Name: Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 54 s
Description: Aprende a utilizar la plataforma microfluidic CODES para la detección multiplexada de partículas mediante sensores electrónicos de pulso resistivo. Esta tecnología elimina instrumentos externos y facilita el diagnóstico en entornos con recursos limitados.

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Este trabajo fue apoyado por el Premio No. ECCS 1610995. Los autores desean agradecer al Instituto de Electrónica y Nanotecnología y al personal del Instituto Parker H. Petit de Bioingeniería y Biociencia por su apoyo en el uso de instalaciones compartidas. Los autores también desean agradecer a Chia-Heng Chu por su ayuda en la preparación del manuscrito.

1. Diseño de electrodos de codificación Nota: La Figura 1a muestra la estructura 3-D de los electrodos micropatterned. <ol><li> Diseñar un conjunto de cuatro códigos Gold de 7 bits para la codificación de los canales de microfluidos 23. <ol><li> La construcción de dos turnos de retroalimentación registros lineales (LFSRs), cada uno representando un polinomio primitivo. </li><li> Usa los LFSR para generar un par preferido de m -sequences de 7 bits. </li><li> Cíclicamente cambiar el par preferido de m -sequences y añadirlos en mod 2 para generar cuatro códigos Gold distintos. </li></ol></li><li> Diseñar la disposición de los electrodos de codificación (Figura 1b). <ol><li> Coloque tres terminales de los electrodos, lo que representa, y los electrodos de referencia positivos, negativos en tres esquinas. </li><li> Ruta electrodo positivo y negativo traza en lados opuestos de cada canal de microfluidos. </li><li> Extender los electrodos positivos y negativos en lacanales de microfluidos como los dedos de electrodo, siguiendo el código de Oro asignada de forma única (Figura 1c). </li><li> Coloque el electrodo de referencia entre los dedos de los electrodos positivos y negativos. </li><li> Coloque trazas electrodo positivo y negativo lejos de los dedos de electrodo de referencia más exteriores con el fin de minimizar la conducción eléctrica fuera de la región de codificación. </li></ol></li></ol> 2. La microfabricación de electrodos de superficie Nota: La Figura 2b muestra el proceso de fabricación de electrodos de superficie. <ol><li> Limpiar una oblea de vidrio de borosilicato de 4 pulgadas en una solución Piranha (ácido sulfúrico al 98%: 30% de peróxido de hidrógeno = 5: 1) a 120 ° C durante 20 min para eliminar todos los contaminantes orgánicos. A continuación, coloque la oblea en una placa caliente a 200 ° C durante 20 minutos para eliminar el agua residual. </li><li> La transferencia de la oblea para un control de giro. Dispensar 2 fotorresistente negativo ml sobre la oblea y hacer girar la oblea a una velocidad de 3, 000 rpm durante 40 s para recubrir uniformemente la oblea con una capa fotorresistente 1,5-m. </li><li> Colocar la oblea en una placa caliente a 150 ° C y hornear el fotoprotector hecho girar durante 1 min. </li><li> Exponer la resina fotosensible a 365 nm de luz UV (225 mJ / cm2) a través de una máscara de cromo utilizando un alineador de máscara. </li><li> Colocar la oblea en una placa caliente a 100 ° C y hornear el fotoprotector expuesto durante 1 min. </li><li> Desarrollar la fotoprotección mediante la inmersión de la oblea en un revelador fotorresistente (RD6) durante 15 s. rociar suavemente con agua desionizada (DI) y lavar la oblea. Seca por soplado de nitrógeno comprimido. </li><li> Coloque la oblea con fotorresistente diseñado en un evaporador de metal de haz de electrones, y depositar una película de cromo 20 nm de espesor, seguida por una película de oro de 80 nm de espesor sobre la oblea a una presión de base de 3 × 10 -6 Torr con una velocidad de depósito 1 a / s. </li><li> Sumergir la oblea recubierta de metal en acetona en un conjunto de baño de ultrasonidos a una frecuencia de 40 kHz con 100% de amplitud durante 30 minutos a temperamento habitaciónATURALEZA para grabar la fotoprotección subyacente y completar el proceso de despegue. </li><li> Se pica la oblea en trozos más pequeños usando una sierra de corte en dados convencional. </li></ol> 3. La fabricación de la SU-8 Molde para los canales de microfluidos Nota: La figura 2a muestra el proceso de fabricación del molde para canales de microfluidos. <ol><li> Limpiar y hornear una oblea de silicio de 4 pulgadas utilizando el mismo procedimiento descrito en 2.1. </li><li> La transferencia de la oblea para un control de giro. Verter 4 ml fotorresistente sobre la oblea. Escudo de la oblea con fotoprotector. <ol><li> Hacer girar la oblea a 500 rpm durante 15 s. </li><li> Hacer girar la oblea a 1.000 rpm durante 15 s. </li><li> Girar la oblea a 3000 rpm durante 60 s para obtener una capa fotorresistente gruesa 15-m uniformemente recubierto. </li></ol></li><li> Coloque la cara de la oblea en una sala limpia limpie empapado en acetona y eliminar el fotoprotector residual de la parte trasera y los bordes de la oblea. </li><li> La transferencia de la oblea en una pl calientecomió para la cocción suave. En primer lugar, hornear la oblea a 65 ° C durante 1 min. A continuación, mueva rápidamente la oblea a una placa caliente 95 ° C y hornear durante 2 min. </li><li> Exponer la resina fotosensible a 365 nm de luz UV (180 mJ / cm2) a través de una máscara de cromo mediante el uso de un alineador de máscara. </li><li> Hornear el después de la exposición de la oblea a 65 ° C durante 1 min y después a 95 ° C durante 2 min. </li><li> Sumergir la oblea en el revelador y agitar suavemente el recipiente durante 3 min. A continuación, enjuagar la oblea con el alcohol isopropanol (IPA) y se seca mediante soplado de nitrógeno comprimido. Si aparece un residuo de color blanco sobre la oblea, sumergirlo en el revelador nuevo y desarrollar de tiempo más largo y seco. </li><li> Hornear la oblea en una placa caliente a 200 ° C durante 30 minutos para que se seque por completo. </li><li> Medir el espesor de la resina fotosensible modelado usando un perfilómetro en diferentes lugares a través de la oblea para asegurar la uniformidad. </li><li> Silanizar la oblea del molde mediante la utilización de la técnica de deposición de vapor. Añadir 200 l de trichlorosilane en una placa de Petri y el lugar en un desecador de vacío junto con la oblea de molde SU-8 durante 8 h. </li></ol> 4. Montaje de los códigos de dispositivo de microfluidos <ol><li> Colocar la oblea de silicio de 4 pulgadas con el molde en una placa de Petri de diámetro 150 mm, y fijarlo con cinta adhesiva de sus bordes. </li><li> Mezclar el polidimetilsiloxano (PDMS) pre-polímero y reticulante en una relación de 10: 1, y verter 50 g de la mezcla en la placa de Petri. Coloque la placa de Petri en un desecador de vacío para desgasificar la mezcla durante 1 h, y luego curar en un horno a 65 ° C durante al menos 4 h (Figura 2a). </li><li> Cortar la capa de PDMS curado utilizando un bisturí y despegarlo la oblea molde usando unas pinzas. El tamaño del dispositivo de prueba de principio es de aproximadamente 20 mm x 7 mm. Entonces perforar agujeros con un diámetro de 1,5 mm a través de los PDMS para la entrada y salida del canal microfluídico usando un golpeador biopsia. </li><li> Limpiar el lado de la pieza modelada PDMS colocando it en una cinta adhesiva de sala limpia. </li><li> Limpiar el sustrato de vidrio con electrodos de superficie, aclarándolo con acetona, IPA, agua desionizada y secar con nitrógeno comprimido. </li><li> Activar las superficies de PDMS y el sustrato de vidrio en plasma de oxígeno durante 30 s con el lado de micromecanizado de cada parte hacia arriba en un generador de plasma RF fijado en 100 mW. </li><li> Alinear el canal de microfluidos PDMS con electrodos de superficie sobre el sustrato de vidrio utilizando un microscopio óptico y a continuación, llevar las dos superficies de plasma activado en contacto físico. </li><li> Hornear el dispositivo sobre una placa caliente a 70 ° C durante 5 minutos, con el lado del vidrio frente a la placa caliente. </li><li> Conectar los adaptadores de contacto de los electrodos con cables por soldadura. </li></ol> 5. Preparación de la muestra simulada Biológica <ol><li> Cultivar las células de cáncer de ovario humano HeyA8 en RPMI 1640 suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina-estreptomicina en 5% de CO2 a 37 ° Chasta que alcanzan 80% de confluencia. </li><li> Aspirar los medios de comunicación del matraz de cultivo usando una pipeta de vidrio. Dispensar y luego solución salina de fosfato tamponada aspirado 1x (PBS) para lavar las células. </li><li> Se incuban las células en 2 ml de 0,05% (w / v) de solución de tripsina durante 2 min a 37 ° C la suspensión de células adherentes. A continuación, añadir 4 ml de los medios de cultivo para neutralizar la tripsina. </li><li> Se centrifuga la suspensión celular a 100 × g durante 5 min para sedimentar las células en un tubo de ensayo. Entonces, Aspirar el sobrenadante por completo. </li><li> Vuelva a suspender las células en 1-2 ml de PBS 1x pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo para grupos de células se disocian mecánicamente. </li><li> Dibuje una pequeña cantidad de la suspensión celular en una pipeta y contar el número de células utilizando un hemocitómetro. </li><li> Se diluye la suspensión celular con PBS para preparar una muestra con una concentración final de células de 10 5 -10 6 células / ml. </li></ol> 6. Ejecución de los códigos de dispositivo de microfluidos Nota: Fifigura 3 muestra el montaje experimental. <ol><li> Coloque el dispositivo de microfluidos CÓDIGOS en el escenario de un microscopio óptico. </li><li> Aplicar una onda sinusoidal 400 kHz al electrodo de referencia en el chip usando un generador de función electrónica. </li><li> Conectar los electrodos de detección positiva y negativa a dos amplificadores trans-impedancia independientes para convertir señales de corriente de cada una de las señales de tensión. </li><li> Restar la señal de tensión de electrodo de detección positiva de la señal de voltaje de electrodo de detección negativa usando un amplificador de voltaje diferencial con el fin de obtener una señal bipolar. </li><li> Utilice una cámara de alta velocidad de operación de grabación óptica del dispositivo para fines de validación y caracterización. </li><li> Conduce la suspensión de células a través del dispositivo de microfluidos CÓDIGOS a un caudal constante (50-1,000 l / h) usando una bomba de jeringa. </li><li> Medir la señal de modulación de impedancia usando un amplificador lock-in. <ol><li> Conectar la señal de CA referencia a que el árbitrorencia de entrada del amplificador lock-in. Conectar la señal diferencial bipolar al amplificador lock-in como señal de entrada. </li><li> Obtener la amplitud RMS de la señal diferencial a partir de la salida del amplificador lock-in. </li></ol></li><li> Muestrear la señal de salida del amplificador lock-in a 1 MHz tasa en un ordenador a través de una tarjeta de adquisición de datos para su posterior análisis. </li></ol> 7. Tratamiento de señales de los sensores <ol><li> Transferir datos eléctricas registradas en MATLAB para el post-procesamiento y decodificación. </li><li> Se filtra la señal grabada en el dominio digital usando un filtro de Butterworth (MATLAB función incorporada) para eliminar el ruido de alta frecuencia (&gt; 2,5 kHz). </li><li> Generar una biblioteca de código de la plantilla de las señales del sensor. <ol><li> Identificar señales de código no se solapan representativos correspondientes a cada sensor en el dispositivo y extraer estos bloques de señal del conjunto de datos de forma de onda como vectores separados. </li><li> Normalizar cada plantilla de forma de onda de código vectorpor su poder. Utilice el MATLAB función incorporada (bandpower) para medir la potencia de la señal. </li><li> Utilice la función MATLAB (volver a muestrear) para expandir la biblioteca de la plantilla mediante la creación de versiones de digitalmente señales de código normalizadas con diferentes duraciones para acomodar las variaciones en la velocidad de flujo de células sobre los electrodos. </li></ol></li><li> Identificar los bloques de señal que se corresponden con sensor de actividad (umbral: SNR&gt; 12 dB) en la forma de onda filtrada. Forma de onda con SNR bajo el umbral sería tratado como ruido. </li><li> Decodificar bloques individuales de la actividad del sensor en la señal grabada mediante el uso de un algoritmo iterativo basándose en la cancelación sucesiva de interferencias, una técnica comúnmente empleada en las redes de comunicación CDMA de múltiples usuarios 24, 25. <ol><li> Calcular la correlación cruzada de la señal de cada bloque con todas las plantillas de la biblioteca usando deslizamiento producto escalar. </li><li> Identificar la plantilla que produce la largEste valor máximo de autocorrelación para determinar la señal de código de sensor individuo dominante. Registre el tiempo y la amplitud del pico de autocorrelación. </li><li> Construir una señal de código de sensor estimación escalando la plantilla de código identificado a partir de la amplitud de pico de autocorrelación medida y la información de tiempo (determinado en la etapa 7.5.2). </li><li> Restar la señal de código del sensor estimadas a partir de los datos originales. </li><li> Iterar el proceso de 7.5.1, hasta que la señal residual no se parece a ninguna señal en la biblioteca de plantillas, matemáticamente definido como el coeficiente de correlación es menor que 0,5. </li></ol></li><li> Refinar las estimaciones iniciales de las señales del sensor paso 7.5 utilizando un proceso de optimización. <ol><li> Reconstruir la señal mediante la adición de señales de los sensores individuales estimados a partir de cada iteración. </li><li> Barrer la amplitud, la duración y la sincronización de las señales de los sensores individuales en torno a las estimaciones originales para producir el mejor ajuste con la señal eléctrica registradabasado en la aproximación por mínimos cuadrados 26. </li></ol></li><li> Convertir amplitudes de las señales del sensor estimadas en el tamaño celular calibrando las señales eléctricas contra las imágenes ópticas. </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Sensores resistivos múltiples previamente se han incorporado en los chips de microfluidos 28, 29, 30, 31, 32. En estos sistemas, sensores de pulso de resistencia fueron, o bien no multiplexadas 28, 29, 30, 31 o que requieren sensore...

La detección exacta y el análisis de las partículas biológicas tales como células, bacterias o virus en suspensión en el líquido es de gran interés para una serie de aplicaciones 1, 2, 3. Bien adaptado en tamaño, los dispositivos de microfluidos ofrecen ventajas únicas para este propósito, tales como alta sensibilidad, manipulación de la muestra suave y bien controlada microambiente 4, 5, 6, 7. Además, los dispositivos de microfluidos pueden ser diseñados para emplear una combinación de dinámica de fluidos y campos de fuerza para fraccionar pasivamente una población heterogénea de partículas biológicas en base a varias propiedades 8, 9, 10, 11, 12. En los dispositivoss, la distribución de partículas resultante se puede utilizar como lectura, pero la información espacial es típicamente accesible sólo a través de microscopía, lo que limita la utilidad práctica del dispositivo de microfluidos atándolo a una infraestructura de laboratorio. Por lo tanto, un sensor integrado que puede reportar fácilmente mapeo espacio-temporal partículas &#39;, ya que son manipulados en un dispositivo de microfluidos, potencialmente puede permitir a bajo costo, dispositivos integrados lab-on-a-chip que son particularmente atractivo para el análisis de muestras en móvil , entornos con recursos limitados. Electrodos de película delgada han sido utilizados como sensores integrados en dispositivos de microfluidos para diversas aplicaciones 13, 14. Pulso resistiva Sensing (RPS) es particularmente atractivo para la detección integrada de pequeñas partículas en los canales de microfluidos, ya que ofrece un mecanismo de detección de alto rendimiento robusto, sensible, y directamente a partir de mediciones eléctricas 15. En RPS, la modulación de impedancia entre un par de electrodos, inmerso en un electrolito, se utiliza como un medio para detectar una partícula. Cuando la partícula pasa a través de una abertura, de tamaño del orden de la partícula, el número y la amplitud de impulsos transitorios de la corriente eléctrica se utilizan para contar y partículas de tamaño, respectivamente. Por otra parte, la geometría de sensor puede ser diseñado con una resolución fotolitográfica para dar forma a las formas de onda de pulso de resistencia con el fin de aumentar la sensibilidad 16, 17, 18, 19 o para estimar la posición vertical de las partículas en los canales de microfluidos 20. Recientemente hemos introducido una tecnología de detección de pulsos multiplexado resistivo escalable y sencilla llamada microfluídica Coded Ortogonal detección por detección eléctrica (CÓDIGOS microfluidos) 21. CÓDIGOS microfluidos se basa en unared interconectada de sensores de pulso resistivos, cada uno compuesto de una serie de electrodos micromaquinados para modular la conducción de una manera única, distinguibles, a fin de permitir la multiplexación. Hemos diseñado específicamente cada sensor para producir señales eléctricas ortogonales similares a los códigos digitales utilizados en división de código de acceso múltiple 22 (CDMA) las redes de telecomunicaciones, de modo que la señal de sensor de pulso resistiva individuo se puede recuperar de forma única a partir de una sola forma de onda de salida, incluso si las señales de diferentes sensores interfieren. De esta forma, nuestra tecnología comprime la información espacial en 2D de partículas en una señal eléctrica 1D, lo que permite el seguimiento de las partículas en diferentes ubicaciones en un chip microfluídico, manteniendo tanto del dispositivo y del sistema de nivel de complejidad a un mínimo. En este trabajo, presentamos un protocolo detallado para métodos experimentales y computacionales necesarios para utilizar la tecnología de microfluidos CÓDIGOS, así como rresultados epresentante de su uso en el análisis de muestras biológicas simuladas. Utilizando los resultados de un prototipo de dispositivo con cuatro sensores multiplexados como un ejemplo para explicar la técnica, proporcionamos protocolos sobre (1) el proceso de microfabricación para crear dispositivos de microfluidos con la tecnología CÓDIGOS microfluidos, (2) la descripción de la configuración experimental que incluye el hardware electrónico, óptico, y fluídico, (3) el algoritmo de computadora para la decodificación de señales de interferencia de diferentes sensores, y (4) los resultados de la detección y el análisis de las células de cáncer en los canales de microfluidos. Creemos que utilizando el protocolo detallado se describe aquí, otros investigadores pueden aplicar nuestra tecnología para su investigación.

<table><tbody><tr><td>98% Ácido sulfúrico &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH3074-3.8LP</td><td></td></tr><tr><td>30% peróxido de hidrógeno&nbsp; &nbsp;</td><td>BDH Chemicals</td><td>BDH7690-3</td><td></td></tr><tr><td>Triclorosilano</td><td>Aldrich Química</td><td>235725-100G</td><td></td></tr><tr><td>NR9-1500PY Fotorresistencia negativa</td><td>Furuttex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Resist Revelador RD6</td><td>Furuttex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetona</td><td>BDH Químicos</td><td>BDH1101-4LP</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2015 Fotorresistencia negativa</td><td>Microchem</td><td>SU8-2015</td><td></td></tr><tr><td>SU-8 Revelador</td><td>Microchem Y010200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polidimetilsiloxano (PDMS)</td><td>Dow Corning</td><td>3097358-1004</td><td>Sylgard 184 Kit de elastómero de silicona</td></tr><tr><td>Alcohol isopropílico</td><td>BDH Productos químicos</td><td>BDH1133-4LP</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Corning Cellgro</td><td>10-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Seradigm</td><td>1500-050</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Amresco</td><td>K952-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning Cellgro</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>PHD 22/2000 Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2001</td><td></td></tr><tr><td>HF2LI Amplificador de bloqueo</td><td>Zurich Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>HF2TA Amplificador de corriente</td><td>Zurich Instrument</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eclipse Microscopio Ti-U</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS-Fi2 Cámara a color de alta definición&nbsp;</td><td>Nikon Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>v7.3 Cámara de alta velocidad</td><td>Phantom</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PCIe-6361 Placa de adquisición de datos&nbsp;</td><td>National Instruments</td><td>781050-01</td><td></td></tr><tr><td>BNC-2120 Bloque de conector blindado</td><td>National Instruments</td><td>777960-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de tratamiento de plasma PX-250</td><td>Nordson MARCH&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

procesamiento de muestras biológicas de microfluidos típicamente implica manipulaciones diferenciales de partículas en suspensión en virtud de diversos campos de fuerza con el fin de fraccionar espacialmente la muestra en base a una propiedad biológica de interés. Para la distribución espacial resultante para ser utilizado como la lectura del ensayo, los dispositivos de microfluidos a menudo se sometieron a análisis microscópico que requiere instrumentación compleja con mayor coste y la reducción de la portabilidad. Para hacer frente a esta limitación, se ha desarrollado una tecnología de detección electrónico integrado para la detección multiplexada de partículas en diferentes ubicaciones en un chip microfluídico. Nuestra tecnología, conocidos como códigos de microfluidos, combina pulso resistiva de detección con Acceso Múltiple por División de Código para comprimir la información espacial 2D en una señal eléctrica 1D. En este trabajo, presentamos una demostración práctica de la tecnología microfluídica CÓDIGOS para detectar y células cancerosas cultivadas tamaño distribuida a través de múltiples canales de microfluidos. Comovalidado por la microscopía de alta velocidad, nuestra tecnología puede analizar con precisión las poblaciones de células densas todo electrónicamente sin la necesidad de un instrumento externo. Como tal, los códigos de microfluidos pueden permitir potencialmente bajo coste dispositivos integrados lab-on-a-chip que están bien adaptados para la prueba de punto de atención de las muestras biológicas.

Un dispositivo de microfluidos CÓDIGOS que consta de cuatro sensores distribuidos sobre cuatro canales de microfluidos se muestra en la Figura 1b. En este sistema, la sección transversal de cada canal microfluídico fue diseñado para ser cerca del tamaño de una célula de modo que (1) múltiples células no pueden pasar por encima de los electrodos en paralelo y (2) las células se mantienen cerca de los electrodos de aumentar la sensibilidad . Cada sensor está diseñado para ...

Demostramos una plataforma de microfluidos con una red de electrodo de superficie integrado que combina detección de pulso resistivo (RPS) con división de código de acceso múltiple (CDMA), para multiplexar la detección y el tamaño de las partículas en múltiples canales de microfluidos.

Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una plataforma microfluídica que combina la detección por pulsos resistivos con acceso múltiple por división de código para multiplexar la detección y medición de partículas en múltiples canales microfluídicos. Esta tecnología, denominada microfluidic CODES, puede ayudar a lograr dispositivos de chip de laboratorio completamente integrados y verdaderamente portátiles, adecuados para pruebas en el punto de atención de muestras biológicas en entornos con recursos limitados. La principal ventaja de esta técnica es que puede rastrear electrónicamente la manipulación espacial y temporal de partículas en el chip microfluídico, eliminando la necesidad de un instrumento externo como un microscopio.Nuestra tecnología es compatible con la litografía suave y puede integrarse fácilmente en un dispositivo microfotónico en el que las partículas se fraccionan para proporcionar una lectura electrónica directa similar a la del contador de Coulter. Para comenzar la construcción del dispositivo microfluídico, genere un conjunto de cuatro códigos de oro de siete bits. Luego, diseñe cuatro configuraciones de electrodos únicas basadas en los códigos de oro utilizando un software de diseño asistido por computadora, o CAD, como AutoCAD.Finalmente, haga fabricar la máscara fotográfica con el diseño de disposición de electrodos por un proveedor de máscaras fotográficas. A continuación, sumerja una oblea de vidrio borosilicatado de cuatro pulgadas en una solución piraña en una proporción de cinco a uno a 120 grados Celsius durante 20 minutos. Después de la limpieza, caliente la oblea en una placa calefactora a 200 grados Celsius durante 20 minutos para evaporar el agua residual.Coloque la oblea limpia y seca en un cubridor por centrifugado. Aplique 2 mililitros de solución de fotolito negativo sobre la oblea y realice el cubrimiento por centrifugado a 3000 revoluciones por minuto durante 40 segundos. Seque la oblea recubierta por centrifugado en una placa calefactora a 150 grados Celsius durante un minuto.Cubra la oblea con una máscara de cromo en el patrón deseado de electrodos. Exponga la superficie de la resistencia fotosensible enmascarada a luz ultravioleta de 365 nanómetros para obtener 225 milijulios por centímetro cuadrado. A continuación, hornee la resistencia fotosensible expuesta en una placa calefactora a 100 grados Celsius durante un minuto.Sumerja la oblea en el revelador de fotoresistente durante 15 segundos, luego lave la oblea con el patrón en un chorro suave de agua desionizada y seque la oblea bajo una corriente de gas nitrógeno. A continuación, coloque la oblea con el patrón en un evaporador de metales por haz de electrones. Deposite una capa de cromo de 20 nanómetros de espesor y una capa de oro de 80 nanómetros de espesor sobre la oblea a una velocidad de un angstrom por segundo.Luego, ataque el fotoresistente subyacente calentando ultrasónicamente la oblea recubierta de metal en acetona durante 30 minutos a 40 kilohercios y amplitud del 100 %. Utilice una sierra de corte para dividir la oblea en piezas más pequeñas según sea necesario. Para comenzar a fabricar el molde del canal microfluídico, limpie y seque una oblea de silicio de cuatro pulgadas de la misma manera que la oblea de borosilicato descrita anteriormente.Coloque la oblea de silicio en un centrifugador de recubrimiento y aplique cuatro mililitros de solución de fotolitografía negativa. Realice el recubrimiento por centrifugado de la oblea a 500 rpm durante 15 segundos, luego a 1.000 rpm durante 15 segundos, y finalmente a 3.000 rpm durante 60 segundos. Coloque la oblea con la cara hacia arriba sobre una toallita para sala limpia empapada en acetona para eliminar el fotolitógrafo residual de la parte posterior y los bordes de la oblea.Coloque la oblea en el horno a 65 grados Celsius durante un minuto y luego a 95 grados Celsius durante dos minutos. Coloque un patrón de máscara de cromo para los canales microfluídicos sobre la oblea seca. Exponga el fotoresistente a luz ultravioleta de 365 nanómetros a 180 milijulios por centímetro cuadrado y luego hornee nuevamente la oblea a 65 y 95 grados Celsius durante uno y dos minutos, respectivamente.Coloque la oblea patroneada en un recipiente con revelador de fotoresistencia y agite suavemente el recipiente durante tres minutos. Enjuague la oblea revelada en isopropanol y seque la oblea bajo una corriente de gas nitrógeno. Hornee la oblea a 200 grados Celsius durante 30 minutos, luego utilice un perfilómetro para verificar que la fotoresistencia del patrón tenga un espesor uniforme a través de toda la oblea.Coloque la oblea en un desecador al vacío junto con 200 microlitros de triclorosilano en una placa de Petri descubierta. Deje reposar la oblea en el desecador con el triclorosilano durante ocho horas para silanizar la superficie de la oblea. Para comenzar a armar el dispositivo, utilice cinta de uso general para sala limpia para fijar el molde de oblea de silicio en una placa de Petri de 150 milímetros de diámetro.Añada 50 gramos de una mezcla de diez a uno de prepolímero de polidimetilsiloxano a la placa de Petri y desgasifique la mezcla en un desecador al vacío durante una hora. Cure la mezcla desgasificada a 65 grados Celsius durante al menos cuatro horas. Utilice un escalpelo para recortar la capa de PDMS curada y luego desprenda la capa curada del molde con pinzas.Corte el PDMS en trozos pequeños. Perfore los orificios del canal microfluídico de entrada y salida con un punzón de biopsia. Coloque la capa de PDMS con la cara del patrón hacia abajo sobre cinta adhesiva transparente para limpiar la superficie micromecanizada.Lave el sustrato de vidrio con electrodo previamente preparado con acetona, isopropanol y agua desionizada. Seque el sustrato bajo una corriente de gas nitrógeno. Coloque la capa de PDMS y el sustrato en un generador de plasma de radiofrecuencia ajustado a 100 milivatios, con los lados del micromecanismo orientados hacia arriba.Activee las superficies de la micromáquina en plasma de oxígeno durante 30 segundos. A continuación, utilice un microscopio óptico para alinear la capa de PDMS con los electrodos de la superficie. Una vez alineadas, permita que las superficies entren en contacto físico para sellar la capa de PDMS sobre el sustrato de vidrio.Es fundamental que el patrón del electrodo de recubrimiento sobre el sustrato de vidrio esté correctamente alineado con los canales microfluídicos de PDMS. Una vez alineado adecuadamente, la interacción de la partícula con el electrodo de superficie generará una forma de onda de código deseada para la multiplexación. Incube el dispositivo ensamblado a 70 grados Celsius durante cinco minutos, con el lado de vidrio hacia abajo.Finalmente, suelde los cables a las almohadillas de contacto del electrodo para terminar el ensamblaje del dispositivo. Para comenzar el experimento, coloque el dispositivo microfluídico sobre la platina de un microscopio óptico. Conecte el electrodo de referencia del dispositivo al puerto de salida de señal de un amplificador de detección síncrona y aplique una onda senoidal de 400 kilohercios.Conecte los electrodos sensores positivo y negativo a dos amplificadores transimpedancia independientes. Conecte ambos amplificadores transimpedancia a las entradas de voltaje diferencial del amplificador de bloqueo, de modo que la señal del sensor positivo se reste de la señal del sensor negativo. Conecte la salida del demodulador del amplificador de bloqueo a una unidad de adquisición de datos.En el software de adquisición de datos, establezca una frecuencia de muestreo para la salida del amplificador de bloqueo de 1 megahercio. Configure una cámara de alta velocidad para grabar ópticamente el funcionamiento del dispositivo tal como se observa bajo el microscopio. Introduzca una suspensión celular preparada en una jeringa.Sujete la jeringa de muestra en una bomba de jeringa y conecte la jeringa al canal de entrada. Dirija el canal de salida hacia un recipiente de desecho. Utilice la bomba de jeringa para impulsar la suspensión celular a través del dispositivo a un caudal constante mientras registra la señal de modulación de impedancia.Tras la finalización del experimento, procese los datos eléctricos con software de análisis. Compare la señal eléctrica procesada con las imágenes de la cámara de alta velocidad para crear una curva de calibración para el tamaño celular. Se hizo fluir una suspensión celular a través de un dispositivo sensor microfluídico con cuatro patrones de electrodos únicos derivados de códigos de sensores ortogonales.Se registraron las cuatro señales de los sensores a partir de una única salida eléctrica. El sensor individual asociado a cada señal registrada se identificó mediante la correlación de las señales de los sensores registradas con todos los códigos posibles, lo que generó picos de autocorrelación claramente distinguibles. Las formas de onda producidas por las señales interferentes provenientes de la detección simultánea de células en los cuatro canales se resolvieron mediante un algoritmo iterativo.Se correlacionó una forma de onda grabada con todos los códigos posibles y se identificó el pico de autocorrelación más grande. Se reconstruyó la señal correspondiente del sensor individual y se restó de la forma de onda de entrada. La señal residual se pasó a la siguiente iteración como entrada y el proceso continuó hasta que la señal residual no produjo picos de autocorrelación.Las señales estimadas se refinaron basándose en un algoritmo de optimización que busca el mejor ajuste entre las formas de onda reconstruidas y las registradas originalmente, utilizando la aproximación de mínimos cuadrados. La ubicación celular, el tamaño y el tiempo para atravesar el sensor se determinaron entonces a partir del número de canal, la amplitud, la duración y el momento relativo de las señales estimadas del sensor. El procedimiento se validó mediante la comparación de las señales eléctricas con mediciones ópticas provenientes de la cámara de alta velocidad.Una vez dominada, esta técnica es muy fácil de implementar, porque es muy sencilla desde una perspectiva de hardware. No tiene componentes activos en el chip. Es directamente compatible con la litografía suave y el procesamiento de señales se basa en un algoritmo computacional sencillo.Tras seguir este protocolo, podrá fabricar chips microfluídicos con sensores eléctricos multiplexados basados en códigos y descifrar las señales eléctricas para mediciones bioanalíticas. Esta tecnología de detección electrónica versátil y escalable puede integrarse fácilmente en diversos dispositivos microfluídicos para realizar ensayos cuantitativos mediante el seguimiento espaciotemporal de partículas mientras se procesan en el chip. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, fabricar e implementar la tecnología microfluídica CODES.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

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