Una plataforma microfluídica para el aislamiento de gran procesamiento de celda única y Cultura

El objetivo general de este protocolo es demostrar la fabricación y el funcionamiento de un chip microfluídico, que permite el aislamiento y el cultivo de una sola célula de alta eficiencia. Este método proporciona una herramienta útil para cualquier área que se beneficie del aislamiento y cultivo de una sola célula. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente eficiente en la carga de celdas individuales en grandes matrices de micropocillos.

Además, solo se utiliza un flujo suave y la fuerza gravitacional para operar el dispositivo, lo que minimiza el daño de la celda. La implicación de esta técnica se dirige hacia el diagnóstico final de enfermedades humanas como el cáncer, en las que la heterogeneidad celular afecta la respuesta de la célula, por lo que se nos ocurrió la idea de desarrollar este método cuando estábamos estableciendo la línea celular de micropocillos, porque el método de dilución límite consumía mucho tiempo y era ineficiente. Ahora, este método puede proporcionar información sobre el análisis de células individuales.

También se puede aplicar a otras aplicaciones, como el establecimiento y la temporalidad de la observación del curso y el comportamiento de las células individuales. Para comenzar, fabrique moldes maestros silanizados tanto para la capa de aislamiento de una sola célula como para la capa de cultivo de micropocillos, utilizando fotolitografía estándar como se describe en el protocolo de texto adjunto. Para cada molde maestro, combine 16 gramos de base de PDMS con 1,6 gramos de un agente de curado en un vaso desechable y revuelva las mezclas hasta que se combinen.

Luego, coloque los moldes maestros en placas de Petri de 150 milímetros y vierta el PDMS encima de los moldes. Coloque las placas de Petri en un desecador y aplique una aspiradora durante una hora para eliminar las burbujas de aire del PDMS. Después de una hora, retire los platos del desecador y colóquelos en un horno convencional a 65 grados centígrados durante tres a seis horas para curar el PDMS.

Luego, retira los platos del horno y déjalos enfriar a temperatura ambiente. Una vez frío, pele la matriz de captura de pocillos PDMS curada y la matriz de cultivo de micropocillos de los moldes maestros y corte los dispositivos con una cuchilla de afeitar. A continuación, utilice un punzón de 0,75 milímetros para crear un agujero en cada extremo del microcanal en la capa de la matriz de pocillos de captura.

Use cinta adhesiva para limpiar lo que se convertirá en la superficie interna del dispositivo y luego coloque las capas individuales con las superficies internas hacia arriba en un limpiador de plasma para un breve tratamiento con plasma de oxígeno. Cuando termine, retire las capas de PDMS del limpiador de plasma y use un microscopio estereoscópico para alinear y conectar las capas superior e inferior del dispositivo. Coloque el dispositivo alineado en un horno a 65 grados centígrados durante 24 horas para crear una unión permanente entre las capas de PDMS.

A continuación, coloque el dispositivo PDMS adherido en agua desionizada y coloque el recipiente en un desecador al vacío durante 15 minutos, para eliminar el aire del microcanal del dispositivo. Una vez eliminado todo el aire del dispositivo, coloque el dispositivo PDMS en una cubierta de cultivo de tejidos y utilice luz ultravioleta para esterilizar la superficie del dispositivo durante 30 minutos. A continuación, sustituya el agua desionizada del dispositivo por un 5% de albúmina sérica bovina en PBS e incube el dispositivo a 37 grados centígrados durante 30 minutos.

Esto bloqueará la superficie y mejorará la eficiencia de transferencia de las células aisladas de los pozos de captura a los pozos de cultivo. Después de 30 minutos, reemplace la solución de bloqueo en el dispositivo con PBS estéril. Prepare una suspensión de una sola celda con 2,5 millones de celdas por mililitro y cargue una pipeta con 50 microlitros de la suspensión.

Luego, transfiera las celdas al dispositivo a través del orificio de salida del dispositivo. Cargue otros 50 microlitros de la suspensión de celdas y transfiéralos al dispositivo a través del orificio de entrada para llenar uniformemente todo el microcanal con celdas. Una vez cargado, use un tapón estéril hecho de hilo de pescar de nailon de un milímetro de diámetro para sellar el orificio de salida del dispositivo.

Luego, llene una jeringa estéril de un mililitro con medio de cultivo, expulse las burbujas de aire residuales y colóquela en la bomba de jeringa. Conecte una aguja roma de calibre 23 a la jeringa y use un tubo de politetrafluoroetileno para conectar la aguja a la entrada del dispositivo. Después de conectar el tubo, retire el tapón del orificio de salida y espere dos minutos mientras las celdas se asientan en los pozos de captura de celdas individuales por fuerza gravitatoria.

A continuación, ajuste la bomba de jeringa a 600 microlitros por minuto. Retire el enchufe de salida y lave las células no capturadas durante 30 segundos. Espere dos minutos para que la presión se estabilice.

A continuación, retire el tubo de la entrada del dispositivo y selle los orificios de entrada y salida con tapones para formar un sistema de cultivo cerrado. Ahora voltee el dispositivo con la mano para transferir las células individuales capturadas a los micropocillos de cultivo en el otro lado del dispositivo. Luego, coloque el dispositivo en una placa de cultivo de tejidos de 100 milímetros, agregue 10 mililitros de PBS esterilizado alrededor del dispositivo y coloque la placa en una incubadora.

Para reemplazar el medio de cultivo, primero coloque dos gotas de medio de cultivo en la parte superior del dispositivo PDMS cerca de la entrada y la salida para evitar la introducción de burbujas de aire en el microcanal. Luego, use un perforador de biopsia de 0.75 milímetros para perforar dos orificios desde la parte superior del dispositivo PDMS cerca de los extremos del microcanal. Asegúrese de perforar solo la capa superior del dispositivo.

A continuación, llene una jeringa de plástico de un mililitro que contenga medio fresco precalentado y use una aguja roma de calibre 23 y un tubo de PTFE para conectarla al puerto de entrada recién creado. Fluya lentamente aproximadamente 120 microlitros de medio fresco en el dispositivo durante cinco minutos para reemplazar el medio anterior. Cuando termine, selle los puertos de entrada y salida con dos enchufes y devuelva el dispositivo a la incubadora de cultivos celulares.

El número de celdas que terminan en los pozos de captura oscila entre el 68% y el 85%, dependiendo del tipo de celda. Además, la mayoría de los pozos de captura contienen una sola celda, para los tres tipos de celdas. Después de la transferencia de las células KT98 capturadas a los pocillos de cultivo, alrededor del 77% de los pocillos tenían una sola célula, el 16% no tenía células, el 6% tenía dos células y menos del 1% de los pocillos tenían tres o más células.

En el transcurso de siete días, las células individuales aisladas exhibieron patrones de crecimiento heterogéneos. Mientras que algunas de las células se multiplicaron, otras no. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 20 minutos si se realiza correctamente.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar esta plataforma de cultivo endocrino de aislamiento de una sola célula de alto rendimiento para aumentar la productividad de sus experimentos de una sola célula. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar que las burbujas de aire ingresen al microcanal y evitar que las células se agreguen a medida que pasa el tiempo.