Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una plataforma microfluídica que combina la detección por pulsos resistivos con acceso múltiple por división de código para multiplexar la detección y medición de partículas en múltiples canales microfluídicos. Esta tecnología, denominada microfluidic CODES, puede ayudar a lograr dispositivos de chip de laboratorio completamente integrados y verdaderamente portátiles, adecuados para pruebas en el punto de atención de muestras biológicas en entornos con recursos limitados. La principal ventaja de esta técnica es que puede rastrear electrónicamente la manipulación espacial y temporal de partículas en el chip microfluídico, eliminando la necesidad de un instrumento externo como un microscopio.

Nuestra tecnología es compatible con la litografía suave y puede integrarse fácilmente en un dispositivo microfotónico en el que las partículas se fraccionan para proporcionar una lectura electrónica directa similar a la del contador de Coulter. Para comenzar la construcción del dispositivo microfluídico, genere un conjunto de cuatro códigos de oro de siete bits. Luego, diseñe cuatro configuraciones de electrodos únicas basadas en los códigos de oro utilizando un software de diseño asistido por computadora, o CAD, como AutoCAD.

Finalmente, haga fabricar la máscara fotográfica con el diseño de disposición de electrodos por un proveedor de máscaras fotográficas. A continuación, sumerja una oblea de vidrio borosilicatado de cuatro pulgadas en una solución piraña en una proporción de cinco a uno a 120 grados Celsius durante 20 minutos. Después de la limpieza, caliente la oblea en una placa calefactora a 200 grados Celsius durante 20 minutos para evaporar el agua residual.

Coloque la oblea limpia y seca en un cubridor por centrifugado. Aplique 2 mililitros de solución de fotolito negativo sobre la oblea y realice el cubrimiento por centrifugado a 3000 revoluciones por minuto durante 40 segundos. Seque la oblea recubierta por centrifugado en una placa calefactora a 150 grados Celsius durante un minuto.

Cubra la oblea con una máscara de cromo en el patrón deseado de electrodos. Exponga la superficie de la resistencia fotosensible enmascarada a luz ultravioleta de 365 nanómetros para obtener 225 milijulios por centímetro cuadrado. A continuación, hornee la resistencia fotosensible expuesta en una placa calefactora a 100 grados Celsius durante un minuto.

Sumerja la oblea en el revelador de fotoresistente durante 15 segundos, luego lave la oblea con el patrón en un chorro suave de agua desionizada y seque la oblea bajo una corriente de gas nitrógeno. A continuación, coloque la oblea con el patrón en un evaporador de metales por haz de electrones. Deposite una capa de cromo de 20 nanómetros de espesor y una capa de oro de 80 nanómetros de espesor sobre la oblea a una velocidad de un angstrom por segundo.

Luego, ataque el fotoresistente subyacente calentando ultrasónicamente la oblea recubierta de metal en acetona durante 30 minutos a 40 kilohercios y amplitud del 100 %. Utilice una sierra de corte para dividir la oblea en piezas más pequeñas según sea necesario. Para comenzar a fabricar el molde del canal microfluídico, limpie y seque una oblea de silicio de cuatro pulgadas de la misma manera que la oblea de borosilicato descrita anteriormente.

Coloque la oblea de silicio en un centrifugador de recubrimiento y aplique cuatro mililitros de solución de fotolitografía negativa. Realice el recubrimiento por centrifugado de la oblea a 500 rpm durante 15 segundos, luego a 1.000 rpm durante 15 segundos, y finalmente a 3.000 rpm durante 60 segundos. Coloque la oblea con la cara hacia arriba sobre una toallita para sala limpia empapada en acetona para eliminar el fotolitógrafo residual de la parte posterior y los bordes de la oblea.

Coloque la oblea en el horno a 65 grados Celsius durante un minuto y luego a 95 grados Celsius durante dos minutos. Coloque un patrón de máscara de cromo para los canales microfluídicos sobre la oblea seca. Exponga el fotoresistente a luz ultravioleta de 365 nanómetros a 180 milijulios por centímetro cuadrado y luego hornee nuevamente la oblea a 65 y 95 grados Celsius durante uno y dos minutos, respectivamente.

Coloque la oblea patroneada en un recipiente con revelador de fotoresistencia y agite suavemente el recipiente durante tres minutos. Enjuague la oblea revelada en isopropanol y seque la oblea bajo una corriente de gas nitrógeno. Hornee la oblea a 200 grados Celsius durante 30 minutos, luego utilice un perfilómetro para verificar que la fotoresistencia del patrón tenga un espesor uniforme a través de toda la oblea.

Coloque la oblea en un desecador al vacío junto con 200 microlitros de triclorosilano en una placa de Petri descubierta. Deje reposar la oblea en el desecador con el triclorosilano durante ocho horas para silanizar la superficie de la oblea. Para comenzar a armar el dispositivo, utilice cinta de uso general para sala limpia para fijar el molde de oblea de silicio en una placa de Petri de 150 milímetros de diámetro.

Añada 50 gramos de una mezcla de diez a uno de prepolímero de polidimetilsiloxano a la placa de Petri y desgasifique la mezcla en un desecador al vacío durante una hora. Cure la mezcla desgasificada a 65 grados Celsius durante al menos cuatro horas. Utilice un escalpelo para recortar la capa de PDMS curada y luego desprenda la capa curada del molde con pinzas.

Corte el PDMS en trozos pequeños. Perfore los orificios del canal microfluídico de entrada y salida con un punzón de biopsia. Coloque la capa de PDMS con la cara del patrón hacia abajo sobre cinta adhesiva transparente para limpiar la superficie micromecanizada.

Lave el sustrato de vidrio con electrodo previamente preparado con acetona, isopropanol y agua desionizada. Seque el sustrato bajo una corriente de gas nitrógeno. Coloque la capa de PDMS y el sustrato en un generador de plasma de radiofrecuencia ajustado a 100 milivatios, con los lados del micromecanismo orientados hacia arriba.

Activee las superficies de la micromáquina en plasma de oxígeno durante 30 segundos. A continuación, utilice un microscopio óptico para alinear la capa de PDMS con los electrodos de la superficie. Una vez alineadas, permita que las superficies entren en contacto físico para sellar la capa de PDMS sobre el sustrato de vidrio.

Es fundamental que el patrón del electrodo de recubrimiento sobre el sustrato de vidrio esté correctamente alineado con los canales microfluídicos de PDMS. Una vez alineado adecuadamente, la interacción de la partícula con el electrodo de superficie generará una forma de onda de código deseada para la multiplexación. Incube el dispositivo ensamblado a 70 grados Celsius durante cinco minutos, con el lado de vidrio hacia abajo.

Finalmente, suelde los cables a las almohadillas de contacto del electrodo para terminar el ensamblaje del dispositivo. Para comenzar el experimento, coloque el dispositivo microfluídico sobre la platina de un microscopio óptico. Conecte el electrodo de referencia del dispositivo al puerto de salida de señal de un amplificador de detección síncrona y aplique una onda senoidal de 400 kilohercios.

Conecte los electrodos sensores positivo y negativo a dos amplificadores transimpedancia independientes. Conecte ambos amplificadores transimpedancia a las entradas de voltaje diferencial del amplificador de bloqueo, de modo que la señal del sensor positivo se reste de la señal del sensor negativo. Conecte la salida del demodulador del amplificador de bloqueo a una unidad de adquisición de datos.

En el software de adquisición de datos, establezca una frecuencia de muestreo para la salida del amplificador de bloqueo de 1 megahercio. Configure una cámara de alta velocidad para grabar ópticamente el funcionamiento del dispositivo tal como se observa bajo el microscopio. Introduzca una suspensión celular preparada en una jeringa.

Sujete la jeringa de muestra en una bomba de jeringa y conecte la jeringa al canal de entrada. Dirija el canal de salida hacia un recipiente de desecho. Utilice la bomba de jeringa para impulsar la suspensión celular a través del dispositivo a un caudal constante mientras registra la señal de modulación de impedancia.

Tras la finalización del experimento, procese los datos eléctricos con software de análisis. Compare la señal eléctrica procesada con las imágenes de la cámara de alta velocidad para crear una curva de calibración para el tamaño celular. Se hizo fluir una suspensión celular a través de un dispositivo sensor microfluídico con cuatro patrones de electrodos únicos derivados de códigos de sensores ortogonales.

Se registraron las cuatro señales de los sensores a partir de una única salida eléctrica. El sensor individual asociado a cada señal registrada se identificó mediante la correlación de las señales de los sensores registradas con todos los códigos posibles, lo que generó picos de autocorrelación claramente distinguibles. Las formas de onda producidas por las señales interferentes provenientes de la detección simultánea de células en los cuatro canales se resolvieron mediante un algoritmo iterativo.

Se correlacionó una forma de onda grabada con todos los códigos posibles y se identificó el pico de autocorrelación más grande. Se reconstruyó la señal correspondiente del sensor individual y se restó de la forma de onda de entrada. La señal residual se pasó a la siguiente iteración como entrada y el proceso continuó hasta que la señal residual no produjo picos de autocorrelación.

Las señales estimadas se refinaron basándose en un algoritmo de optimización que busca el mejor ajuste entre las formas de onda reconstruidas y las registradas originalmente, utilizando la aproximación de mínimos cuadrados. La ubicación celular, el tamaño y el tiempo para atravesar el sensor se determinaron entonces a partir del número de canal, la amplitud, la duración y el momento relativo de las señales estimadas del sensor. El procedimiento se validó mediante la comparación de las señales eléctricas con mediciones ópticas provenientes de la cámara de alta velocidad.

Una vez dominada, esta técnica es muy fácil de implementar, porque es muy sencilla desde una perspectiva de hardware. No tiene componentes activos en el chip. Es directamente compatible con la litografía suave y el procesamiento de señales se basa en un algoritmo computacional sencillo.

Tras seguir este protocolo, podrá fabricar chips microfluídicos con sensores eléctricos multiplexados basados en códigos y descifrar las señales eléctricas para mediciones bioanalíticas. Esta tecnología de detección electrónica versátil y escalable puede integrarse fácilmente en diversos dispositivos microfluídicos para realizar ensayos cuantitativos mediante el seguimiento espaciotemporal de partículas mientras se procesan en el chip. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, fabricar e implementar la tecnología microfluídica CODES.