Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

El objetivo general de este protocolo es demostrar la fabricación y operación de un chip microfluídico, que permite el aislamiento y cultivo de células individuales con alta eficiencia. Este método proporciona una herramienta útil para cualquier área que se beneficie del aislamiento y cultivo de células individuales. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente eficiente para cargar células individuales en matrices de micropozos de gran tamaño.

Además, para operar el dispositivo se utilizan únicamente un flujo suave y la fuerza gravitacional, lo que minimiza el daño celular. La aplicación de esta técnica se orienta hacia el diagnóstico final de enfermedades humanas como el cáncer, en las que la heterogeneidad celular afecta la respuesta de la célula. Tuvimos la idea de desarrollar este método cuando estábamos estableciendo una línea celular en micropozos, porque el método de dilución límite era muy lento e ineficiente. Ahora, este método puede proporcionar información sobre el análisis de células individuales.

También puede aplicarse a otras aplicaciones, como el establecimiento y el momento de la observación del recorrido y comportamiento de células individuales. Para comenzar, fabrique moldes maestros silanizados tanto para la capa de aislamiento de células individuales como para la capa de cultivo en micropozos, utilizando litografía fotográfica estándar según se describe en el protocolo de texto adjunto. Para cada molde maestro, combine 16 gramos de base de PDMS con 1.6 gramos de un agente de curado en un vaso desechable y mezcle hasta que estén homogéneos.

Luego, coloque los moldes maestros en placas de Petri de 150 milímetros y vierta el PDMS encima de los moldes. Coloque las placas de Petri en un desecador y aplique vacío durante una hora para eliminar las burbujas de aire del PDMS. Después de una hora, retire las placas del desecador y colóquelas en un horno convencional a 65 grados Celsius durante tres a seis horas para curar el PDMS.

A continuación, retire los recipientes del horno y déjelos enfriar hasta la temperatura ambiente. Una vez fríos, desprenda la matriz de pozos de captura de PDMS curado y la matriz de cultivo de micropozos de los moldes maestros y corte los dispositivos usando una cuchilla de afeitar. A continuación, utilice un punzón de 0,75 milímetros para crear un orificio en cada extremo del microcanal en la capa de la matriz de pozos de captura.

Utilice cinta para limpiar lo que será la superficie interna del dispositivo y luego coloque las capas individuales con las superficies internas hacia arriba en un limpiador de plasma para un breve tratamiento con plasma de oxígeno. Una vez finalizado, retire las capas de PDMS del limpiador de plasma y use un microscopio estéreo para alinear y conectar las capas superior e inferior del dispositivo. Coloque el dispositivo alineado en un horno a 65 grados Celsius durante 24 horas para crear un enlace permanente entre las capas de PDMS.

A continuación, coloque el dispositivo de PDMS unido en agua desionizada y coloque el recipiente en un desecador bajo vacío durante 15 minutos, con el fin de eliminar el aire del microcanal del dispositivo. Con todo el aire ahora eliminado del dispositivo, coloque el dispositivo de PDMS en una cabina de cultivo celular y use luz UV para esterilizar la superficie del dispositivo durante 30 minutos. A continuación, reemplace el agua desionizada en el dispositivo con albúmina sérica bovina al 5 % en PBS e incube el dispositivo a 37 grados Celsius durante 30 minutos.

Esto bloqueará la superficie y mejorará la eficiencia de transferencia de las células aisladas desde los pozos de captura a los pozos de cultivo. Después de 30 minutos, reemplace la solución de bloqueo en el dispositivo con PBS estéril. Prepare una suspensión de células individuales con 2,5 millones de células por mililitro y cargue una pipeta con 50 microlitros de la suspensión.

Luego, transfiera las células al dispositivo a través del orificio de salida del dispositivo. Cargue otros 50 microlitros de la suspensión celular y transfiéralos al dispositivo a través del orificio de entrada para llenar uniformemente todo el microcanal con células. Una vez cargado, utilice un tapón estéril fabricado con hilo de pesca de nailon de un milímetro de diámetro para sellar el orificio de salida del dispositivo.

Luego, llene una jeringa estéril de un mililitro con medio de cultivo, expulse cualquier burbuja de aire residual y colóquela en la bomba de jeringa. Conecte una aguja roma de calibre 23 a la jeringa y utilice un tubo de politetrafluoroetileno para conectar la aguja a la entrada del dispositivo. Después de conectar el tubo, retire el tapón del orificio de salida y espere dos minutos mientras las células sedimentan en los pozos de captura individual por fuerza gravitacional.

A continuación, ajuste la bomba de jeringa a 600 microlitros por minuto. Retire el tapón de salida y lave las células no capturadas durante 30 segundos. Espere dos minutos para que la presión se estabilice.

Luego, retire el tubo de la entrada del dispositivo y selle ambos orificios, la entrada y la salida, con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado. Ahora, invierta el dispositivo manualmente para transferir las células individuales capturadas a los micropozos de cultivo en el otro lado del dispositivo. A continuación, coloque el dispositivo en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros, agregue 10 mililitros de PBS esterilizado alrededor del dispositivo y coloque la placa en un incubador.

Para reemplazar el medio de cultivo, primero coloque dos gotas de medio de cultivo sobre el dispositivo de PDMS cerca de la entrada y la salida para evitar introducir burbujas de aire en el microcanal. Luego, utilice un punzón de biopsia de 0,75 milímetros para perforar dos orificios desde la parte superior del dispositivo de PDMS cerca de los extremos del microcanal. Asegúrese de perforar únicamente la capa superior del dispositivo.

A continuación, llene una jeringa de plástico de un mililitro que contenga medio fresco precalentado y utilice una aguja roma de calibre 23 y tubo de PTFE para conectarla al puerto de entrada recién creado. Pase lentamente aproximadamente 120 microlitros de medio fresco al dispositivo durante cinco minutos para reemplazar el medio antiguo. Al finalizar, selle los puertos de entrada y salida utilizando dos tapones y regrese el dispositivo al incubador de cultivo celular.

El número de células que terminan en los pozos de captura varía entre aproximadamente el 68 % y el 85 %, según el tipo de célula. Además, la mayoría de los pozos de captura contienen una sola célula, para los tres tipos de células. Tras la transferencia de las células KT98 capturadas a los pozos de cultivo, aproximadamente el 77 % de los pozos tenían una sola célula, el 16 % no tenían células, el 6 % tenían dos células, y menos del 1 % de los pozos tenían tres o más células.

A lo largo de siete días, las células individuales aisladas exhibieron patrones de crecimiento heterogéneos. Mientras que algunas células se multiplicaron, otras no lo hicieron. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente 20 minutos si se lleva a cabo correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar esta plataforma de cultivo endocrino de aislamiento de células individuales de alto rendimiento para aumentar la productividad de sus experimentos con células individuales. Al intentar este procedimiento, es importante recordar evitar que las burbujas de aire ingresen al microcanal y prevenir que las células se agreguen entre sí con el paso del tiempo.