Rápido

El objetivo general de este procedimiento es realizar una hibridación in situ rápida en tejido cerebral prefijado con paraformaldehído. Esto se logra primero deshidratando secciones de tejido cerebral y tratando las secciones con los reactivo de pretratamiento uno, dos y tres. El segundo paso consiste en hibridar las secciones con sondas oligonucleotídicas primarias y luego con las sondas segunda, tercera y cuarta.

A continuación, agregue el sustrato rojo rápido para detectar el ARN diana. El paso final consiste en cuantificar el nivel de señales de ARNm mediante el software Image J. En última instancia, se pueden obtener los cambios en la expresión génica del ARN mediante la comparación entre los grupos experimental y control.

La principal ventaja de esta técnica frente a los métodos existentes es que es relativamente sencilla, económica, reproducible y tarda menos de dos días en completarse. Este trabajo fue desarrollado por mí mismo y por John Jay Lenan de la Escuela de Medicina Veterinaria de la Universidad Ross, y por Jean Soza y RU Tao del Colegio de Medicina de la Universidad Atlántica de Florida. En este procedimiento, saque cuatro portaobjetos de las cajas de portaobjetos almacenadas en el congelador a menos 80 grados Celsius.

Asigne las secciones a las pruebas de P-P-I-B-D-A-P-B y HT, marque dos genes A y rotúlelos con un bolígrafo. A continuación, sumerja los portaobjetos en alcohol al 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos. Luego, seque los portaobjetos durante cinco minutos en la campana extractora; para el tratamiento previo, agregue 20 microlitros del reactivo de pretratamiento uno a cada sección, y coloque los portaobjetos sobre un soporte en una bandeja húmeda.

Agite suavemente la bandeja de humedad en un agitador horizontal a baja velocidad durante 10 minutos. Luego lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitados de 1000 mililitros que contenga 450 mililitros del reactivo de pretratamiento dos.

A continuación, hierva los portaobjetos durante un total de cinco minutos a 100 grados Celsius para restaurar la estructura del ARN. Después, lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos cada vez. Coloque los portaobjetos en alcohol al 100% durante cinco minutos.

Luego, seque las laminillas durante cinco minutos. En la campana extractora, utilice un rotulador hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido. Posteriormente, pipetee 10 microlitros del reactivo de pretratamiento tres en cada área seleccionada para aumentar la penetración de la sonda y cubra la bandeja de humedad con su tapa.

A continuación, coloque la bandeja en el horno de hibridación equipado con un agitador horizontal. Ajuste la temperatura del horno a 40 grados Celsius y agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Posteriormente, lave los portaobjetos dos veces con agua doblemente destilada durante dos minutos cada vez. En este paso, pipetee 10 microlitros de la sonda P-P-I-B-D-A-P-B o HTR dos A en las áreas seleccionadas.

Luego, cubra la bandeja de humedad con una tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente las laminillas en la agitadora horizontal a baja velocidad mientras se incuban en el horno a 40 grados Celsius durante dos horas. A continuación, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, y agregue mediante pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación uno en cada área seleccionada.

Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 30 minutos. Luego lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, y agregue por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación dos en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 15 minutos.

Después de eso, lave las laminillas dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos. Cada vez, agregue mediante pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación tres en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 30 minutos.

Luego, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Aplique por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación cuatro en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a 40 grados Celsius durante 15 minutos.

A continuación, lave las laminillas dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos. Aplique por pipeta 10 microlitros del reactivo de amplificación 5 en cada área seleccionada. Agite e incube las laminillas a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Posteriormente, lave las laminillas dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Aplique 10 microlitros del reactivo de amplificación seis en cada área seleccionada mediante pipeta. Agite e incube las laminillas a temperatura ambiente durante 15 minutos.

Luego, lave las laminillas nuevamente dos veces con el tampón de lavado durante dos minutos cada vez. Ahora, pipetee 10 microlitros del reactivo rojo en cada área seleccionada, coloque las laminillas en la bandeja húmeda sobre el agitador horizontal a temperatura ambiente y agite suavemente a baja velocidad durante 10 minutos. A continuación, lave las laminillas dos veces con agua doblemente destilada durante 10 minutos.

Cada vez, seque las laminillas a 60 grados Celsius en la estufa durante 15 minutos. Después, coloque las laminillas en xileno en la campana extractora durante cinco minutos. A continuación, agregue mediante pipeta 20 microlitros de medio de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cúbrala con un cubreobjetos.

En este paso, arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana principal de imagen J. Vaya a la barra de menú y seleccione imagen. A continuación, seleccione tipo en el menú desplegable y elija ocho bits.

A continuación, seleccione ajustar y luego seleccione umbral para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior en el cuadro de diálogo para que se elimine el fondo no deseado. Vaya a la barra de menú y seleccione Analizar, luego seleccione analizar partículas para abrir un segundo cuadro de diálogo.

Establezca el tamaño de partícula en 10. A continuación, seleccione mostrar contornos y seleccione mostrar resultados y resumir cuadros. Por último, haga clic en aceptar para ver los datos de las partículas en los cuadros de diálogo.

Para el cálculo en hoja de cálculo, introduzca los datos en la hoja de Excel y calcule el promedio del número de partículas en el grupo de solución salina como línea base. Luego, calcule el porcentaje de cada sección y elabore un gráfico en consecuencia. A continuación se muestran las vistas al microscopio óptico de las señales de hibridación indicadas por los puntos rojos.

Los tejidos se fijaron previamente con paraformaldehído en ratas profundamente anestesiadas, previamente tratadas con solución salina y MDMA. Las sondas de oligonucleótidos utilizadas son D-A-P-B-P-P-I-B y HT dos A. Esta figura muestra el efecto sobre la expresión génica hipotalámica de HT dos A en ratas previamente tratadas con MDMA; se observó una reducción del 20 % en la expresión de HT dos A. Esta técnica facilita a los investigadores en el campo de la neurociencia la medición de la expresión génica de ARN mensajero, mediante hibridación in situ en tejido cerebral previamente fijado con paraformaldehído.