Rápido In Situ La hibridación usando sondas de oligonucleótidos en Cerebro paraformaldehído-prefijo de ratas con síndrome de serotonina

El objetivo general de este procedimiento es realizar una hibridación rápida en C dos en tejido cerebral con prefijo de aldehído paraforme. Esto se logra deshidratando primero las secciones de tejido cerebral y tratándolas con un pretratamiento de uno, dos y tres reactivos. El segundo paso es hibridar las secciones con sondas de oligonucleótidos primarios y luego segundas, terceras y cuartas sondas.

A continuación, agregue sustrato rojo rápido para detectar el ARN objetivo. El paso final es cuantificar el nivel de señales de ARNm con el software Image J. En última instancia, los cambios en la expresión génica del ARN se pueden obtener comparando los grupos experimental y de control.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes es que es relativamente sencilla, barata, reproducible y tarda menos de dos días en completarse. Este trabajo fue desarrollado por John Jay Lenan y yo, de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Ross, y Jean Soza y RU Tao, de la Facultad de Medicina de la Universidad Atlántica de Florida. En este procedimiento, su deshidratación toma cuatro portaobjetos de las cajas de portaobjetos del microscopio almacenadas en el congelador a 80 grados centígrados negativos.

Asigne las secciones a las pruebas de P-P-I-B-D-A-P-B y HT, marque dos genes A y etiquételas con un bolígrafo. A continuación, sumerja los portaobjetos en alcohol al 100% a temperatura ambiente durante cinco minutos. A continuación, seque los portaobjetos durante cinco minutos en la campana extractora para el pretratamiento pipetea 20 microlitros del pretratamiento un reactivo en cada sección, coloque los portaobjetos en un riel de rejilla en una bandeja de humedad.

Agite suavemente la bandeja de humedad en un agitador horizontal a baja velocidad durante 10 minutos. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos. Sumerja los portaobjetos en un vaso de precipitados de 1000 mililitros que contenga 450 mililitros del reactivo de pretratamiento dos.

A continuación, hierva los portaobjetos durante un total de cinco minutos a 100 grados centígrados para restaurar la estructura del ARN. Después de eso, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos cada vez. Coloque los portaobjetos en alcohol al 100% durante cinco minutos.

A continuación, seca los portaobjetos durante cinco minutos. En la campana extractora, use un bolígrafo hidrofóbico para dibujar un círculo alrededor del área seleccionada en la sección de tejido. A continuación, pipetear 10 microlitros de tres reactivos de pretratamiento en cada zona seleccionada para aumentar la penetración de la sonda y cubrir la bandeja de humedad con una tapa.

A continuación, coloque la bandeja en el horno de hibridación equipado con un agitador horizontal. Ajuste la temperatura del horno a 40 grados centígrados y agite suavemente la bandeja durante 30 minutos. Después, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante dos minutos cada vez. En este paso, pipetee 10 microlitros de sonda P-P-I-B-D-A-P-B o HTR dos A en las áreas seleccionadas.

A continuación, cubra la bandeja de humedad con una tapa para evitar la evaporación del reactivo. Agite suavemente los portaobjetos en el agitador horizontal a baja velocidad mientras los incuba a 40 grados centígrados en el horno durante dos horas. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, pipetee 10 microlitros de amplificación un reactivo en cada área seleccionada.

Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 30 minutos. A continuación, lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez, pipetear 10 microlitros de la amplificación dos reactivos en cada zona seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 15 minutos.

Después de eso, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Cada vez, pipetee 10 microlitros de la amplificación tres reactivos en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 30 minutos.

A continuación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Pipetear 10 microlitros de amplificación de cuatro reactivos en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a 40 grados centígrados durante 15 minutos.

A continuación, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación cinco en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 30 minutos.

Posteriormente, lave los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos. Pipetear 10 microlitros del reactivo de amplificación seis en cada área seleccionada. Agite e incube los portaobjetos a temperatura ambiente durante 15 minutos.

A continuación, vuelva a lavar los portaobjetos dos veces con tampón de lavado durante dos minutos cada vez. Ahora pipetee 10 microlitros del reactivo rojo en cada área seleccionada, coloque los portaobjetos en la bandeja de humedad en el agitador horizontal a temperatura ambiente y agite suavemente a baja velocidad durante 10 minutos. A continuación, lave los portaobjetos dos veces con agua destilada doble durante 10 minutos.

Cada vez, seque los portaobjetos a 60 grados centígrados en el horno durante 15 minutos. Después de eso, coloque los portaobjetos en xileno en la campana extractora durante cinco minutos. A continuación, pipetee 20 microlitros de medios de montaje a base de xileno en cada área seleccionada y cúbrala con un cubreobjetos.

En este paso, arrastre y suelte el archivo de imagen en la ventana J de la imagen principal. Vaya a la barra de menú y seleccione imagen. A continuación, seleccione el tipo en el menú desplegable y seleccione ocho bits.

A continuación, seleccione ajustar y, a continuación, seleccione umbral para abrir el cuadro de diálogo. Ajuste el valor de la barra inferior en el cuadro de diálogo para que se elimine el fondo no deseado. Vaya a la barra de menú y seleccione Analizar, luego seleccione analizar partículas para abrir un segundo cuadro de diálogo.

Establezca el tamaño de partícula en 10. A continuación, seleccione Mostrar esquemas y seleccione Mostrar resultados y cuadros de resumen. Por último, haga clic en Aceptar para ver los datos de partículas en los cuadros de diálogo.

Para el cálculo de la hoja de cálculo, ingrese los datos en la hoja de Excel y promedie el número de partículas en el grupo salino como línea de base. A continuación, calcule el nivel porcentual de cada sección y haga un gráfico en consecuencia. Aquí están las vistas microscópicas de luz de las señales de hibridación indicadas por los puntos rojos.

Los tejidos fueron prefijados con aldehído paraforme en ratas profundamente anestesiadas previamente tratadas con solución salina y MDMA. Las sondas de oligonucleótidos utilizadas son D-A-P-B-P-P-I-B, y HT dos A. Esta figura muestra el efecto sobre la expresión del gen hipotalámico HT dos A en ratas previamente tratadas con MDMA y una reducción del 20% en HT dos veces, se observó una expresión. Esta técnica facilita a los investigadores en el campo de la neurociencia la medición de la expresión génica del mensajero R a, utilizando in situ en la paraforma, el tejido cerebral con el prefijo de altura.