Name: Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-11-17T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 19 s
Description: Aprende a sintetizar nanopartículas lipídicas biocompatibles mediante el método de inversión de fase por temperatura. Caracteriza sus propiedades físicas con dispersión de luz dinámica y estudia las interacciones celulares in vitro.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

La investigación reportada en esta publicación fue apoyada por el Departamento de Investigación y Desarrollo Exploratorio del Laboratorio de Física Aplicada de Johns Hopkins, la Oficina de Transferencia de Tecnología y el Programa de Becas Stuart S. Janney, además del Instituto Nacional del Corazón, los Pulmones y la Sangre de los Institutos Nacionales de Salud bajo el Premio Número R21HL127355.

1. Tramitación de GLC <ol><li> Síntesis de GLC Nota: Utilice el método PIT 1,17,20 para preparar los sub-20 GLC nm 1. <ol><li> Utilice una técnica aséptica, Bioreagents o reactivos de grado de cultivo de células, y los materiales estériles (es decir, pipetas, espátulas, viales, etc.). </li><li> Utilice un gabinete de bioseguridad para la síntesis de GLC (Figura 2). </li><li> Combinar 0,6 mg de tinte fluorescente (Rojo Nilo (NIR), la concentración NiR es de aproximadamente 0,3 mg / ml) y 0,10 g de Heneicosane (lípido, 5% p / p concentración de lípidos) en un vial (15 ml), co-funde a 90 ° C, y revuelva. </li><li> Añadir 0,11 g de polioxietileno (10) oleil éter (tensioactivo, 5,5% p / p concentración de tensioactivo). Co-fundir la mezcla resultante a 90 ° C y remover. </li><li> Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente. Nota: Bajo continua agitación y enfriamiento controlado, SLSe crean Ns. Estas condiciones causan una inversión de la emulsión de agua en aceite a una emulsión aceite-en-agua. Moléculas lipofílicas como partición NiR a las gotas de lípidos. </li><li> Preparar una nanoemulsión en paralelo sin añadir el colorante fluorescente, con el fin de servir como una muestra de control. Combine 0,10 g de Heneicosane y 0,11 g de polioxietileno (10) oleiléter en un vial (15 ml) co-fusión a 90 ° C, y revuelva. <ol><li> Añadir 1,79 g de agua estéril a la mezcla, el calor a 90 ° C, y revuelva hasta que se forme una nanoemulsión transparente. </li></ol></li><li> Además esterilizar cada nanoemulsión usando un filtro estéril de 0,2 micras. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig2.jpg" /> Figura 2. Esquema de la síntesis de GLC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> </li><li> Tamaño de partícula y Polydispersity <ol><li> Utilice dispersión dinámica de luz (DLS) para medir el tamaño de las partículas y la polidispersidad de los GLC 1 utilizando una cubeta de vidrio y un instrumento diseñado para medir el tamaño de las partículas. </li><li> Antes de las mediciones de las muestras, medir los tamaños de partícula de dos estándares conocidos siguiendo el protocolo del fabricante para la preparación estándares y medición. </li><li> Llenar la cubeta de vidrio con 1,5 ml de solución estándar y medir la solución estándar con las mismas condiciones de medición como las muestras. Nota: Paso anterior se repitió para cada norma. </li><li> Medir las muestras como se ha preparado. Para cada uno, utilice los siguientes parámetros experimentales: una duración de 100 segundos, el índice de refracción del agua (1.33), la viscosidad del agua a 20 ° C (1.002 mPa · s). Nota: Esta técnica utiliza desplazada en frecuencia de luz para medir el tamaño de las nanopartículas. </li><li> Reporte el diámetro medio de partícula y la polidispersidad de partidistribución de tamaño de culo. </li></ol></li><li> Punto de fusión y calor latente de fusión <ol><li> Utilice un calorímetro diferencial de barrido (DSC) equipado con un muestreador automático y la fuente de enfriamiento nitrógeno líquido para investigar el comportamiento térmico de SLNs 1. </li><li> Pipetear los SLNs como preparadas en un molde de aluminio 40 l con una masa de aproximadamente 25 mg y sellar herméticamente el recipiente usando una prensa rizador universal a minimizar la pérdida de humedad durante el análisis DSC. </li><li> Mida cada nanoemulsión de 5 a 80 ° C. </li><li> Informar el punto de fusión y el calor latente de fusión del gráfico de DSC, donde el valle representa el punto de fusión y la integral de la área bajo la curva en el gráfico de DSC dividido por la cantidad de material representa el calor latente de fusión. </li></ol></li></ol> 2. GLC Interacción con fibroblastos y las células dendríticas <ol><li> Cultura de Primaria fibroblastos humanos <ol><li> Cultura fi humana primariafibroblastos de acuerdo a las instrucciones del fabricante en medio líquido para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos (medio 106), complementado con el kit suplemento de bajo crecimiento en suero (LSGS). Mantener las células en una atmósfera húmeda a 37 ° C, 5% de CO 2 y la subcultura al llegar a 80% de confluencia. </li><li> Por tanto MTT y análisis de imágenes, las células de semillas en una placa de 96 pocillos, a una densidad de 2 x 10 4 células por pocillo, y permitir que se equilibre a 37 ° CO / N antes de la exposición SLN. </li><li> En el tiempo cero, diluir GC en medio completo como se indica (Figura 4), ​​con respecto a la concentración de lípidos, y añadir 10 l por pocillo a cada replicar bien en la placa de 96 pocillos. </li><li> Mantener las células a 37 ° C, 5% de CO 2, durante el período de incubación. </li></ol></li><li> MTT Ensayo de toxicidad <ol><li> Después de 24 h de incubación con GLC, determinar la viabilidad celular utilizando el ensayo MTT, según el protocolo del fabricante. &lt;/ li&gt; <li> Lavar las células una vez y añadir medio fresco a cada pocillo (100 l / pocillo). Matar a los pocillos de control por incubación en una solución de metanol 70% durante 10 min antes de reemplazar con medio fresco. </li><li> Añadir reactivo MTT (10 l por pocillo) a cada pocillo de la microplaca y se incuba O / N a 37 ° C. </li><li> Después de O / N incubación, disolver los cristales de formazina intracelulares con la solución de detergente proporcionado (100 l por pocillo) de acuerdo con el protocolo del fabricante. </li><li> Después de 3 h de incubación a RT, obtener valores de absorbancia a una longitud de onda de medición de 570 nm utilizando un lector de microplacas. Reactivo MTT utilizado debe ser de menos de 1% (w / v) de 3- (4,5-dimetiltiazol-2) -2, bromuro de 5-difenil-tetrazolio: Nota. </li></ol></li><li> Microscopía de Fluorescencia <ol><li> En los puntos de tiempo específicos después de la dosificación de los fibroblastos con SLN, lavar los fibroblastos dos veces con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) y fijar durante 10 minutos con 70% de metanol frío. </li><li> Después de 10 min, Sustituir el metanol con PBS y capturar imágenes utilizando un microscopio invertido, usando un paso de banda (BP) 690/50 nm conjunto de filtros. </li></ol></li><li> Cultivo de células de médula ósea de ratón dendríticas <ol><li> Inducir a las células derivadas de la médula ósea de ratón dendríticas (BMDC) anteriormente descritos 23,24. Brevemente, las suspensiones de placa de una sola célula de ratones C57BL / 10 de la médula ósea en 100 mm placas de Petri en 2 x 10 6 / placa con factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos murino recombinante (GM-CSF, 300 U / ml) y murina recombinante IL-4 (células B factor estimulante, 200 U / ml). Cambie los medios de comunicación cada 3 días. </li><li> El día 7, añadir SLNs cargados-NIR a los platos a una concentración final de 0,5 y 5,0 mg / ml de lípidos y mantener las células en un 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora para la longitud deseada de la exposición. </li><li> Recoger las células de los platos aspirando todos los medios de comunicación en la placa, recogiéndola en un tubo de 50 ml, seguido de un lavado a fondo de la placa (para desalojar ad vagamenteHerent células) con 5 ml de tampón fosfato salino (PBS) conteniendo 4 mM de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA). Recoger la suspensión celular obtenida en el mismo tubo 50 ml. </li></ol></li><li> Evaluación del GLC Incorporación mediante citometría de flujo <ol><li> Determinar la concentración de la suspensión celular obtenida en el punto 2.4.3 y distribuir 3x10 5 células en un 12 mm x 75 mm de fondo redondo de tubo de FACS. </li><li> Lavar las células mediante la adición de 1 ml de PBS y luego centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet con 100 l de PBS / EDTA 2 mM / 0,1% de albúmina de suero bovino (BSA) (tampón de tinción) que contienen anticuerpo monoclonal anti-CD11c-FITC (0,25 g / ml final). Incubar durante 30 min en hielo en la oscuridad. </li><li> Lavar las células con 1 ml de PBS y centrifugar los tubos durante 5 min a 400 xg, a una temperatura de 4 ° C. </li><li> Descartar el sobrenadante y resuspender cadasedimentar con 400 l de tampón de tinción. Las células están ahora listos para la adquisición de las muestras con un citómetro de flujo (posiblemente equipado con láseres azul y rojo). </li><li> El uso de citometría de flujo de software de análisis, evaluar el nivel de incorporación de GLC por DC por gating en la población de células CD11c + (FITC positivo) y la comparación de la intensidad de GLC-asociados fluorescencia (medido en los canales PerCP-Cy5.5 o APC). </li></ol></li></ol>

<ol><li>Calderon-Colon, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+of+sub-10+nm+solid+lipid+nanoparticles+for+topical+and+biomarker+detection+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanopart+Res%22%5BJournal%5D)">Synthesis of sub-10 nm solid lipid nanoparticles for topical and biomarker detection applications.</a> J Nanopart Res. 16 (2252), 1-10 (2014).</li>
<li>Patwekar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Review+on+nanoparticles+used+in+cosmetics+and+dermal+products%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Review on nanoparticles used in cosmetics and dermal products.</a> World Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 3 (8), 1407-1421 (2014).</li>
<li>Martins, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+intracellular+drug+transporters%3A+An+investigation+of+the+uptake+mechanism+and+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as intracellular drug transporters: An investigation of the uptake mechanism and pathway.</a> International Journal of Pharmaceutics. 430, 216-227 (2012).</li>
<li>Yadav, N., Khatak, S., Sara, U. V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Lipid+Nanoparticles+-+A+Review%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Applied+Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Solid Lipid Nanoparticles - A Review.</a> International Journal of Applied Pharmaceuticals. 5 (2), 8-18 (2013).</li>
<li>Weber, S., Zimmer, A., Solid Pardeike, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+Nanoparticles+%28SLN%29+and+Nanostructured+Lipid+Carriers+%28NLC%29+for+pulmonary+application%3A+a+review+of+the+state+of+the+art%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Lipid Nanoparticles (SLN) and Nanostructured Lipid Carriers (NLC) for pulmonary application: a review of the state of the art.</a> Eur J Pharm Biopharm. 86 (1), 7-22 (2014).</li>
<li>Mahajan, A., Kaur, S., Grewal, N. K., Kaur, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+Lipd+Nanoparticles+%28SLNs%29+-+As+Novel+Lipd+based+Nanocarriers+for+Drugs%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Advanced+Research%22%5BJournal%5D)">Solid Lipd Nanoparticles (SLNs) - As Novel Lipd based Nanocarriers for Drugs.</a> International Journal of Advanced Research. 2 (1), 433-441 (2014).</li>
<li>Buse, J., El-Aneed, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Properties%2C+engineering+and+applications+of+lipid-based+nanoparticle+drug-delivery+systems%3A+current+research+and+advances%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Properties, engineering and applications of lipid-based nanoparticle drug-delivery systems: current research and advances.</a> Nanomedicine (Lond). 5, 1237-1260 (2010).</li>
<li>Malam, Y., Loizidou, M., Seifalian, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+and+nanoparticles%3A+nanosized+vehicles+for+drug+delivery+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Liposomes and nanoparticles: nanosized vehicles for drug delivery in cancer.</a> Trends Pharmacol Sci. 30 (11), 592-599 (2009).</li>
<li>Lim, S. B., Banerjee, A., Onyuksel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improvement+of+drug+safety+by+the+use+of+lipid-based+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+controlled+release+%3A+official+journal+of+the+Controlled+Release+Society%22%5BJournal%5D)">Improvement of drug safety by the use of lipid-based nanocarriers.</a> Journal of controlled release : official journal of the Controlled Release Society. 163, 34-45 (2012).</li>
<li>Ali Khan, A., Mudassir, J., Mohtar, N., Darwis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+drug+delivery+to+the+lymphatic+system%3A+lipid-based+nanoformulations%5BTitle%5D)+AND+%22International+journal+of+nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Advanced drug delivery to the lymphatic system: lipid-based nanoformulations.</a> International journal of nanomedicine. 8, 2733-2744 (2013).</li>
<li>Oussoren, C., Storm, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liposomes+to+target+the+lymphatics+by+subcutaneous+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+drug+delivery+reviews%22%5BJournal%5D)">Liposomes to target the lymphatics by subcutaneous administration.</a> Advanced drug delivery reviews. 50, 143-156 (2001).</li>
<li>Shang, L., Nienhaus, K., Nienhaus, G. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+nanoparticles+interacting+with+cells%3A+size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Engineered nanoparticles interacting with cells: size matters.</a> J Nanobiotechnology. 12, 5(2014).</li>
<li>Joshi, M. D., Muller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+nanoparticles+for+parenteral+delivery+of+actives%5BTitle%5D)+AND+%22European+journal+of+pharmaceutics+and+biopharmaceutics+%3A+official+journal+of+Arbeitsgemeinschaft+fur+Pharmazeutische+Verfahrenstechnik+e.V%22%5BJournal%5D)">Lipid nanoparticles for parenteral delivery of actives.</a> European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.V. 71, 161-172 (2009).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micellar+nanocarriers%3A+pharmaceutical+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutical+research%22%5BJournal%5D)">Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives.</a> Pharmaceutical research. 24, 1-16 (2007).</li>
<li>Ashley, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+targeted+delivery+of+multicomponent+cargos+to+cancer+cells+by+nanoporous+particle-supported+lipid+bilayers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+materials%22%5BJournal%5D)">The targeted delivery of multicomponent cargos to cancer cells by nanoporous particle-supported lipid bilayers.</a> Nature materials. 10, 389-397 (2011).</li>
<li>Patchan, M., et al. Nanotech; Nanotechnology 2013: Bio Sensors Instruments, Medical, Environment and Energy; Chapter 3: Materials for Dru., and Gene Delivery. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPatchan%2C+M+%22Nanobandage+for+controlled+release+of+topical+therapeutics%22">Nanobandage for controlled release of topical therapeutics</a>. 3, 255-258 (2013).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., C, S. Formation and stability of nano-emulsions in mixed nonionic surfactant systems. Trends in colloid and interface science XV. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForgiarini%2C+A+%22Progress+in+Colloid+and+Polymer+Science%22">Progress in Colloid and Polymer Science</a>. Koutsoukos, P. 118, Springer Berlin. Heidelberg. 184-189 (2001).</li>
<li>Nantarat, T., Chansakaow, S., Leelapornpisid, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization%2C+characterization+and+stability+of+essential+oils+blend+loaded+nanoemulsions+by+PIC+technique+for+anti-tyrosinase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Pharmacy+and+Pharmaceutical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Optimization, characterization and stability of essential oils blend loaded nanoemulsions by PIC technique for anti-tyrosinase activity.</a> International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences. 7, 308-312 (2015).</li>
<li>Sevcikova, P., Vltavska, P., Kasparkova, V., Formation Krejci, J. Characterization and Stability of Nanoemulsions Prepared by Phase Inversion. Proceeding MACMESE'11 Proceedings of the 13th WSEAS international conference on Mathematical and computational methods in science and engineering, , 132-137 (2011).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. Studies of the relation between phase behavior and emulsification methods with nanoemulsion formation. Trends in colloid and interface science XIV. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aForgiarini%2C+A+%22Progress+in+Colloid+and+Polymer+Science%22">Progress in Colloid and Polymer Science</a>. Buckin, V. 115, Springer. Berlin Heidelberg. 36-39 (2000).</li>
<li>Forgiarini, A., Esquena, J., Gonzalez, C., Solans, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Formation+of+nano-emulsions+by+low-energy+emulsification+methods+at+constant+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Formation of nano-emulsions by low-energy emulsification methods at constant temperature.</a> Langmuir. 17 (7), 2076-2083 (2001).</li>
<li>Cabone, C., Tomasello, B., Ruozi, B., Renis, M., Puglisi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+optimization+of+PIT+solid+lipid+nanoparticles+via+statistical+factorial+design%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Preparation and optimization of PIT solid lipid nanoparticles via statistical factorial design.</a> Eur J Med Chem. 49, 110-117 (2012).</li>
<li>Raimondi, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Target+of+Rapamycin+Inhibition+and+Alloantigen-Specific+Regulatory+T+Cells+Synergize+To+Promote+Long-Term+Graft+Survival+in+Immunocompetent+Recipients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Mammalian Target of Rapamycin Inhibition and Alloantigen-Specific Regulatory T Cells Synergize To Promote Long-Term Graft Survival in Immunocompetent Recipients.</a> J Immunol. 184, 624-636 (2010).</li>
<li>Jhunjhunwala, S., Raimondi, G., Thomson, A. W., Little, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delivery+of+rapamycin+to+dendritic+cells+using+degradable+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Delivery of rapamycin to dendritic cells using degradable microparticles.</a> J Control Release. 133 (13), 191-197 (2009).</li>
<li>Kapse-Mistry, S., Govender, T., Srivastava, R., Yergeri, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanodrug+delivery+in+reversing+multidrug+resistance+in+cancer+cells.%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Nanodrug delivery in reversing multidrug resistance in cancer cells.</a> Front Pharmacol. 5 (159), 1-22 (2014).</li>
<li>Musacchio, T., Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+developments+in+lipid-based+pharmaceutical+nanocarriers%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci+%28Landmark+Ed%29%22%5BJournal%5D)">Recent developments in lipid-based pharmaceutical nanocarriers.</a> Front Biosci (Landmark Ed). 1 (16), 1388-1412 (2011).</li>
<li>Cerpnjak, K., Zvonar, A., Gašperlin, M., Vrečer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid-based+systems+as+a+promising+approach+for+enhancing+the+bioavailability+of+poorly+water-soluble+drugs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm%22%5BJournal%5D)">Lipid-based systems as a promising approach for enhancing the bioavailability of poorly water-soluble drugs).</a> Acta Pharm. 63 (4), 27-445 (2013).</li>
<li>Rodrìguez-Gascòn, A., Pozo-Rodrìguez, A., Solinìs, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+nucleic+acid+vaccines%3A+use+of+self-amplifying+RNA+in+lipid+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">Development of nucleic acid vaccines: use of self-amplifying RNA in lipid nanoparticles.</a> Int J Nanomedicine. 9, 1833-1843 (2014).</li>
<li>Almeida, A. J., Souto, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+a+drug+delivery+system+for+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as a drug delivery system for peptides and proteins.</a> Adv Drug Deliv Rev. 59, 478-490 (2007).</li>
<li>Pardeshi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+based+nanocarriers%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharm%22%5BJournal%5D)">Solid lipid based nanocarriers: an overview.</a> Acta Pharm. 62, 433-472 (2012).</li>
<li>Attama, A. A., Momoh, M. A., Builders, P. F. Lipid Nanoparticulate Drug Delivery Systems: A Revolution in Dosage Form Design and Development. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAttama%2C+AA+%22Recent+Advances+in+Novel+Drug+Carrier+Systems%22">Recent Advances in Novel Drug Carrier Systems</a>. Sezer, A. D. , 107-140 (2012).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

En este estudio, la síntesis de GLC y su aplicabilidad para aplicaciones dirigidas intracelulares fueron exploradas. Estas nanopartículas biocompatibles se han mostrado prometedores como vehículos de administración para múltiples aplicaciones, incluyendo la administración de fármacos, el silenciamiento de genes y tecnologías de vacunas 25-30. Ultra-pequeños GLC se sintetizaron utilizando un proceso fácil, y sus interacciones con las células cutáneas primarias y células inmunes primarias fueron exploradas. GLC...

Vehículos de administración basados ​​en nanopartículas han mostrado una gran promesa para aplicaciones dirigidas intracelulares, proporcionando un mecanismo para alterar específicamente la señalización celular y la expresión génica. Estos vehículos pueden ser cargados con fármacos, proteínas y ácidos nucleicos diseñados para afectar las respuestas celulares y lograr un efecto deseado en los tejidos diana. Muchos tipos de nanovehículos se han explorado para el beneficio terapéutico y de diagnóstico incluyendo lípidos, polímeros, silicio y materiales magnéticos. Estos sistemas son atractivos debido a su potencial para la entrega localizada de fármacos, aumento de la concentración terapéutica en tejidos diana, y la reducción de la toxicidad sistémica. Nanopartículas lipídicas sólidas (GLC) son un ejemplo bien estudiado de un sistema de liberación de nanopartículas que ha surgido como un vehículo de suministro de fármaco prometedor en los últimos años. SLNs se pueden formular fácilmente para múltiples aplicaciones, incluyendo la detección de bio-1, cosméticos 2, y tentrega herapeutic 3-7. Su utilidad se deriva del hecho de que se componen enteramente de, lípidos no tóxicos reabsorbibles, resulta en una mayor biocompatibilidad. Durante la síntesis, fármacos lipófilos se pueden incorporar en vehículos SLN, lo que aumenta la solubilidad del fármaco y la idoneidad para la administración parenteral. Vehículos SLN también ayudan a estabilizar la terapéutica encapsulados, reduciendo su degradación y la limpieza, y la maximización de la acción terapéutica. Estos vehículos son particularmente bien adaptado para acción prolongada, preparaciones de liberación controlada debido a su estabilidad en 3,4,8,9 la temperatura corporal. Es importante destacar que la encapsulación de fármacos en nanopartículas lipídicas altera los perfiles farmacocinéticos intrínsecas de las moléculas de fármaco. Esto proporciona una ventaja potencial al permitir la liberación controlada de fármacos con un índice terapéutico estrecho. La velocidad de liberación de la terapéutica incorporado SLN-puede ser sintonizado basa en la tasa de degradación de lípidos o de la tasa de difusión del fármaco en elmatriz lipídica. SLNs son a menudo diseñados para acumularse en tejidos diana específicos. Por ejemplo, su tamaño (típicamente mayor que 10 nm) potencia la retención en la circulación, donde la vasculatura tumoral con fugas de tejido facilita la deposición. Además, la vía de administración de partículas se ha demostrado que altera la biodistribución con el potencial para apuntar estructuras fisiológicas específicas, tales como los ganglios linfáticos 10,11. Tras la deposición en los tejidos diana, el logro de las interacciones celulares apropiadas y eventual internalización de nanopartículas es un reto debido a la capacidad de las membranas celulares para controlar selectivamente el flujo de iones y moléculas dentro y fuera de la celda 12. Para facilitar la absorción celular, es posible modificar nanovehículos con ligandos específicos que incluyen péptidos, moléculas pequeñas, y anticuerpos monoclonales 13,14. Varios mecanismos que incluyen tanto la penetración pasiva y transporte activo de nanopartículasa través de la membrana celular se han descrito previamente 3,12,15. En general, se ha demostrado que las interacciones célula-nanopartículas están influenciados por las propiedades fisicoquímicas de las nanopartículas incluyendo el tamaño, forma, carga superficial y la química de superficie, además de los parámetros específicos de células tales como el tipo celular o fase del ciclo celular 12. Una investigación anterior demostró la síntesis de sub-10 GLC nm de tópicos 16 y biomarcadores aplicaciones de detección de 1 utilizando el método de la temperatura de inversión de fases (PIT) 17. Este es un método de síntesis suave donde la composición 2 se mantiene constante mientras que la temperatura se cambia gradualmente. Agitación continua de la solución calentada, mientras se enfría a los resultados de RT en una nanoemulsión. Este proceso resulta en la síntesis de GLC con tamaño de partícula menor 1 que se informó anteriormente utilizando diversos métodos para la síntesis de lípidos nanoparticles 17-22. La escala de tamaño resultante, a menos de 20 nm, proporciona una ventaja para aplicaciones de focalización intracelulares debido a una mayor área de superficie y el potencial para las interacciones celulares mejoradas. A esquemática de GLC, diseñado para ofrecer un colorante fluorescente o terapéutico, se muestra en la Figura 1. Los SLNs constan de un lípido interior (por ejemplo, alcano lineal) permitiendo la incorporación de compuestos lipófilos (por ejemplo, tintes o agentes terapéuticos) y un exterior tensioactivo (tensioactivo no iónico, por ejemplo, lineal) rodeada de agua. En este estudio, SLNs se cargaron con un colorante fluorescente y se usan como un modelo para investigar las interacciones célula-partícula. Fibroblastos dérmicos humanos primarios y células dendríticas de ratones fueron expuestos a teñir-cargadas SLN lo largo del tiempo con el fin de caracterizar las interacciones con respecto a la toxicidad y la captación de partículas. A 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-diphenylphenyltetrazolium (MTT) ensayo fue utilized el fin de establecer los niveles de dosificación apropiados. La microscopía de fluorescencia y citometría de flujo fueron dos métodos empleados para examinar la captación de partículas in vitro. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53102/53102fig1.jpg" /> Figura 1. Esquema de GLC que muestra los componentes principales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53102/53102fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Rojo del Nilo (NiR)</td><td>Sigma</td><td>19123</td><td>BioReactivo, apto para fluorescencia, &ge; 98.0%</td></tr><tr><td>Heneicosane</td><td>Aldrich</td><td>286052</td><td>98%</td></tr><tr><td>Brij O10</td><td>Sigma</td><td>P6136</td><td>Brij 97, C18-1E10, Polioxietileno (10) éter de oleilo</td></tr><tr><td>Agua</td><td>Sigma</td><td>W3500</td><td>Filtrado estéril, Biorreactivo, apto para cultivo celular</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa 0.2 y micro; m Supor Membrana de baja unión a proteínas</td><td>Ciencias de la vida</td><td>PN4612</td><td>Nanotrac no pirogénico</td></tr><tr><td>Ultra&nbsp;</td>Número de serie <td>Microtrac</td><td>U1985IS</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>Calorímetro diferencial de barrido</td><td>Mettlet-Toledo</td><td></td><td>Instument</td></tr><tr><td>Fibroblastos humanos primarios&nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>C-004-5C</td><td>Neonatal (HDFn)</td></tr><tr><td>Medio 106</td><td>Life Technologies</td><td>M-106-500</td><td>Un medio líquido estéril para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos.</td></tr><tr><td>Kit de suplemento de crecimiento sérico bajo (LSGS Kit)</td><td>Life Technologies</td><td>S-003-K</td><td>Todos los componentes del kit completo de</td></tr><tr><td>ensayo de proliferación celular LSGS MTT</td><td>Trevigen</td><td>4890-025-K</td><td>Kit sensible para la medición de la proliferación celular basado en la reducción de la sal de tetrazolio, bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difenil-tetrazolio (MTT)</td></tr><tr><td>Lector de microplacas Safire2</td><td>Tecan</td><td>----</td><td>Instrumento</td></tr><tr><td>solución salina tamponada con fosfato&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P5493</td><td>Para biología molecular</td></tr><tr><td>Murina recombinante GM-CSF&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-03</td><td>>97%, por SDS-PAGE en condiciones reductoras y visualizado por tinte de plata.</td></tr><tr><td>IL-4 murina recombinante&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>214-14</td><td>>97%, por SDS-PAGE en condiciones reductoras y visualizado por tinte de plata.</td></tr></tbody></table>

sólido lípidos nanopartículas (glc) aplicaciones para intracelular de focalización

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Los vehículos de administración basados en nanopartículas han demostrado ser muy prometedores para las aplicaciones de orientación intracelular, proporcionando un mecanismo para alterar específicamente la señalización celular y la expresión génica. En una investigación previa, se demostró la síntesis de nanopartículas lipídicas sólidas (SLN) ultrapequeñas para aplicaciones de administración tópica de fármacos y detección de biomarcadores. Los SLN son un ejemplo bien estudiado de un sistema de administración de nanopartículas que se ha convertido en un prometedor vehículo de administración de fármacos. En este estudio, los SLN se cargaron con un tinte fluorescente y se utilizaron como modelo para investigar las interacciones entre partículas y células. Se utilizó el método de temperatura de inversión de fase (PIT) para la síntesis de poblaciones ultrapequeñas de nanopartículas biocompatibles. Se utilizó un ensayo de bromuro de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenilfeniltetrazolio (MTT) para establecer los niveles de dosificación adecuados antes de los estudios de interacción nanopartícula-célula. Además, los fibroblastos dérmicos humanos primarios y las células dendríticas de ratón se expusieron a SLN cargados de colorante a lo largo del tiempo y las interacciones con respecto a la toxicidad y la absorción de partículas se caracterizaron mediante microscopía de fluorescencia y citometría de flujo. Este estudio demostró que los SLN ultrapequeños, como sistema de administración de nanopartículas, son adecuados para la diana intracelular de diferentes tipos de células.

El método PIT fue utilizado para sintetizar los GLC y la temperatura de inversión de fase se determinó utilizando un baño de agua. Las muestras se calienta lentamente y suavemente agitado hasta que la solución parecía clara. La temperatura de inversión de fase para los GLC hechas usando lípidos heneicosane es de 45 ° C. La Tabla 1 resume el tamaño de partícula, polidispersidad, punto de fusión y el calor latente de fusión de los GLC. Los SLNs sintetizados usando las condiciones de procesamiento descrita...

En este estudio, se describió un método para sintetizar poblaciones ultrapequeñas de nanopartículas biocompatibles, así como varios métodos in vitro para evaluar sus interacciones celulares.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

El objetivo general de este procedimiento es sintetizar poblaciones ultra pequeñas de nanopartículas biocompatibles, caracterizar sus propiedades físicas e investigar las interacciones entre las partículas y las células. Esto se logra primero utilizando el método de temperatura de inversión de fase para sintetizar las nanopartículas lipídicas. Durante este proceso, el lípido y el tensioactivo se funden inicialmente juntos.Después de agregar una cantidad específica de agua, la mezcla se calienta hasta que ocurre la separación de fases. Luego, la mezcla se agita continuamente hasta que se forma una nanoemulsión y finaliza la síntesis de nanopartículas lipídicas sólidas o SLN. A continuación, se utiliza la dispersión dinámica de luz o DLS para medir el tamaño de las partículas y la polidispersidad.La calorimetría diferencial de barrido o DSC es una técnica adicional utilizada para determinar el punto de fusión y el calor latente de fusión con el fin de caracterizar aún más las partículas; finalmente, la microscopía de fluorescencia y la citometría de flujo pueden utilizarse para investigar las interacciones entre las partículas y las células. La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos de alta energía existentes, como la sonicación ultrasónica, la microfluídica y la homogeneización a alta presión, es que se trata de una técnica de síntesis relativamente suave, sencilla y escalable. Para sintetizar las LNS, combine 0.6 miligramos de un colorante fluorescente u otro compuesto lipofílico y 0.10 gramos del alcano lineal o lípido.En un vial de 15 mililitros, funda los componentes a 90 grados Celsius y agita; luego añade 0,11 gramos de un surfactante no iónico lineal. A continuación, mezcla la mezcla resultante a 90 grados Celsius y agita. Después, añade 1,79 gramos de agua estéril a la mezcla, calienta a 90 grados Celsius y monitorea visualmente la solución hasta que se observen dos fases.Ahora agite la mezcla hasta que se forme una nanoemulsión transparente. Prepare una nanoemulsión separada en paralelo sin agregar el colorante fluorescente para utilizarla como muestra control. Posteriormente, esterilice cada nanoemulsión utilizando un filtro estéril de 0,2 micrones.Utilice DLS para medir el tamaño de partícula y la dispersidad poli de las S lns usando un vaso en un instrumento diseñado para medir el tamaño de partícula antes de la medición de las muestras; se debe medir el tamaño de partícula de dos patrones conocidos siguiendo el protocolo del fabricante para la preparación y medición de los patrones. A continuación, mida las muestras tal como se prepararon para cada caso. Utilice un tiempo de análisis de 100 segundos, el índice de refracción del agua y la viscosidad del agua a 20 grados Celsius.Informe el diámetro promedio de las partículas y la dispersidad poli de la distribución del tamaño de partículas para investigar el comportamiento térmico de las S LNS utilizando DSC. Primero, pipetee las S LNS en un recipiente de aluminio de 40 microlitros con una masa de aproximadamente 25 miligramos. Selle herméticamente el recipiente utilizando una prensa de engarce universal para minimizar la pérdida de humedad durante el barrido de DSC. Antes de medir cada nanoemulsión de cinco a 80 grados Celsius, informe el punto de fusión y el calor latente de fusión a partir de la gráfica de DSC, donde el valle representa el punto de fusión y la integral del área bajo la curva.En el gráfico de DSC, dividido por la cantidad de material, representa el calor latente de fusión del cultivo. Inocule fibroblastos humanos primarios según las instrucciones del fabricante en medio líquido para el cultivo de fibroblastos dérmicos humanos. Suplemente con el kit de complemento de crecimiento de bajo suero y mantenga las células en una atmósfera humedecida a 37 grados Celsius, 5% dióxido de carbono, y realice subcultivos al alcanzar el 80% de confluencia para el análisis de MTT y de imágenes.En una placa de 96 pocillos a una densidad de 20.000 células por pocillo. Deje que las células se equilibren a 37 grados Celsius durante la noche antes de la exposición a SLN. En el tiempo cero, diluya los SLM en medio completo para alcanzar la concentración deseada de lípidos y agregue 10 microlitros por pocillo a cada pocillo replicado en la placa de 96 pocillos. Después de 24 horas de incubación con SLN, determine la viabilidad celular mediante el ensayo MTT según el protocolo del fabricante. Lave las células una vez y agregue 100 microlitros de medio fresco a cada pocillo.Se matarán los pocillos de control incubándolos en una solución de metanol al 70 % durante 10 minutos antes de reemplazarla con medio fresco. Añada el reactivo MTT a 10 microlitros por pocillo a cada pocillo de la microplaca e incube durante la noche a 37 grados Celsius; tras la incubación nocturna, solubilice la forma intracelular y los cristales con 100 microlitros de la solución detergente proporcionada. Según el protocolo del fabricante, incube las células en la solución detergente durante tres horas a temperatura ambiente antes de obtener los valores de absorbancia.Uso de un lector de microplacas para prepararse para la microscopía. Lave los fibroblastos dos veces con solución salina tamponada con fosfato estéril. Fije las células durante 10 minutos con metanol frío al 70 % en puntos de tiempo específicos tras la administración de lns a los fibroblastos.Después de 10 minutos, reemplace el metanol con solución salina tamponada con fosfato o PBS antes de capturar imágenes utilizando un microscopio invertido. Los SLN S sintetizados dieron como resultado SLN S de control con un diámetro medio de partícula de 18,59 y una polidispersidad de 5,83, y SLM cargados con rojo Nilo con un diámetro medio de partícula de 16,87 nanómetros y una polidispersidad de 4,47 utilizando un ensayo MTT. Se midió el efecto de respuesta a la dosis sobre el metabolismo celular, en el que un aumento en la concentración de partículas provocó una disminución en la viabilidad celular.No se observó ninguna diferencia en la toxicidad entre las células expuestas a SLN solos frente a SLN cargados con rojo Nilo. Paralelamente, se examinaron visualmente las células para verificar su adherencia al cultivo de tejidos. Se tomaron imágenes de poliestireno para demostrar tanto la morfología celular representativa como la incorporación de partículas fluorescentes a lo largo del tiempo, utilizando una dosis equivalente a cinco microgramos por mililitro.Se observó la captación de partículas lipídicas a las dos horas posteriores a la exposición. El nivel de incorporación de nanopartículas se determinó midiendo la intensidad de la fluorescencia del rojo Nilo en células dendríticas derivadas de médula ósea de ratón, o B MDCs, mediante citometría de flujo. Se observó una correlación directa entre la concentración de SNS utilizada y la cantidad de fluorescencia evaluada en las B MDCs.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo sintetizar poblaciones ultra pequeñas de nanopartículas biocompatibles, caracterizar sus propiedades físicas e investigar las interacciones entre partículas y células.

solid-lipid-nanoparticles-slns-for-intracellular-targeting

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Inyecciones retro-orbitales repetidas de complejos catiónicos liposomes/siRNA/ITSN-1s en ratones, cada 72 horas durante 24 días, eficiente entregar el dúplex siARN de la microvasculatura pulmonar del ratón la reducción de ARNm ITSN-1s y expresión de la proteína en un 75%. Esta técnica es altamente reproducible en un modelo animal, no tiene efectos adversos y evita accidentes mortales.

Silenciar a largo plazo de Intersectin-1 en los pulmones de ratones por entrega repetida de un siRNA específico a través de liposomas catiónicos. Evaluación de Efectos desmontables de Microscopía Electrónica

Informamos sobre una aplicación inteligente de nanotubos de carbono para la estabilización cinética de partículas lipídicas que contienen nanoestructuras autoensambladas en sus núcleos. La preparación de partículas lipídicas requiere concentraciones bastante bajas de nanotubos de carbono, lo que permite su uso en aplicaciones biomédicas, como la administración de fármacos.

Preparación fácil del ensamblado autónomos Internamente Lípidos Las partículas estabilizadas por nanotubos de carbono

El objetivo de este protocolo es utilizar liposomas catiónicos/aniónicos con un péptido neuro-dirigido como sistema de administración del SNC para permitir que el siRNA atraviese la BBB.  La optimización de un sistema de administración de tratamientos, como el siRNA, permitiría más opciones de tratamiento para los priones y otras enfermedades neurodegenerativas.

Entrega de Therapeutic siRNA al SNC Usando catiónicos y aniónicos Los liposomas

Una nanopartícula de cristal líquido (LCNP) nanotransportador es explotado como un vehículo para la administración controlada de una carga hidrofóbica en la membrana plasmática de las células vivas.

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

Aquí se describe un protocolo para la generación de nanoliposomas catiónicos, que se basan en el método de película seca y pueden ser utilizado para la caja fuerte y una entrega eficiente de in vitro transcribe ARN mensajero.

Generación de nanoliposomas catiónicos para la entrega eficiente de In Vitro transcribe ARN mensajero

Este artículo describe la encapsulación de falcarindiol en revestimiento lípido 74 nm nanopartículas. La absorción celular de las nanopartículas por las células de vástago humanas en gotitas del lípido es supervisada por la proyección de imagen confocal y fluorescente. Nanopartículas se fabrican por el método de la inyección rápida de cambio de disolvente, y su tamaño se mide con la técnica de dispersión de luz dinámica.

Absorción de nuevas nanopartículas recubiertas de lípidos que contienen Falcarindiol por células madre mesenquimales humanas

Se presentan los métodos para preparar y caracterizar las propiedades fisicoquímicas y la bioactividad de las nanopartículas de siRNA con respuesta al pH, que son neutralmente cargadas. Se discuten los criterios para los nanomedicamentos siRNA exitosos, como el tamaño, la morfología, la carga superficial, la carga de siRNA y el silenciamiento del gen.

La preparación de nanopartículas poliméricas con capacidad de pH, cargadas de neutralmente, para la entrega de siRNA citosólica

Este estudio describe la hidratación clásica utilizando el método de película lipídica delgada para la preparación de nanoliposomas seguido de caracterización de nanopartículas. Una proteína hidrofílica y globular de 47 kDa, la alcina, se encapsula con éxito como una estrategia para mejorar la estabilidad, evitar el aclaramiento rápido y promover la liberación controlada. El método se puede adaptar a la encapsulación de moléculas hidrofóbicas.

Preparación y caracterización de nanoliposomas para el atrapamiento de proteínas globulares hidrofílicas bioactivas

El protocolo presenta los parámetros optimizados para preparar liposomas termosensibles utilizando el dispositivo de microfluidos de micromezcladores de espiga escalonado. Esto también permite la co-encapsulación de doxorubicina y verde indocyanina en los liposomas y la liberación fototérmica-activada de doxorubicina para la liberación controlada / desencadenada de fármacos.

Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

Las nanopartículas lipídicas se desarrollan utilizando un enfoque de plataforma de mezcla microfluídica para la encapsulación de ARNm y ADN.

Formulación y caracterización de nanopartículas lipídicas para la administración de genes utilizando una plataforma de mezcla microfluídica

Se demuestra un protocolo detallado para sintetizar nanopartículas lipídicas (LNPs) utilizando tecnologías de mezcladores de chorro de impacto confinado (CIJ), incluyendo un CIJ de dos chorros y un mezclador de vórtice de entrada múltiple de cuatro chorros (μMIVM). Los mezcladores CIJ generan entornos de micromezcla turbulentos y reproducibles, lo que da como resultado la producción de LNP monodispersos.

Síntesis de nanopartículas lipídicas por flujo turbulento en mezcladores de chorro de impacto confinados

Aprende a sintetizar nanopartículas lipídicas biocompatibles mediante el método de inversión de fase por temperatura. Caracteriza sus propiedades físicas con dispersión de luz dinámica y estudia las interacciones celulares in vitro.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Explorar más videos