Name: Rápido In Situ La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-23T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 49 s
Description: Aprenda una hibridación in situ rápida para neurociencia usando tejido cerebral prefijado con paraformaldehído en ratas. Este método simplificado detecta el gen htr2a con sondas de oligonucleótidos en menos de dos días.

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Este estudio fue apoyado por el NIH subvención (R15DA029863), la concesión de la Universidad Florida Atlantic investigación de pregrado (M30014) y la Escuela de Medicina Veterinaria de la beca de investigación de la Universidad de Ross. Nos gustaría dar las gracias al Instituto Nacional sobre el Abuso de Drogas (Rockville, MD) para proporcionar (±) 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA ±) para este trabajo.

Procedimientos de uso de animales se describen a continuación fueron aprobados por el Cuidado y Uso Comité Institucional Animal (IACUC) de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad de Ross y la Florida Atlantic University. Aunque se requieren técnicas y guantes estériles, el medio ambiente RNasa libre no es necesario durante el uso de este protocolo. 1. Preparación <ol><li> Preparación del tejido y seccionando <ol><li> Asignar ratas al azar en tres grupos: fresco / solución salina (SAL; 0,9% NaCl), el prefijo / SAL y el prefijo / 3,4-metilendioximetanfetamina (MDMA; véanse los detalles en el cuadro 1). </li><li> Administrar tres dosis de 1 ml / kg SAL y 10 mg / kg por vía intraperitoneal MDMA, respectivamente, a los grupos SAL y MDMA en el intervalo de 2 hr. Permitir a los animales para sobrevivir el tratamiento durante 6 días. </li><li> El día 7, administrar 100 mg / kg de ketamina en combinación de 5 mg / kg de xilazina por vía intraperitoneal a las ratas para una anestesia profunda (es decir, la pérdida de abrir y cerrar la córnea y tail pellizcar reflejos). </li><li> Para el grupo fresca / SAL, decapitar rápidamente ratas y retire el cerebro para la prueba cerebral fresco (ver detalles en la referencia 5). </li><li> Para los grupos / MDMA prefijo / SAL y prefijados, hacer un corte a lo largo del esternón unos 10 -12 cm y luego exponer la punta del esternón. </li><li> Mantenga el extremo del esternón con una pinza hemostática y cortar el diafragma lateralmente en ambos lados con unas tijeras afiladas y luego se corta hacia arriba a través de las costillas y paralelo a los pulmones. </li><li> Con una mano, sostenga la punta ventral del corazón con pequeñas pinzas. Con la otra mano, perforar el ventrículo izquierdo con una G aguja de la jeringa 18 (nótese el lado del adaptador de la aguja está conectado con una manguera de silicio en forma de Y a SAL y paraformaldehído contenedores enfriado con hielo y bombas peristálticas; ver la referencia 9). </li><li> Encienda la bomba de SAL en el nivel medio de la velocidad de flujo (~ 5 ml / min) y la punción de la aurícula derecha con las pinzas para permitir el escape de retorno circulación. Mantener SAL perfusión durante 30 min. </li><li> Encienda la bomba de paraformaldehído en el nivel medio y deje que el helado de paraformaldehído al 4% a perfundir el animal durante 30 minutos. </li><li> Retire instrumento perfusión y decapitar al animal. Hacer un posteroanterior cortar a través de la línea media del cráneo, y luego la solapa del cráneo para exponer la cavidad 10 del cráneo. </li><li> Retire el cerebro con una espátula de la cavidad del cráneo y el cerebro colocar en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de paraformaldehído al 4%. Mantener el cerebro dentro del tubo que contiene paraformaldehído-4 ºC en refrigerador durante 24 hr. </li><li> Mueva el cerebro en un tubo de centrífuga de 50 ml que contiene 25 ml de solución de sacarosa al 30% a 4 ºC durante 3 días. Por último, guarde el cerebro dentro de bolsas de plástico a -80 ° C hasta su uso. </li><li> Montar el cerebro en un plato con los medios de incrustación y congelar los medios de incrustación contienen cerebral en un criostato a una temperatura de -26 ºC. Cortar el congeló frescan cerebral en 20 micras secciones y el cerebro paraformaldehído-prefijo en secciones de 10 micras. La transferencia de la sección a un portaobjetos de microscopio RT tocando la diapositiva a la sección. </li><li> Aire seco a temperatura ambiente durante 4 hr. Guarde la sección diapositivas en una bolsa cerrada sellada a -80 ° C hasta su uso. </li></ol></li><li> Deshidratación <ol><li> Tome diapositivas de la -80 ° C congelador y asignar secciones en una de tres pruebas: HT2A, PPIB (control positivo) o dapB (control negativo); marca y las secciones de la etiqueta con un bolígrafo (no utilizan un lápiz). Sumergir los portaobjetos en 100% de alcohol a temperatura ambiente durante 5 min. Se secan los portaobjetos durante 5 minutos en una campana de humos. </li></ol></li><li> Pretratamiento <ol><li> Pipeta 20 l de reactivo de pretratamiento-1 (inactivación de la fosfatasa alcalina) a las secciones en las diapositivas. Colocar los portaobjetos en un carril de bastidor en una bandeja de humedad (nótese que la bandeja se cubre con una tapa para mantener una alta humedad para prevenir la evaporación de la reacción solution). </li><li> Agite suavemente la bandeja de la humedad en un agitador horizontal a una velocidad baja durante 10 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada (ddH 2 O) durante 2 min. Sumergir el portaobjetos en un vaso de 200 ml que contiene 150 ml de la Pretratamiento-2 reactivo (ruptura de los enlaces cruzados inducidos por la fijación de paraformaldehído). Hervir las diapositivas para un total de 5 min a 100 ºC (restauración inducida por calor de la estructura del ARN 11). </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min. Colocar los portaobjetos en 100% de alcohol durante 5 min. Secar los portaobjetos durante 5 minutos en la campana de humos. Use un lápiz hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido (por ejemplo, las estructuras no-corticales, incluyendo el tálamo y el hipotálamo como se indica en la figura 2). </li><li> Pipeta 10 l de la Pretratamiento-3 reactivo (aumentos en la penetración de la sonda) a cada área seleccionada, y cubrir la bandeja de humedad con la tapa. Colocar la bandeja en el horno de hibridaciónequipado con el agitador horizontal y fijar la temperatura del horno a 40 ºC; agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Lavar los portaobjetos dos veces con ddH2O durante 2 min. </li></ol></li></ol> 2. Hibridación y Amplificación <ol><li> Pipeta 10 l de HTR2A, PPIB y dapB reactivos de sonda, respectivamente, en las áreas seleccionadas. Cubrir la bandeja de la humedad con la tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente en el agitador horizontal fijado a una velocidad baja. Incubar los portaobjetos a 40 ºC en el horno durante 2 horas. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-1 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-2 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces won un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de reactivo de amplificación-3 en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 30 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-4 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a 40 ºC durante 15 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipeta 10 l de la amplificación-5 de reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. Pipetear 10 l de la amplificación-6 reactivo en cada área seleccionada, agitar e incubar los portaobjetos a TA durante 15 min. Lavar los portaobjetos dos veces con un tampón de lavado durante 2 min. </li></ol> 3. Detección de la señal <ol><li> Pipeta 10 l de reactivo Roja para cada área seleccionada (Tenga en cuenta que el reactivo es una mezcla de rojo-B y Rojo-A en una proporción de 1:60 y se debe utilizar immediately). Colocar el portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a temperatura ambiente y agitar suavemente a baja velocidad durante 10 minutos. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces con (ddH 2 O) durante 10 min. Secar los portaobjetos a 60 ºC en el horno durante 15 minutos. Colocar los portaobjetos en xileno bajo la campana de humos durante 5 min. Pipeta 20 l de los medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cubrir con un cubreobjetos. </li></ol> Capture 4. Imagen <ol><li> Tome microfotografías digitales de las áreas seleccionadas (por ejemplo, el hipotálamo, las Figuras 1 y 3) con un aumento de 4 × 20 × y lentes del objetivo. Guarde el archivo de imagen. </li></ol> Análisis de partículas 5. Imagen <ol><li> Arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana principal de ImageJ. Ir a la barra de menú y seleccione &#39;Imagen&#39;, al lado seleccione &#39;Tipo&#39; en el menú desplegable y seleccione &quot;8 bits&quot;. </li><li> Seleccione &#39;Ajuste&#39;, a continuación, seleccione &#39;Threshold &#39;para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior del cuadro de diálogo de manera que se elimina el fondo no deseado. Ir a la barra de menú y seleccione &quot;Analizar&quot; y seleccione &quot;Analizar Partículas &#39;para abrir un segundo cuadro de diálogo. </li><li> Ajuste del tamaño de partícula en el 10, al lado seleccione &#39;Mostrar esboza &quot;y seleccione&quot; Mostrar resultados &quot;y&quot; cajas Resumir&#39;. Por último, haga clic en &#39;Aceptar&#39; para ver los datos de partículas en los cuadros de diálogo. </li></ol> Cálculo 6. Hoja de cálculo <ol><li> Introduzca los datos en la hoja de Excel y un promedio de la cantidad de partículas en el grupo SAL como línea de base. Calcule el nivel de porcentaje de cada sección y hacer una gráfica en consecuencia (Figura 4). </li></ol>

<ol><li>Muzyk, A. J., Jakel, R. J., Preud'homme, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serotonin+syndrome+after+a+massive+overdose+of+controlled-release+paroxetine%5BTitle%5D)+AND+%22Psychosomatics%22%5BJournal%5D)">Serotonin syndrome after a massive overdose of controlled-release paroxetine.</a> Psychosomatics. 51, 437-442 (2010).</li>
<li>Davies, O., Batajoo-Shrestha, B., Sosa-Popoteur, J., Olibrice, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Full+recovery+after+severe+serotonin+syndrome%2C+severe+rhabdomyolysis%2C+multi-organ+failure+and+disseminated+intravascular+coagulopathy+from+MDMA%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Lung%22%5BJournal%5D)">Full recovery after severe serotonin syndrome, severe rhabdomyolysis, multi-organ failure and disseminated intravascular coagulopathy from MDMA.</a> Heart Lung. 43, 117-119 (2014).</li>
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<li>Smithies, V., Broadbear, J., Verdejo-Garcia, A., Conduit, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysfunctional+overnight+memory+consolidation+in+ecstasy+users%5BTitle%5D)+AND+%22J+Psychopharmaco%22%5BJournal%5D)">Dysfunctional overnight memory consolidation in ecstasy users.</a> J Psychopharmaco. 28, 751-762 (2014).</li>
<li>Winzer-Serhan, U. H., Broide, R. S., Chen, Y., Leslie, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+sensitive+radioactive+in+situ+hybridization+using+full+length+hydrolyzed+riboprobes+to+detect+%CE%B12+adrenoceptor+subtype+mRNAs+in+adult+and+developing+rat+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Brain+Res+Proto%22%5BJournal%5D)">Highly sensitive radioactive in situ hybridization using full length hydrolyzed riboprobes to detect α2 adrenoceptor subtype mRNAs in adult and developing rat brain.</a> Brain Res Brain Res Proto. 3, 229-241 (1999).</li>
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<li>Carter, B. S., Fletcher, J. S., Thompson, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+messenger+RNA+expression+by+in+situ+hybridization+using+RNA+probes+synthesized+via+in+vitro+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22Method%22%5BJournal%5D)">Analysis of messenger RNA expression by in situ hybridization using RNA probes synthesized via in vitro transcription.</a> Method. 52, 322-331 (2010).</li>
<li>Mijnster, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+and+cellular+distribution+of+serotonin+5-hydroxytryptamine2a+receptor+mRNA+in+the+nucleus+accumbens%2C+olfactory+tubercle%2C+and+caudate+putamen+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neuro%22%5BJournal%5D)">Regional and cellular distribution of serotonin 5-hydroxytryptamine2a receptor mRNA in the nucleus accumbens, olfactory tubercle, and caudate putamen of the rat.</a> J Comp Neuro. 389, 1-11 (1997).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain+region-specific+alterations+of+5-HT2A+and+5-HT2C+receptors+in+serotonin+transporter+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroche%22%5BJournal%5D)">Brain region-specific alterations of 5-HT2A and 5-HT2C receptors in serotonin transporter knockout mice.</a> J Neuroche. 84, 1256-1265 (2003).</li>
<li>Horner, K. A., Gilbert, Y. E., Noble, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+regulation+of+5-HT2A+receptor+mRNA+expression+following+withdrawal+from+a+chronic+escalating+dose+regimen+of+D-amphetamine%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Re%22%5BJournal%5D)">Differential regulation of 5-HT2A receptor mRNA expression following withdrawal from a chronic escalating dose regimen of D-amphetamine.</a> Brain Re. 1390, 10-20 (2011).</li>
<li>Mocci, G., Jimenez-Sanchez, L., Adell, A., Cortes, R., Artigas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+5-HT2A+receptors+in+prefrontal+cortex+pyramidal+neurons+projecting+to+nucleus+accumbens.+Potential+relevance+for+atypical+antipsychotic+action%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacolog%22%5BJournal%5D)">Expression of 5-HT2A receptors in prefrontal cortex pyramidal neurons projecting to nucleus accumbens. Potential relevance for atypical antipsychotic action.</a> Neuropharmacolog. 79, 49-58 (2014).</li>
<li>Reneman, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+acute+and+chronic+effects+of+MDMA+%28%27Ecstasy%27%29+on+cortical+5-HT2A+receptors+in+rat+and+human%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">The acute and chronic effects of MDMA ('Ecstasy') on cortical 5-HT2A receptors in rat and human.</a> 26, 387-396 (2002).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

Una de las principales preocupaciones de la prueba de hibridación in situ es elegir las técnicas apropiadas utilizadas para la preservación del ARN debido a las enzimas ARNasa. Es bien sabido que estas enzimas están ampliamente presentes en las células y el medio ambiente, lo que puede afectar los resultados. Sin embargo, la actividad enzimática se puede distinguir rápidamente colocando el tejido en la solución de hielo seco / alcohol5,12. Aunque la preservación rápida es fundamental para la hibridaci...

El síndrome de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT) es un trastorno neurológico agudo causado por drogas promotoras de 5-HT, como los antidepresivos1, mientras que también ocurre en situaciones de uso de MDMA con fines recreativos2. Los mecanismos moleculares responsables de los cambios de humor, los déficits de aprendizaje y memoria que ocurren en asociación con el síndrome agudo no se conocen bien3,4. La hibridación in situ es una poderosa herramienta de investigación que permite la detección y cuantificación de ARNm específicos expresados potencialmente a nivel de una sola célula. La forma convencional de realizar la hibridación in situ es utilizar una ribosonda marcada con radiactividad que hibrida específicamente el gen de interés. Sin embargo, un inconveniente importante es que el método requiere pasos complicados y lentos de preparación e hibridación de la sonda, así como el acceso a tejidos frescos congelados mantenidos en un ambiente libre deARNasa 5,6. 
Las sondas de oligonucleótidos se han desarrollado recientemente para hibridar fragmentos de ARN más cortos que los necesarios para las ribosondas7. Además, las sondas producen una señal de fondo baja sin sacrificar la especificidad8. Esta tecnología de sonda recientemente desarrollada se puede utilizar en hibridación in situ en tejidos cerebrales con prefijo de paraformaldehído comúnmente disponibles en laboratorios de inmunocitoquímicos.
Aquí, describimos un protocolo para la hibridación in situ utilizando sondas de oligonucleótidos en cerebro de rata con prefijo de paraformaldehído y comparamos los hallazgos con los observados en un cerebro fresco congelado5,6. Este protocolo se utiliza para probar la hipótesis de que el abuso de sustancias MDMA causa cambios en el gen del receptor 5-HT2A htr2a mRNA en el cerebro. Comenzamos el procedimiento con tratamiento con MDMA seguido de perfusión tisular con paraformaldehído del animal, hibridación in situ de la sonda thr2a y análisis de los datos. Obsérvese que dapB (el gen bacteriano que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa) se utiliza como control negativo, y ppiB (gen de mantenimiento que codifica para la peptidilprolil isomerasa B) como control positivo.

<table><tbody><tr><td>Sonda de control negativo de RNAscope-DapB</td><td>Diagnóstico celular avanzado, INC</td><td>310098</td><td></td></tr><tr><td>RNAscope Pretreat 4</td><td>Diagnóstico celular avanzado, INC</td><td>320046</td><td></td></tr><tr><td>Kit de reactivos RNAscope 2.0 HD - Rojo</td><td>Diagnóstico de células avanzado, INC</td><td>310036</td><td></td></tr><tr><td>Sonda de RNAscope - Rn-PPIB</td><td>Diagnóstico celular avanzado, INC</td><td>313921</td><td></td></tr><tr><td>Rata Htr2a</td><td>Diagnóstico celular avanzado, INC</td><td>300031</td><td></td></tr><tr><td>Criostato</td><td>Leica</td><td>CM 1850</td><td></td></tr><tr><td>Agitador horizontal</td><td>VWR</td><td>88032-088</td><td></td></tr><tr><td>Horno de hibridación</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>222000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Plus</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo hidrofóbico</td><td>Vector</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Olympus</td><td>Provis AX70</td><td></td></tr></tbody></table>

rápido<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación usando sondas de oligonucleótidos en cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome

3,4-La toxicidad de la metilendioximetanfetamina (MDMA; éxtasis) puede causar cambios específicos de la región en la expresión del ARNm serotoninérgico debido al síndrome agudo de serotonina (5-hidroxitriptamina; 5-HT). Esta hipótesis puede probarse utilizando hibridación in situ para detectar el gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a. En el pasado, tales procedimientos, que utilizaban ribosondas radiactivas, eran difíciles debido al complicado flujo de trabajo que necesita varios días para realizarse y la dificultad adicional de que la técnica requería el uso de tejidos frescos congelados mantenidos en un entorno libre de ARNasa. Recientemente, el desarrollo de sondas cortas de oligonucleótidos ha simplificado los procedimientos de hibridación in situ y ha permitido el uso de secciones cerebrales prefijadas con paraformaldehído, que están más ampliamente disponibles en los laboratorios. Aquí, describimos un protocolo detallado utilizando sondas de oligonucleótidos no radiactivos en los tejidos cerebrales prefijados. Las sondas de hibridación utilizadas para este estudio incluyen dapB (un gen bacteriano que codifica para la dihidrodipicolinato reductasa), ppiB (un gen de mantenimiento que codifica para la peptidilprolil isomerasa B) y htr2a (un gen de serotonina que codifica para los receptores 5-HT2A). Este método es relativamente simple, barato, reproducible y requiere menos de dos días para completarse.

Utilizando las sondas de ARN oligonucleótido (&lt;25 nt), la hibridación se puede detectar como puntos rojos en las células hipotalámicas preparados a partir de los cerebros congelados paraformaldehído prefijado y frescas. Las moléculas de ARNm HTR2A están presentes en algunas células (indicados por flechas continuas), pero no en otros (flechas abiertas). Hemos observado que no hay diferencia entre el paraformaldehído-prefijado y los tejidos congelados frescos (Figura 1). A la hibridación exito...

Este protocolo describe un método de hibridación in situ rápido y simplificado ideal para el cerebro con prefijo de paraformaldehído, reduciendo así la necesidad de pasos complejos prolongados mientras se utilizan tejidos frescos congelados. El método se valida mediante la identificación del gen del receptor de serotonina 5-HT2A htr2a en ratas.

Rápido<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

3,4-Methylenedioxymethamphetamine (MDMA; ecstasy) toxicity may cause region-specific changes in serotonergic mRNA expression due to acute serotonin ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una hibridación in situ rápida en tejido cerebral prefijado con paraformaldehído. Esto se logra primero deshidratando secciones de tejido cerebral y tratando las secciones con los reactivo de pretratamiento uno, dos y tres. El segundo paso consiste en hibridar las secciones con sondas oligonucleotídicas primarias y luego con las sondas segunda, tercera y cuarta.A continuación, agregue el sustrato rojo rápido para detectar el ARN diana. El paso final consiste en cuantificar el nivel de señales de ARNm mediante el software Image J. En última instancia, se pueden obtener los cambios en la expresión génica del ARN mediante la comparación entre los grupos experimental y control.La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es relativamente sencilla, económica, reproducible y tarda menos de dos días en completarse. Este trabajo fue desarrollado por mí mismo y por John Jay Lenan de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Ross, y por Jean Soza y RU Tao del Colegio de Medicina de la Universidad Atlántica de Florida. En este procedimiento, saque cuatro portaobjetos de las cajas de portaobjetos almacenadas en el congelador a menos 80 grados Celsius.Asigne las secciones a las pruebas de P-P-I-B-D-A-P-B y HT, marque dos genes A y rotúlelos con un bolígrafo. A continuación, sumerja los portaobjetos en alcohol al 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, seque los portaobjetos durante cinco minutos en la campana extractora; para el tratamiento previo, agregue 20 microlitros del reactivo de pretratamiento uno a cada sección, y coloque los portaobjetos sobre un soporte en una bandeja húmeda.Agite suavemente la bandeja de humedad en un agitador horizontal a baja velocidad durante 10 minutos. Luego lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitados de 1000 mililitros que contenga 450 mililitros del reactivo de pretratamiento dos.A continuación, hierva los portaobjetos durante un total de cinco minutos a 100 grados Celsius para restaurar la estructura del ARN. Después, lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos cada vez. Coloque los portaobjetos en alcohol al 100% durante cinco minutos.Luego, seque las laminillas durante cinco minutos. En la campana extractora, utilice un rotulador hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido. Posteriormente, pipetee 10 microlitros del reactivo de pretratamiento tres en cada área seleccionada para aumentar la penetración de la sonda y cubra la bandeja de humedad con su tapa.A continuación, coloque la bandeja en el horno de hibridación equipado con un agitador horizontal. Ajuste la temperatura del horno a 40 grados Celsius y agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Posteriormente, lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos cada vez. En este paso, pipetee 10 microlitros de la sonda P-P-I-B-D-A-P-B o HTR dos A en las áreas seleccionadas.Luego, cubra la bandeja de humedad con una tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente las laminillas en la agitadora horizontal a baja velocidad mientras se incuban en el horno a 40 grados Celsius durante dos horas. A continuación, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, y agregue mediante pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación uno en cada área seleccionada.Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 30 minutos. Luego lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, y agregue por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación dos en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 15 minutos.Después de eso, lave las laminillas dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos. Cada vez, agregue mediante pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación tres en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 30 minutos.Luego, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Aplique por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación cuatro en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 15 minutos.A continuación, lave las laminillas dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos. Aplique por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación 5 en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a temperatura ambiente durante 30 minutos.Posteriormente, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Aplique 10 microlitros del reactivo de amplificación seis en cada área seleccionada mediante pipeta. Agite e incube las laminillas a temperatura ambiente durante 15 minutos.Luego, lave las laminillas nuevamente dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos cada vez. Ahora, pipetee 10 microlitros del reactivo rojo en cada área seleccionada, coloque las laminillas en la bandeja húmeda sobre el agitador horizontal a temperatura ambiente y agite suavemente a baja velocidad durante 10 minutos. A continuación, lave las laminillas dos veces con agua doblemente destilada durante 10 minutos.Cada vez, seque las laminillas a 60 grados Celsius en la estufa durante 15 minutos. Después, coloque las laminillas en xileno en la campana extractora durante cinco minutos. A continuación, agregue mediante pipeta 20 microlitros de medio de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cúbrala con un cubreobjetos.En este paso, arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana principal de imagen J. Vaya a la barra de menú y seleccione imagen. A continuación, seleccione tipo en el menú desplegable y elija ocho bits.A continuación, seleccione ajustar y luego seleccione umbral para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior en el cuadro de diálogo para que se elimine el fondo no deseado. Vaya a la barra de menú y seleccione Analizar, luego seleccione analizar partículas para abrir un segundo cuadro de diálogo.Establezca el tamaño de partícula en 10. A continuación, seleccione mostrar contornos y seleccione mostrar resultados y resumir cuadros. Por último, haga clic en aceptar para ver los datos de las partículas en los cuadros de diálogo.Para el cálculo en hoja de cálculo, introduzca los datos en la hoja de Excel y calcule el promedio del número de partículas en el grupo de solución salina como línea base. Luego, calcule el porcentaje de cada sección y elabore un gráfico en consecuencia. A continuación se muestran las vistas al microscopio óptico de las señales de hibridación indicadas por los puntos rojos.Los tejidos se fijaron previamente con paraformaldehído en ratas profundamente anestesiadas, previamente tratadas con solución salina y MDMA. Las sondas de oligonucleótidos utilizadas son D-A-P-B-P-P-I-B y HT dos A. Esta figura muestra el efecto sobre la expresión génica hipotalámica de HT dos A en ratas previamente tratadas con MDMA; se observó una reducción del 20 % en la expresión de HT dos A. Esta técnica facilita a los investigadores en el campo de la neurociencia la medición de la expresión génica de ARN mensajero, mediante hibridación in situ en tejido cerebral previamente fijado con paraformaldehído.

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Neurociencia

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Este video demuestra la detección de la síntesis de ARN del receptor de serotonina utilizando sondas de oligonucleótidos en tejido cerebral de rata afectado por el síndrome de serotonina. El protocolo incluye pretratamiento de tejidos, hibridación de sondas y detección enzimática para visualizar y cuantificar la expresión del ARN del receptor de serotonina bajo un microscopio.

Hibridación in situ mediante sondas de oligonucleótidos para estudiar la expresión de ARN en secciones de cerebro de rata

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

situ (ISH) &gt; 'jove_content permite la visualización de ARN en células y tejidos. Aquí mostramos cómo la combinación de RNAscope ISH con inmunohistoquímica o colorantes histológicos se puede utilizar con éxito para detectar ARNm localizados en axones en secciones de cerebros humanos y de ratones.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Aplicamos estimulación magnética transcraneal repetitiva (EMTr) al hemisferio unilateral del cerebro de rata, colocando una bobina en forma de 8 de 25 mm a 1 cm lateral al vértice en la línea biauricular y angulando la bobina 45°. Se utilizó un sistema interno de refrigeración por agua para la EMTr durante más de 20 minutos.

La estimulación magnética transcraneal repetitiva en el Hemisferio unilateral de cerebro de rata

Identificación del receptor de dopamina D1-alfa en el Núcleo accumbens es fundamental para clarificar la disfunción del receptor D1 durante una enfermedad del sistema nervioso central. Se realizó un análisis para un RNA nuevo en situ hibridación para visualizar solo moléculas de ARN en un área específica del cerebro.

Identificación del Receptor de dopamina D1-alfa en roedores núcleo Accumbens por una innovador ARN In Situ la tecnología de detección

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

DetectSyn es un ensayo fluorescente rápido e imparcial que mide los cambios en el número relativo de sinapsis (compromiso pre y postsináptico) en todos los tratamientos o estados de enfermedad. Esta técnica utiliza una técnica de ligadura de proximidad que se puede utilizar tanto en neuronas cultivadas como en tejido fijo.

DetectSyn: un método fluorescente rápido e imparcial para detectar cambios en la densidad de la sinapsis

Establecimos un ensayo de hibridación in situ dúplex para mapear las isoformas de los receptores de insulina IR-A e IR-B en el plexo coroideo murino, superando las limitaciones de los métodos tradicionales. Este enfoque de alta resolución revela la expresión específica de isoformas, ofreciendo nuevos conocimientos sobre la señalización de la insulina en el cerebro y posibles terapias dirigidas a isoformas para trastornos neurológicos.

Visualización precisa de los receptores de insulina A y B en el cerebro murino con un ensayo de hibridación in situ de ARN

Aprenda una hibridación in situ rápida para neurociencia usando tejido cerebral prefijado con paraformaldehído en ratas. Este método simplificado detecta el gen htr2a con sondas de oligonucleótidos en menos de dos días.

Rápido In Situ La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina (Video) | JoVE Journal

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