Producción microfluídica de liposomas sensibles a la temperatura que contienen lysolipido

El protocolo presenta los parámetros optimizados para preparar liposomas termosensibles utilizando el dispositivo de microfluidos de micromezcladores de espiga escalonado. Esto también permite la co-encapsulación de doxorubicina y verde indocyanina en los liposomas y la liberación fototérmica-activada de doxorubicina para la liberación controlada / desencadenada de fármacos.

Microfluidics es una técnica emergente para la preparación de liposomas de un tamaño de nanopartículas sintonizables y con gran reproducibilidad y escalabilidad. Este protocolo permite la producción continua alta a través de la producción de liposomas sensibles a baja temperatura para la co-carga con un fármaco quimioterapéutico como doxorubicina y un tinte fluorescente como el verde indocyanina. La preparación celular utiliza principalmente un enfoque de arriba hacia abajo, como la hidratación y extrusión de la película lipídica.

Sigue siendo difícil preparar lotes grandes y reproducibles para aplicaciones clínicas. Una de las principales ventajas de los microfluidos es la capacidad de manejar pequeños volúmenes de líquidos con alta capacidad de control en el espacio y el tiempo mientras opera de manera continua y automatizada. Demostrar el procedimiento con Calvin Cheung serán Guanglong Ma y Amalia Ruiz, los investigadores postdoctorales de mi laboratorio.

Para ensamblar las bombas de jeringa, utilice el cable de red bomba a bomba para conectar el puerto de la computadora de la bomba de jeringa secundaria al puerto de red de la bomba de jeringa maestra. Utilice el PC para bombear el cable de red para conectar el puerto de la computadora de la bomba maestra al puerto serie RS-232 del ordenador. Para montar el dispositivo micromezclador de micromezclador de espiga staggard, utilice una tuerca y una férula para conectar el tubo a cada una de las entradas y salidas del dispositivo.

A continuación, utilice una segunda tuerca y férula y un conjunto de unión para convertir el terminal de la tubería para ambas entradas en una luer hembra. Para configurar el software de control de la bomba, utilice el botón de configuración de la bomba de jeringa para asignar la dirección de la bomba de jeringa maestra y la bomba de jeringa secundaria a Ad:01 y Ad:02 respectivamente y, a continuación, abra el software de control de la bomba en el ordenador. Las dos bombas de jeringa deben detectarse automáticamente seguidas de un pitido.

Seleccione HSW Norm-Ject 5cc diámetro es igual a 12.45 para asignar el diámetro a 12.45 milímetros. Establezca la velocidad en 0,25 mililitros por minuto para la bomba uno y 0,75 mililitros por minuto para la bomba dos. Ajuste el volumen a cualquier valor superior a cinco mililitros y seleccione el modo de perfusión para ambas bombas.

A continuación, haga clic en establecer para confirmar la configuración. Para preparar una mezcla de lípidos LTSL10 o LTSL10 ICG, utilice una jeringa de bloqueo de luer de cinco mililitros para extraer un mililitro de mezcla de lípidos y otra jeringa de bloqueo de luer de cinco mililitros para extraer al menos tres mililitros de solución de sulfato de amonio. Deslice la brida del barril de la jeringa hasta el retenedor de la jeringa de la bomba para instalar las jeringas cargadas en las bombas de jeringa en posición vertical y conecte la brida del émbolo de la jeringa al bloque de empuje de la bomba y envuelva el otro extremo de la cinta de calentamiento y la sonda de temperatura con el termostato alrededor de la jeringa que contiene la solución lipídica.

Envuelva el extremo de la cinta térmica a la jeringa que contiene la solución acuosa, conecte la jeringa que contiene la mezcla de lípidos a la entrada de etanol y conecte la jeringa que contiene la solución de sulfato de amonio a la entrada acuosa. Ajuste la posición del émbolo para eliminar las burbujas de aire de las jeringas según sea necesario y enchufe y desenchufe la cinta de calentamiento en intervalos de 10 segundos hasta que la temperatura de las jeringas alcance unos 51 grados. Cuando el termostato muestre una temperatura adecuada, haga clic en ejecutar todo en el software de control de la bomba para ejecutar las bombas de jeringa y comprobar que el flujo de fluido está libre de burbujas de aire y cualquier fuga.

Recoja las muestras de liposomas en un vial y detenga o detenga la perfusión cuando la jeringa esté casi vacía. Anneal las soluciones liposomas recogidas en un baño de agua Celsius de 60 grados durante 1-1/2 horas antes de transferir las soluciones a tubos de diálisis para diálisis contra un litro de sulfato de amonio 240 mililitrolares durante al menos cuatro horas a 37 grados Centígrados. A continuación, almacene los liposomas purificados a cuatro grados centígrados.

Para la carga remota de los liposomas por gradiente de pH transmembrana, cargue 25 mililitros de HBS en la parte superior de una columna de cromatografía de exclusión de tamaño y permita que todo eluyente fluya a través de la columna. Cargue un mililitro de liposomas dializado en la columna. Cuando toda la solución lipídica haya pasado a través de la columna, agregue 1,5 mililitros de HBS fresco a la columna.

Cuando todo el búfer haya pasado a través de la columna, agregue tres mililitros de HBS fresco a la columna y recopile el eluyente. A continuación, agregue la solución DOX a una relación molar de 1:20 DOX:fosfolípidos a un mililitro de solución de liposoma de intercambio de búfer en un vial de Biju y coloque el vial en un baño de agua Celsius de 37 grados durante 1-1/2 horas. Después de la carga, purificar los liposomas por cromatografía de exclusión de tamaño como se acaba de demostrar.

Para la liberación del gatillo inducido por el calentamiento por calentamiento láser del contenido del liposoma, ajuste el baño de agua a 37 grados Celsius. Cuando la temperatura se haya estabilizado, agregue 200 microlitros de liposomas cargados con DOX a cada pozo de una placa clara de 96 pozos y coloque la placa en el baño de agua con el fondo sumergido en el agua. A continuación, ajuste la corriente del sistema láser a 2,27 amperios y coloque el colimador del sistema láser cinco centímetros verticalmente por encima de la superficie de la placa de 96 pozos.

Encienda el láser y utilice una sonda de temperatura de fibra óptica para controlar la temperatura una vez por minuto. A los cinco y 10 minutos, aspirar 10 microlitros de liposomas cargados doX de cada pozo de la placa clara de 96 pozos y añadir 190 microlitros de HBS a tres pozos individuales de una placa negra de 96 pozos. Para evaluar la liberación completa de fármacos, mezcle 10 microlitros de los liposomas con 170 microlitros de HBS y 20 microlitros de 1%Solución de detergente Triton X-100 en tres pozos individuales de la placa negra de 96 pozos.

A continuación, mida la intensidad de fluorescencia DOX en un lector de placas. La producción microfluídica de LTSL4 da como resultado una solución viscosa similar a un gel ilustrada por el gran número de burbujas de aire atrapadas, mientras que la preparación de LTSL10 da como resultado la formación de un líquido transparente no viscoso. La medición dinámica de dispersión de luz de LTSL10 preparada a 51 grados Celsius demuestra el diámetro y la dispersión del promedio Z esperados que indican el éxito del experimento.

Cuando LTSL10 se prepara a 20 grados Centígrados, sin embargo, se obtienen liposomas más grandes y más dispersos que resultan en un producto subóptimo. Los LTSL preparados por el método convencional de hidratación de película lipídica con extrusión demuestran una eficiencia de encapsulación DOX de 50-80%Con recocido, LTSL10 preparado por microfluidos resulta en un aumento significativo en la eficiencia de encapsulación DOX a una media de 85%indicando el éxito de la carga remota de DOX y la presencia del gradiente de pH transmembrana. Se ha determinado que el perfil de liberación DOX de LTSL10 es sensible a la temperatura.

LTSL10 tiene una transición de fase relativamente amplia con un inicio de 41,6 grados centígrados que alcanza un máximo de 42,6 grados centígrados. La eficiencia de la carga ICG depende de la concentración inicial de ICG y del tamaño y dispersión de las muestras. Además, la irradiación LTSL10 ICG con un láser infrarrojo cercano induce el calentamiento fototérmico desencadenando la liberación de DOX.

Al intentar este procedimiento, es importante asegurar un flujo de fluido estable de tal manera que la mezcla de líquido y por lo tanto la formación de liposomas permanecen reproducibles. El recocido y la diálisis liposomas son dos pasos importantes para garantizar una formulación liposoma estable con alta capacidad de carga. Las pruebas in vivo también se pueden llevar a cabo para evaluar la biodis distribución ltSL10, la liberación de fármacos y la actividad contra el cáncer.

Nuestro protocolo se puede utilizar para la producción microfluídica exitosa de liposomas termosensibles que contienen lisolípidos sin colesterol para aplicaciones de administración de fármacos.