Plataforma de microfluidos con multiplexado de detección electrónica para el seguimiento espacial de las partículas

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una plataforma microfluídica que combina la detección de pulsos resistivos con el acceso múltiple por división de código para multiplexar la detección y el dimensionamiento de partículas en múltiples canales microfluídicos. Esta tecnología, denominada CODES microfluídica, puede ayudar a realizar dispositivos de chip de laboratorio totalmente integrados y verdaderamente portátiles que son muy adecuados para las pruebas en el punto de atención de muestras biológicas en entornos de recursos limitados. La principal ventaja de esta técnica es que puede rastrear electrónicamente la manipulación espacial y temporal de las partículas en el chip microfluídico, eliminando la necesidad de un instrumento externo como un microscopio.

Nuestra tecnología es compatible con la litografía blanda y puede integrarse fácilmente en un dispositivo microfótico en el que las partículas se fraccionan para proporcionar una lectura electrónica directa similar a la del contador Coulter. Para comenzar la construcción del dispositivo microfluídico, genere un conjunto de cuatro códigos de oro de siete bits. A continuación, diseñe cuatro diseños de electrodos únicos basados en los códigos de oro utilizando un diseño asistido por ordenador o un software CAD como AutoCAD.

Finalmente, haga que el Photomasked con el diseño de electrodos diseñado sea fabricado por un proveedor de Photomask. A continuación, remoje una oblea de vidrio de borosilicato de cuatro pulgadas en una solución de piraña de cinco a uno a 120 grados centígrados durante 20 minutos. Después de la limpieza, caliente la oblea en una placa caliente a 200 grados centígrados durante 20 minutos para evaporar el agua residual.

Coloque la oblea limpia y seca en un recubridor giratorio. Aplique 2 mililitros de solución fotorresistente negativa a la oblea y centrifuga la capa a 3000 revoluciones por minuto durante 40 segundos. Seque la oblea recubierta de centrifugación en una placa caliente a 150 grados centígrados durante un minuto.

Cubra la oblea con una máscara de cromo en el patrón de electrodos deseado. Exponga la superficie fotorresistente enmascarada a una luz ultravioleta de 365 nanómetros para lograr 225 milijulios por centímetro cuadrado. A continuación, hornee la fotorresistencia expuesta en una placa caliente a 100 grados centígrados durante un minuto.

Sumerja la oblea en revelador fotorresistente durante 15 segundos, luego lave la oblea de patrón en un rocío suave de agua desionizada y seque la oblea bajo un chorro de gas nitrógeno. A continuación, coloque la oblea estampada en un evaporador metálico de haz de electrones. Deposite una capa de cromo de 20 nanómetros de espesor y una capa de oro de 80 nanómetros de espesor sobre la oblea a una velocidad de un Angstrom por segundo.

A continuación, grabe la fotorresistencia subyacente calentando por ultrasonidos la oblea recubierta de metal en acetona durante 30 minutos a 40 kilohercios y 100% de amplitud. Use una sierra para cortar la oblea en trozos más pequeños según sea necesario. Para comenzar a fabricar el molde de canal microfluídico, limpie y seque una oblea de silicio de cuatro pulgadas de la misma manera que la oblea de borosilicato descrita anteriormente.

Coloque la oblea de silicona en un recubridor giratorio y aplique cuatro mililitros de solución fotorresistente negativa. Gire la oblea a 500 rpm durante 15 segundos, luego a 1.000 rpm durante 15 segundos y finalmente a 3.000 rpm durante 60 segundos. Coloque la oblea boca arriba sobre una toallita de sala limpia empapada en acetona para eliminar la fotorresistencia residual de la parte posterior y los bordes de la oblea.

Hornee la oblea a 65 grados centígrados durante un minuto y luego a 95 grados centígrados durante dos minutos. Coloque un patrón de máscara de cromo para los canales microfluídicos en la oblea seca. Exponga la fotorresistencia a una luz ultravioleta de 365 nanómetros a 180 milijulios por centímetro cuadrado y luego hornee la oblea nuevamente a 65 y 95 grados Celsius durante uno y dos minutos respectivamente.

Coloque la oblea estampada en un recipiente de revelador fotorresistente y agite suavemente el recipiente durante tres minutos. Enjuague la oblea desarrollada en isopropanol y seque la oblea bajo una corriente de gas nitrógeno. Hornee la oblea a 200 grados centígrados durante 30 minutos, luego use un perfilómetro para verificar que el patrón fotorresistente sea uniformemente grueso en toda la oblea.

Coloque la oblea en un desecador al vacío junto con 200 microlitros de triclorosilano en una placa de Petri descubierta. Deje que la oblea se asiente en el desecador con el triclorosilano durante ocho horas para silanizar la superficie de la oblea. Para comenzar a ensamblar el dispositivo, use cinta adhesiva de sala limpia de uso general para fijar el molde de obleas de silicona en una placa de Petri de 150 milímetros de diámetro.

Agregue 50 gramos de una mezcla de 10 a uno de prepolímero de polidimetilsiloxano a la placa de Petri y desgasifique la mezcla en un desecador al vacío durante una hora. Cura la mezcla desgasificada a 65 grados centígrados durante al menos cuatro horas. Use un bisturí para cortar la capa de PDMS curada y luego despegue la capa curada del molde con pinzas.

Corta el PDMS en trozos pequeños. Perfore los orificios del canal microfluídico de entrada y salida con un perforador de biopsia. Coloque el patrón de capa de PDMS boca abajo sobre cinta transparente para limpiar la superficie micromecanizada.

Enjuague el sustrato de vidrio que contiene electrodos previamente preparado con acetona, isopropanol y agua desionizada. Seque el sustrato bajo un chorro de gas nitrógeno. Coloque la capa de PDMS y el sustrato en un generador de plasma de RF a 100 milivatios con los lados de la micromáquina hacia arriba.

Activar las superficies de la micromáquina en plasma de oxígeno durante 30 segundos. A continuación, utilice un microscopio óptico para alinear la capa de PDMS del patrón con los electrodos de superficie. Una vez alineadas, permita que las superficies entren en contacto físico para sellar la capa de PDMS sobre el sustrato de vidrio.

Es crucial que el patrón de electrodos de recubrimiento en el sustrato de vidrio esté correctamente alineado con los canales microfluídicos del PDMS. Una vez alineada correctamente, la interacción de la partícula con el electrodo de superficie generará una forma de onda de código deseada para la multiplexación. Hornee el dispositivo ensamblado a 70 grados centígrados durante cinco minutos, con el vidrio hacia abajo.

Finalmente, suelde los cables a las almohadillas de contacto del electrodo para terminar el ensamblaje del dispositivo. Para comenzar el experimento, coloque el dispositivo microfluídico en una platina de microscopio óptico. Conecte el electrodo de referencia del dispositivo al puerto de salida de señal de un amplificador de bloqueo y aplique una onda sinusoidal de 400 kilohercios.

Conecte los electrodos del sensor positivo y negativo a dos amplificadores de transimpedancia independientes. Conecte ambos amplificadores de transimpedancia a las entradas de voltaje diferencial del amplificador de bloqueo con la señal del sensor positivo que se va a restar de la señal del sensor negativo. Conecte la salida del demodulador del amplificador de bloqueo a una unidad de adquisición de datos.

En el software de adquisición de datos, establezca una frecuencia de muestreo para la salida del amplificador de bloqueo de 1 megahercio. Configure una cámara de alta velocidad para registrar ópticamente el funcionamiento del dispositivo tal como se ve bajo el microscopio. Extrae una suspensión celular preparada en una jeringa.

Asegure la jeringa de muestra en una bomba de jeringa y conecte la jeringa al canal de entrada. Dirija el canal de salida a un contenedor de residuos. Utilice la bomba de jeringa para impulsar la suspensión de la celda a través del dispositivo a un caudal constante mientras registra la señal de modulación de impedancia.

Una vez finalizado el experimento, procese los datos eléctricos con un software de análisis. Compare la señal eléctrica procesada con las imágenes de la cámara de alta velocidad para crear una curva de calibración para el tamaño de la celda. Una suspensión celular fluyó a través de un dispositivo sensor microfluídico con cuatro patrones de electrodos únicos derivados de códigos de sensores ortogonales.

Las señales de los cuatro sensores se registraron a partir de una sola salida eléctrica. El sensor individual asociado a cada señal registrada se identificó mediante la correlación de las señales del sensor registradas con todos los códigos posibles, lo que produjo picos de autocorrelación claramente distinguibles. Las formas de onda producidas por las señales interferentes a partir de la detección simultánea de células en los cuatro canales se resolvieron con un algoritmo iterativo.

Una forma de onda registrada se correlacionó con todos los códigos posibles y se identificó el pico de autocorrelación más grande. La señal del sensor individual correspondiente se reconstruyó y se restó de la forma de onda de entrada. La señal residual se pasó a la siguiente iteración como entrada y el proceso continuó hasta que la señal residual no produjo picos de autocorrelación.

Las señales estimadas se refinaron sobre la base de un algoritmo de optimización que buscaba el mejor ajuste entre las formas de onda reconstruidas y las registradas originales utilizando la aproximación de mínimos cuadrados. La ubicación de la celda, el tamaño y el tiempo para cruzar el sensor se determinaron a partir del número de canal, la amplitud, la duración y el tiempo relativo de las señales estimadas del sensor. El procedimiento se validó mediante la comparación de las señales eléctricas con las mediciones ópticas de la cámara de alta velocidad.

Una vez dominada, esta técnica es muy fácil de implementar, porque es muy sencilla desde el punto de vista del hardware. No tiene ningún componente activo en el chip. Es directamente compatible con la litografía blanda y el procesamiento de la señal se basa en un sencillo algoritmo computacional.

Siguiendo este protocolo, puede fabricar chips microfluídicos con sensores eléctricos multiplex basados en código y decodificar señales eléctricas para la medición bioanalítica. Esta tecnología de detección electrónica versátil y escalable se puede integrar fácilmente en varios dispositivos microfluídicos para realizar ensayos cuantitativos mediante el seguimiento espacial temporal de las partículas a medida que se procesan en el chip. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo diseñar, fabricar e implementar una tecnología CODES microfluídica.