células activadas por fluorescencia (FACS). Para muchos laboratorios, dilución limitante es un método conveniente, ya que sólo requiere una pipeta y del tejido placas de cultivo, que son fácilmente disponibles. En este caso, una suspensión de células se diluye en serie a una densidad celular apropiada, y después se colocó en pocillos de cultivo mediante el uso de una pipeta manual. Estas células individuales compartimentados se utilizan entonces para el análisis de células, tales como la heterogeneidad genética de detección 1 y 2 Formación de Colonias. Sin embargo, este método es de bajo rendimiento y de trabajo intensivo, sin utilizar un brazo robótico para la asistencia, ya que la naturaleza distribución de Poisson del método de dilución limitante restringe eventos de una sola célula a una probabilidad máxima de 37% 3. máquinas de FACS con un brazo robótico integrado que pueden superar la limitación de la distribución de Poisson con precisión por placing una sola célula en un pocillo de cultivo a la vez 4. Sin embargo, el alto esfuerzo de cizalla mecánica (por lo tanto, disminuye la viabilidad celular) 5 y la compra de la máquina y los costes operativos han limitado su uso en muchos laboratorios. Para superar las limitaciones anteriores, los dispositivos a microescala se han desarrollado para altamente eficiente cargar células individuales en micropocillos 6. Sin embargo, los micropocillos no proporcionan un espacio adecuado para las células cargadas proliferen, debido a la necesidad de hacer que el tamaño de cada pocillo, próxima a la de una sola célula para maximizar la probabilidad de carga de una sola célula. Como se requieren ensayos de cultivo en muchas aplicaciones basadas en células (por ejemplo, ensayo clonogénico 7), micropocillos de mayor tamaño (90 a 650 micras de diámetro o de longitud lateral) también se han utilizado para permitir cultivos celulares prolongados. Sin embargo, como el método de dilución limitante, también poseen bajas eficiencias individuales de carga de células, que van desde 10 -. 30% 8, 9 Anteriormente, hemos desarrollado una plataforma de microfluidos de alto rendimiento para aislar células individuales en micropocillos individuales y demostrar su aplicación en ensayo clonogénico de las células aisladas. 10 El dispositivo se hizo con poli-dimetilsiloxano (PDMS), y comprende dos conjuntos de matrices de micropocillos con diferentes tamaños de micropocillos, que pueden mejorar en gran medida la eficiencia en la carga de una sola célula en un micropocillo cuyo tamaño es significativamente más grande que la célula. Cabe destacar que este concepto de &quot;doble bien&quot; permite que el tamaño de la zona de cultivo para ajustarse de manera flexible sin afectar a la eficiencia de la captura de una sola célula, por lo que es fácil de ajustar el diseño del dispositivo para adaptarse a diferentes tipos de células y aplicaciones. Este método de alta eficiencia debería ser útil para experimentos de cultivo celular a largo plazo para los estudios de heterogeneidad celular y el establecimiento línea celular monoclonal.

<table><tbody><tr><td>Software AutoCAD</td><td>Autodesk AutoCAD</td><td>LT 2011</td><td>N.º de pieza 057C1-74A111-1001</td></tr><tr><td>Oblea de silicio&nbsp;</td><td>Corporación Eltech</td><td>SPE0039</td><td></td></tr><tr><td>Horno convencional</td><td>YEONG-SHIN empresa</td><td>OVP45</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Nordson</td><td>AP-300</td><td>Sistema de tratamiento de plasma de sobremesa</td></tr><tr><td>SU-8 50 fotorresistencia negativa MicroChem</td><td></td><td>Y131269</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 100 fotorresistencia negativa</td><td>MicroChem</td><td>Y131273</td><td></td></tr><tr><td>recubridor</td> giratorio <td>Synrex Co., Ltd.</td><td>SC-HMI 2" ~ 6"</td><td></td></tr> <tr><td>Placa calefactora</td><td>YOTEC empresa</td><td>YS-300S</td><td></td></tr><tr><td>Alineador Msak</td><td>Deya Optronic CO.</td><td>A1K-5-MDA</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 desarrollador</td><td>Grand Chemical Companies</td><td>GP5002-000000-72GC</td><td>Acetato de éter de metílico monometílico de propilenglicol</td></tr><tr><td>Perfilómetro láser de barrido</td><td>KEYENCE</td><td>VK-X 100</td><td></td></tr><tr><td>Triclorosilano</td><td>Gelest, Inc</td><td>SIT8174.0</td><td>Tridecafluoro-1,1,2,2-tetrahidrooctilo. Peligroso. Corrosivo para las vías respiratorias, reacciona violentamente con el agua.</td></tr><tr><td>Desecador</td><td>Bel-Art Products</td><td>F42020-0000</td><td>Desecador de vacío con ahorro de espacio 190&nbsp; mm base blanca</td></tr><tr><td>Kit de polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow corning</td><td>Sylgard 184</td><td></td></tr><tr><td>Harris Punzonadora Uni-Core</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>15072</td> con cinta removible <td>de 0,75 mm de diámetro interior</td></tr><tr><td></td><td>3M Company</td><td>Scotch Cinta removible 811</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico</td><td>Leica Microsystems</td><td>Leica E24</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Bersing Technology</td><td>ALB001.500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM medio basal</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino</td><td>Thermo Hyclone</td><td>SH30071.03HI</td><td></td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>Biowest</td><td>L0014-100</td><td>Glutamina-Penicilina-Estreptomicina</td></tr><tr><td>Mezcla de enzimas recombinantes</td><td>Tecnología celular</td><td>innovadora AM-105</td><td>Accumax</td></tr><tr><td>DiIC12(3) Tinte de membrana celular</td><td>BD Biosciences</td><td>354218</td><td>Utilizado como rastreador de células</td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Aparato 703007</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plástico jeringa (1 ml)</td><td>BD Biosciences</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>agujas romas de calibre 23</td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Tubo de</td> politetrafluoroetileno (PTFE) TD21 <td></td></tr><tr><td></td><td>Ever Sharp Technology, Inc.</td><td>Diámetro interior de TFT-23T</td><td>, 0,51 &nbsp; milímetro; diámetro exterior, 0,82 pulgadas; milímetro</td></tr></tbody></table>

una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y cultura

A Microfluidic Platform for High-throughput Single-cell Isolation and Culture

Estudiar la heterogeneidad de las células individuales es crucial para muchas cuestiones biológicas, pero es técnicamente difícil. Por lo tanto, existe la necesidad de un método simple, pero de alto rendimiento, para realizar experimentos de cultivo de una sola célula. Aquí, informamos sobre una estrategia basada en chips microfluídicos para el aislamiento de una sola célula de alta eficiencia (~77%) y demostramos su capacidad para realizar análisis de heterogeneidad celular y cultivo de una sola célula a largo plazo (hasta 7 d) mediante ensayos clonogénicos. Estas aplicaciones se demostraron con células madre neurales de ratón KT98 y células cancerosas humanas A549 y MDA-MB-435. La alta eficiencia de aislamiento de una sola célula y la capacidad de cultivo a largo plazo se logran mediante el uso de diferentes tamaños de micropocillos en la parte superior e inferior del canal microfluídico. La matriz de micropocillos pequeña está diseñada para aislar con precisión células individuales, y la matriz de micropocillos grande se utiliza para el cultivo clonal de células individuales en el chip microfluídico. Esta plataforma microfluídica constituye un enfoque atractivo para aplicaciones de cultivo unicelular, debido a su flexibilidad de espacios de cultivo celular ajustables para diferentes estrategias de cultivo, sin disminuir la eficiencia del aislamiento.

La plataforma de microfluidos para el aislamiento y cultivo de células individuales comprende un microcanal (200 micras de altura) con dos conjuntos de matrices de micropocillos (Figura 2A). Los dos conjuntos de matrices de micropocillos se denominan como de captura de pocillos (25 m de diámetro y 27 m de profundidad) y la cultura pocillos (285 micras de diámetro y 300 m de profundidad) para el aislamiento de células individuales y la cultura, respectivamente, y cada cap...

Aquí, presentamos un protocolo para aislar y cultivar células individuales con una plataforma microfluídica, que utiliza un nuevo concepto de diseño de micropozos para permitir el aislamiento de células individuales de alta eficiencia y el cultivo clonal a largo plazo.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Studying the heterogeneity of single cells is crucial for many biological questions, but is technically difficult. Thus, there is a need for a simple, yet ...

El objetivo general de este protocolo es demostrar la fabricación y operación de un chip microfluídico, que permite el aislamiento y cultivo de células individuales con alta eficiencia. Este método proporciona una herramienta útil para cualquier área que se beneficie del aislamiento y cultivo de células individuales. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente eficiente para cargar células individuales en matrices de micropozos de gran tamaño.Además, para operar el dispositivo se utilizan únicamente un flujo suave y la fuerza gravitacional, lo que minimiza el daño celular. La aplicación de esta técnica se orienta hacia el diagnóstico final de enfermedades humanas como el cáncer, en las que la heterogeneidad celular afecta la respuesta de la célula. Tuvimos la idea de desarrollar este método cuando estábamos estableciendo una línea celular en micropozos, porque el método de dilución límite era muy lento e ineficiente. Ahora, este método puede proporcionar información sobre el análisis de células individuales.También puede aplicarse a otras aplicaciones, como el establecimiento y el momento de la observación del recorrido y comportamiento de células individuales. Para comenzar, fabrique moldes maestros silanizados tanto para la capa de aislamiento de células individuales como para la capa de cultivo en micropozos, utilizando litografía fotográfica estándar según se describe en el protocolo de texto adjunto. Para cada molde maestro, combine 16 gramos de base de PDMS con 1.6 gramos de un agente de curado en un vaso desechable y mezcle hasta que estén homogéneos.Luego, coloque los moldes maestros en placas de Petri de 150 milímetros y vierta el PDMS encima de los moldes. Coloque las placas de Petri en un desecador y aplique vacío durante una hora para eliminar las burbujas de aire del PDMS. Después de una hora, retire las placas del desecador y colóquelas en un horno convencional a 65 grados Celsius durante tres a seis horas para curar el PDMS.A continuación, retire los recipientes del horno y déjelos enfriar hasta la temperatura ambiente. Una vez fríos, desprenda la matriz de pozos de captura de PDMS curado y la matriz de cultivo de micropozos de los moldes maestros y corte los dispositivos usando una cuchilla de afeitar. A continuación, utilice un punzón de 0,75 milímetros para crear un orificio en cada extremo del microcanal en la capa de la matriz de pozos de captura.Utilice cinta para limpiar lo que será la superficie interna del dispositivo y luego coloque las capas individuales con las superficies internas hacia arriba en un limpiador de plasma para un breve tratamiento con plasma de oxígeno. Una vez finalizado, retire las capas de PDMS del limpiador de plasma y use un microscopio estéreo para alinear y conectar las capas superior e inferior del dispositivo. Coloque el dispositivo alineado en un horno a 65 grados Celsius durante 24 horas para crear un enlace permanente entre las capas de PDMS.A continuación, coloque el dispositivo de PDMS unido en agua desionizada y coloque el recipiente en un desecador bajo vacío durante 15 minutos, con el fin de eliminar el aire del microcanal del dispositivo. Con todo el aire ahora eliminado del dispositivo, coloque el dispositivo de PDMS en una cabina de cultivo celular y use luz UV para esterilizar la superficie del dispositivo durante 30 minutos. A continuación, reemplace el agua desionizada en el dispositivo con albúmina sérica bovina al 5 % en PBS e incube el dispositivo a 37 grados Celsius durante 30 minutos.Esto bloqueará la superficie y mejorará la eficiencia de transferencia de las células aisladas desde los pozos de captura a los pozos de cultivo. Después de 30 minutos, reemplace la solución de bloqueo en el dispositivo con PBS estéril. Prepare una suspensión de células individuales con 2,5 millones de células por mililitro y cargue una pipeta con 50 microlitros de la suspensión.Luego, transfiera las células al dispositivo a través del orificio de salida del dispositivo. Cargue otros 50 microlitros de la suspensión celular y transfiéralos al dispositivo a través del orificio de entrada para llenar uniformemente todo el microcanal con células. Una vez cargado, utilice un tapón estéril fabricado con hilo de pesca de nailon de un milímetro de diámetro para sellar el orificio de salida del dispositivo.Luego, llene una jeringa estéril de un mililitro con medio de cultivo, expulse cualquier burbuja de aire residual y colóquela en la bomba de jeringa. Conecte una aguja roma de calibre 23 a la jeringa y utilice un tubo de politetrafluoroetileno para conectar la aguja a la entrada del dispositivo. Después de conectar el tubo, retire el tapón del orificio de salida y espere dos minutos mientras las células sedimentan en los pozos de captura individual por fuerza gravitacional.A continuación, ajuste la bomba de jeringa a 600 microlitros por minuto. Retire el tapón de salida y lave las células no capturadas durante 30 segundos. Espere dos minutos para que la presión se estabilice.Luego, retire el tubo de la entrada del dispositivo y selle ambos orificios, la entrada y la salida, con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado. Ahora, invierta el dispositivo manualmente para transferir las células individuales capturadas a los micropozos de cultivo en el otro lado del dispositivo. A continuación, coloque el dispositivo en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros, agregue 10 mililitros de PBS esterilizado alrededor del dispositivo y coloque la placa en un incubador.Para reemplazar el medio de cultivo, primero coloque dos gotas de medio de cultivo sobre el dispositivo de PDMS cerca de la entrada y la salida para evitar introducir burbujas de aire en el microcanal. Luego, utilice un punzón de biopsia de 0,75 milímetros para perforar dos orificios desde la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de los extremos del microcanal. Asegúrese de perforar únicamente la capa superior del dispositivo.A continuación, llene una jeringa de plástico de un mililitro que contenga medio fresco precalentado y utilice una aguja roma de calibre 23 y tubo de PTFE para conectarla al puerto de entrada recién creado. Pase lentamente aproximadamente 120 microlitros de medio fresco al dispositivo durante cinco minutos para reemplazar el medio antiguo. Al finalizar, selle los puertos de entrada y salida utilizando dos tapones y regrese el dispositivo al incubador de cultivo celular.El número de células que terminan en los pozos de captura varía entre aproximadamente el 68 % y el 85 %, según el tipo de célula. Además, la mayoría de los pozos de captura contienen una sola célula, para los tres tipos de células. Tras la transferencia de las células KT98 capturadas a los pozos de cultivo, aproximadamente el 77 % de los pozos tenían una sola célula, el 16 % no tenían células, el 6 % tenían dos células, y menos del 1 % de los pozos tenían tres o más células.A lo largo de siete días, las células individuales aisladas exhibieron patrones de crecimiento heterogéneos. Mientras que algunas células se multiplicaron, otras no lo hicieron. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 20 minutos si se lleva a cabo correctamente.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta plataforma de cultivo endocrino de aislamiento de células individuales de alto rendimiento para aumentar la productividad de sus experimentos con células individuales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar que las burbujas de aire ingresen al microcanal y prevenir que las células se agreguen entre sí con el paso del tiempo.

a-microfluidic-platform-for-high-throughput-single-cell-isolation

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo se introduce la fabricación, configuración y operación básica de un biorreactor de picolitros microfluídico (PLBR) para el análisis de microorganismos procariotas de una sola célula. Se analizaron microorganismos de relevancia industrial como prueba de principio, lo que permitió conocer la tasa de crecimiento, la morfología y la heterogeneidad fenotípica durante ciertos períodos de tiempo, lo que difícilmente es posible con los métodos convencionales.

Biorreactor de picolitro microfluídico para análisis microbiano de una sola célula: fabricación, configuración del sistema y operación

Hemos desarrollado un cultivo de células automatizado y la plataforma de interrogación para experimentos de estimulación de células micro-escala. La plataforma ofrece un control sencillo, versátil y precisa en el cultivo y estimular las pequeñas poblaciones de células, y la recuperación de lisados ​​de análisis moleculares. La plataforma se adapta bien a los estudios que utilizan las células preciosos y / o reactivos.

Una plataforma automatizada versátil para Micro escala experimentos de estimulación celular

En este artículo se presenta un chip de microfluidos para el análisis de células individuales. Permite la cuantificación de las proteínas intracelulares, enzimas, cofactores, y segundos mensajeros por medio de ensayos fluorescentes o inmunoensayos.

Un chip de microfluidos para el análisis químico versátil de células individuales

Aquí, presentamos un protocolo para cocultivar células primarias, modelos de tejido y biopsias en un chip microfluídico multi-órgano durante un máximo de 28 días. Las células endoteliales microvasculares dérmicas humanas, los agregados hepáticos y las biopsias de piel se combinaron con éxito en una circulación de medios común.

El chip de varios órganos - Una plataforma de microfluidos para el largo plazo co-cultivo de múltiples tejidos

Este protocolo describe una arquitectura de sistema para realizar separaciones automatizadas de partículas de pequeño volumen (0,15-1,5 ml) utilizando un dispositivo microfluídico, y analiza métodos para optimizar el rendimiento y el funcionamiento del dispositivo acustofluídico.

Una plataforma de microfluidos para el procesamiento de precisión de pequeño volumen de la muestra y su uso para Tamaño partículas biológicas separadas con un Microdevice acústica

Sola célula secuencia revela heterogeneidad genotípica en los sistemas biológicos, pero las tecnologías actuales carecen de la capacidad necesaria para el perfilado profundo de la función y composición de la comunidad. Aquí, describimos un flujo de trabajo de microfluidos para la secuencia &gt; 50.000 genomas unicelulares de diversas poblaciones de la célula.

Una plataforma de ultra rendimiento microfluidos para la secuenciación del genoma de unicelular

Este informe describe un método microfluídico basado en chips para establecer un experimento de cultivo de una sola célula en el que se puede lograr un emparejamiento de alta eficiencia y un análisis microscópico de varias células individuales.

Establecimiento de coculturas basadas en células únicas de manera determinista con un chip microfluídico

Presentamos un sistema microfluídico para estudios de alto rendimiento en maquinaria de vida compleja, que consta de 1500 unidades de cultivo, una gama de bombas peristálticas mejoradas y un módulo de mezcla in situ. El chip microfluídico permite el análisis de las condiciones microambientales altamente complejas y dinámicas in vivo.

Generación de condiciones ambientales dinámicas utilizando un dispositivo microfluídico de alto rendimiento

El chip microfluídico clínico es una importante técnica de análisis biomédico que simplifica el preprocesamiento clínico de las muestras de sangre de los pacientes y tiñe inmunofluorescentemente las células tumorales circulantes (CTC) in situ en el chip, lo que permite la rápida detección e identificación de una sola CTC.

Plataforma de chip microfluídico clínico para el aislamiento de células tumorales circulantes versátiles

Este protocolo describe cómo utilizar el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula (célula MISS) para realizar el aislamiento, el cultivo y la recolección monoclonales microbianos. La célula MISS logra un flujo de trabajo integrado basado en la tecnología microfluídica de gotas, que ofrece una excelente monodispersidad de gotas, un cultivo paralelo alto y una detección de biomasa de alto rendimiento.

Cultivo y selección monoclonales microbianos automatizados y de alto rendimiento mediante el sistema ómico de cultivo de gotas de microlitros de una sola célula

Las células tumorales circulantes (CTC) son fundamentales para el estudio de la progresión y la metástasis del cáncer. Este artículo presenta un protocolo integrado de alto rendimiento para el enriquecimiento de CTC y la secuenciación de CTC única, mejorando la eficiencia de captura y la pureza de CTC al tiempo que reduce la contaminación y los costos de secuenciación, avanzando así en la investigación oncológica de precisión y las aplicaciones clínicas.

Tecnología de clasificación de células tumorales circulantes de alto rendimiento basada en microfluidos y secuenciación de células individuales

Aprende a fabricar y operar un chip microfluídico para el aislamiento de alta eficiencia de células individuales y su cultivo a largo plazo. Esta técnica minimiza el daño celular y permite estudiar la heterogeneidad en poblaciones celulares.

Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

Explorar más videos