Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar poblaciones ultra pequeñas de nanopartículas biocompatibles, caracterizar sus propiedades físicas e investigar las interacciones entre las células de partículas. Esto se logra utilizando primero el método de temperatura de inversión de fase para sintetizar las nanopartículas lipídicas. Durante este proceso, el lípido y el surfactante se funden inicialmente.

Después de agregar una cantidad específica de agua, la mezcla se calienta hasta que se produce la separación de fases. A continuación, la mezcla se agita continuamente hasta que se crea una nanoemulsión y se completa la síntesis de nanopartículas lipídicas sólidas o sln. A continuación, se utiliza la dispersión dinámica de la luz o DLS para medir el tamaño de las partículas y la dispersión de polietileno.

La calorimetría diferencial de barrido o DSC es una técnica adicional utilizada para determinar el punto de fusión y el calor latente de fusión con el fin de caracterizar aún más las partículas, en última instancia, la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo se pueden utilizar para investigar las interacciones de las células de partículas. La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos de alta energía existentes, como el microfluido ultrasonorizado y la homogeneización a alta presión, es que se trata de una técnica de síntesis comparativamente suave, sencilla y escalable. Para sintetizar el LNS, combine 0,6 miligramos de colorante fluorescente u otro compuesto lipofílico y 0,10 gramos de alcan o lípido lineal.

En un vial de 15 mililitros, funda los componentes a 90 grados centígrados y revuelva, agregue 0,11 gramos de un tensioactivo lineal no iónico. A continuación, mezcle la mezcla resultante a 90 grados centígrados y revuelva. A continuación, agregue 1,79 gramos de agua estéril a la mezcla, caliente a 90 grados centígrados y controle visualmente la solución hasta que se observen dos fases.

Ahora revuelve la mezcla hasta que se forme una nano emulsión transparente. Prepare una nanoemulsión separada en paralelo sin agregar el colorante fluorescente para que sirva como muestra de control. Esterilice aún más cada nanoemulsión utilizando un filtro estéril de 0,2 micras.

Emplee DLS para medir el tamaño de partícula y la polidispersidad de los S lns utilizando un vidrio en un diseño de instrumento para medir el tamaño de partícula antes de la medición de las muestras, el tamaño de partícula de dos patrones conocidos debe medirse siguiendo el protocolo del fabricante para la preparación y medición de estándares. A continuación, mida las muestras tal como se prepararon para cada una. Utilice un tiempo de ejecución de 100 segundos, el índice de refracción del agua y la viscosidad del agua a 20 grados centígrados.

Informe el diámetro promedio de las partículas y la dispersidad polivinílica de la distribución del tamaño de partícula para investigar el comportamiento térmico de las S lns utilizando DSC primero pipetear las S LNS en una bandeja de aluminio de 40 microlitros con una masa de aproximadamente 25 miligramos. Selle herméticamente la bandeja con una prensa de engarce universal para minimizar la pérdida de humedad durante el escaneo DSC. Antes de medir cada nanoemulsión de cinco a 80 grados Celsius, informe el punto de fusión y el calor latente de fusión de la gráfica DSC, donde el valle representa el punto de fusión y la integral del área bajo la curva.

En el gráfico DSC, dividido por la cantidad de material representa el calor latente del cultivo fundido. Fibroblastos humanos primarios según las instrucciones del fabricante en medio líquido para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos. Complementado con el kit de suplemento de bajo crecimiento sérico, mantenga las células en una atmósfera humidificada a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono y subcultivo al alcanzar el 80% de confluencia tanto para MTT como para células semilla de análisis de imágenes.

En una placa de 96 pocillos a una densidad de 20.000 células por pocillo. Permita que las células se equilibren a 37 grados centígrados durante la noche antes de la exposición al SLN en el tiempo cero, diluya los SLM en medio completo para lograr la concentración de lípidos deseada y agregue 10 microlitros por pocillo a cada pocillo replicado en la placa de 96 pocillos después de 24 horas de incubación con S lns, determine la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT de acuerdo con el protocolo del fabricante. Lave las células una vez y agregue 100 microlitros de medio fresco a cada una.

Elimine los pozos de control incubando en una solución de metanol al 70% durante 10 minutos antes de reemplazarla con medio fresco. Agregue el reactivo MTT a 10 microlitros por pocillo a cada pocillo de la microplaca e incube durante la noche a 37 grados centígrados después de la incubación durante la noche, solubilice la forma intracelular y los cristales con 100 microlitros de la solución detergente proporcionada. De acuerdo con el protocolo del fabricante, incubar las células en la solución de detergente durante tres horas a temperatura ambiente antes de obtener los valores de absorbancia.

Uso de un lector de microplacas para prepararse para la microscopía. Lave los fibroblastos dos veces con solución salina inflada con fosfato estéril. Fije las células durante 10 minutos con metanol frío al 70% en puntos de tiempo específicos después de la dosificación de fibroblastos con lns.

Después de 10 minutos, reemplace el metanol con solución salina tamponada con fosfato o PBS antes de capturar imágenes con un microscopio invertido. El S SLN sintetizado dio como resultado un control de S LNS con un diámetro de partícula promedio de 18.59 y con una dispersidad de poli de 5.83 y SLM cargados de rojo Nilo con un diámetro de partícula promedio de 16.87 nanómetros y con una dispersidad de polígono de 4.47 utilizando un ensayo MTT. Se midió el efecto de la dosis-respuesta sobre el metabolismo celular donde el aumento de la concentración de partículas resultó en una disminución de la viabilidad celular.

No se observaron diferencias en la toxicidad entre las células expuestas al SLN solo frente a las células cargadas de rojo del Nilo. SLN. Paralelamente, las células se examinaron visualmente para determinar la adherencia al cultivo de tejidos. Se tomaron imágenes de poliestireno para demostrar tanto la morfología celular representativa como la absorción de partículas fluorescentes a lo largo del tiempo, utilizando una dosis igual a cinco microgramos por mililitro.

La absorción de partículas lipídicas se observó dos horas después de la exposición. El nivel de incorporación de nanopartículas se determinó midiendo la intensidad de la fluorescencia del rojo del Nilo en células dendríticas derivadas de la médula ósea murina, o B MDC, mediante citometría de flujo. Se observó una correlación directa entre la concentración de SNS utilizada y la cantidad de fluorescencia evaluada en las CMD B.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar poblaciones ultra pequeñas de nanopartículas biocompatibles, caracterizar sus propiedades físicas e investigar las interacciones de las células de partículas.