Name: Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior In Situ La hibridación en larvas lamprea de mar (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-10-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 11 s
Description: Aprende técnicas de sección completa de médula espinal y disección cerebral en lampreas marinas para estudiar regeneración neuronal. Este método permite visualizar neuronas espinales grandes mediante hibridación in situ en montaje completo.

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Apoyado por las subvenciones de los NIH NS14837, R01 NS38537, R24 HD050838 al Dr. Michael E. Selzer; Subvención de investigación Shriners SHC-85220 al Dr. Michael E. Selzer; y la Subvención de Investigación Shriners SHC-85310 al Dr. Michael I. Shifman. El Dr. Antón Barreiro-Iglesias contó con el apoyo de la Fundación Barrié (España) y la Xunta de Galicia (Galicia, España).

Ver Tabla 1 para todos los materiales utilizados en este protocolo. Los experimentos fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad de Temple. 1. Animales <ol><li> Obtener wildtype lampreas marinas larvales (Petromyzon marinus L.), 10 - 14 cm de largo (4-7 años) de los arroyos que alimentan el lago Michigan, a partir de afluentes del río Delaware (Pennsylvania) o arroyos en Maine. </li><li> En el laboratorio, las larvas de mantener en grupos de 50 a 100 animales en tanques de agua dulce de 50 galones a 16 ° C. Línea de los tanques con una pulgada de grava para que las larvas madriguera en, y el agua se filtra el carbón y se acondicionó con piedras de aire durante al menos 48 horas para eliminar el cloro y otras impurezas antes de colocar las lampreas en ellos. No hay necesidad de alimentar a los animales, que reciclan su propio detritus, hasta el día de uso. </li></ol> 2. completa EspinalLa transección del cable <ol><li> Antes de la cirugía de la médula espinal preparar una solución de Ringer lamprea con la siguiente composición: NaCl 110 mM, KCl 2,1 mM, 2,6 mM CaCl2, 1,8 mM de MgCl 2 y 10 mM de tampón Tris; pH 7,4. </li><li> Para realizar la transección de la médula espinal, colocar las larvas en un pequeño recipiente que se anestesiaron con metanosulfonato de tricaína 1% en solución de Ringer enfriada con hielo. </li><li> Una vez anestesiado el lugar de los animales en una placa de Petri llena hasta la mitad con Sylgard (de silicona) y utilizan 4 pins de insectos (0,15 mm de diámetro) para mantener a los animales en posición durante la cirugía (uno se coloca en el hocico del animal, uno en la cola y dos en el nivel de la 5 ª agallas). Llene la caja de Petri casi hasta la parte superior con una solución de Ringer. Coloque el plato con la larva en el hielo mientras se realiza la cirugía bajo el microscopio estereoscópico. </li><li> Para realizar la transección de la médula espinal dorsal, la línea media, hacer una incisión longitudinal con un escalpelo (# 11) a nivel de la 5 ªGill para visualizar la médula espinal. Inicialmente la piel está abierta mediante la inserción de la punta de la cuchilla de escalpelo hacia arriba y entonces el tejido muscular se corta muy suavemente hasta la médula espinal puede ser visto desde arriba. Moda dos ganchos de los pasadores de insectos y los utilizan para sostener las paredes del cuerpo abierto mientras se realiza la transección de la médula espinal. </li><li> Completamente seccionar la médula espinal a nivel de la 5 ª agallas mediante el uso de un par de tijeras (Castroviejo 8 #), insertar las tijeras perpendicularmente a la médula espinal. La médula espinal tiene que ser completamente seccionado con un corte limpio. Visualice los extremos cortados de la médula espinal en el microscopio estereoscópico para confirmar que la médula espinal ha sido completamente seccionado. Entonces, realinear los extremos cortados de la médula espinal después de la transección mediante el uso de un par de pinzas (# 5). </li><li> Después de realizar la transección de la médula espinal a cerrar la herida en la pared dorsal del cuerpo con un par de pinzas finas y poner las larvas en hielo durante 1 hora para permitir que la herida to secar. Ponga un pedazo de papel de filtro entre el hielo y las larvas y remojarlo con solución de Ringer lamprea. La baja temperatura mantiene los animales vivos, al mismo tiempo que permite que la herida se seque al aire y por lo tanto ayudando a prevenir infecciones. </li><li> A continuación, traslado a las larvas de los tanques pequeños (1 larva por tanque) con agua helada durante 24 horas. </li><li> Examine el lesionado larvas de 1 día después de la transección espinal para conductualmente confirmar que no hay movimiento caudal al sitio de la lesión. Un transección de la médula espinal se considera completa si la larva puede moverse sólo su cabeza rostral al sitio de la lesión (en el nivel de la 5 ª agallas). Si este es el caso de las larvas ahora puede ser transferido a los tanques (1 larva por tanque) con agua dulce a temperatura ambiente (23 ° C) para permitir que se recuperen de los puntos de tiempo seleccionados. </li><li> Durante el período de recuperación de cambiar el agua cada 2 o 3 días. </li></ol> 3. Cerebro disección y preparación deCerebro de hibridación in situ <ol><li> En los puntos de tiempo deseados después de la lesión volver a anestesiar las lampreas de mar de larvas y el lugar y el pin en la placa de Petri con solución de Ringer para llevar a cabo la disección del cerebro como anteriormente. </li><li> Para diseccionar el cerebro, en primer lugar hacer una incisión transversal con el bisturí entre la fosa nasal y el órgano pineal. Desde aquí comenzar a cortar el tejido que rodea el cerebro mediante el uso de un par de tijeras Castroviejo mientras la mantiene con un par de fórceps. </li><li> Una vez que el cerebro está expuesto, retire el plexo coroideo mediante el uso de un par de fórceps y el uso de los ganchos para difundir la cabeza del animal y exponer los nervios craneales. Luego, cortar transversalmente la médula espinal con las tijeras de Castroviejo. Mantenga la médula espinal con un par de fórceps durante el uso de otro par de pinzas para cortar los nervios craneales para diseccionar el cerebro fuera. </li><li> Después de la disección, poner el cerebro en un pequeño trozo de silicona y mantenerlo en su posición insertando 2 insect alfileres en los bulbos olfatorios y 1 en la médula espinal. Luego, cortar la parte posterior y comisuras cerebrotectal del cerebro a lo largo de la línea media dorsal con las tijeras y desviar las placas alares lateralmente y el pin plano para la silicona con 4 pins de insectos (Figura 2). </li><li> Transferir la pieza de silicona con el cerebro a un tubo que contiene un 4% de paraformaldehído en tampón fosfato salino (pH 7,4) que se fije en Temparature ambiente durante 3 h en un rotador. </li><li> Después de la fijación utilizar el cerebro para wholemount hibridación in situ como se describe anteriormente (Swain et al., 1994). Los cerebros de los animales de control con operación simulada o se debe ejecutar siempre en paralelo con los cerebros de los animales heridos. El cerebro de larvas wholemounted puede ser estudiada mediante hibridación in situ debido a su forma plana y delgada y también debido a la ausencia de mielina 10, que hace que el cerebro bastante translúcido. </li></ol>

<ol><li>Rodicio, M. C., Barreiro-Iglesias, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lampreys+as+an+animal+model+in+regeneration+studies+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurol%22%5BJournal%5D)">Lampreys as an animal model in regeneration studies after spinal cord injury.</a> Rev Neurol. 55, 157-166 (2012).</li>
<li>Davis, G. R. Jr, McClellan, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extent+and+time+course+of+restoration+of+descending+brainstem+projections+in+spinalcord-transected+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Extent and time course of restoration of descending brainstem projections in spinalcord-transected lamprey.</a> J Comp Neurol. 344, 65-82 (1994).</li>
<li>Jacobs, A. J., Swain, G. P., Snedeker, J. A., Pijak, D. S., Gladstone, L. J., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+neurofilament+expression+selectively+in+regenerating+reticulospinal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Recovery of neurofilament expression selectively in regenerating reticulospinal neurons.</a> J Neurosci. 17, 5206-5220 (1997).</li>
<li>Shifman, M. I., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+netrin+receptor+UNC-5+in+lamprey+brain+modulation+by+spinal+cord+transection%5BTitle%5D)+AND+%22Neurorehabil+Neural+Repair%22%5BJournal%5D)">Expression of the netrin receptor UNC-5 in lamprey brain modulation by spinal cord transection.</a> Neurorehabil Neural Repair. 14, 49-58 (2000).</li>
<li>Barreiro-Iglesias, A., Laramore, C., Shifman, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sea+lamprey+UNC5+receptors+cDNA+cloning%2C+phylogenetic+analysis+and+expression+in+reticulospinal+neurons+at+larval+and+adult+stages+of+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The sea lamprey UNC5 receptors cDNA cloning, phylogenetic analysis and expression in reticulospinal neurons at larval and adult stages of development.</a> J Comp Neurol. 520, 4141-4156 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Yumu, lR. E., Laramore, C., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+repulsive+guidance+molecule+RGM+and+its+receptor+neogenin+after+spinal+cord+injury+in+sea+lamprey%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Expression of the repulsive guidance molecule RGM and its receptor neogenin after spinal cord injury in sea lamprey.</a> Exp Neurol. 217, 242-251 (2009).</li>
<li>Busch, D. J., Morgan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synuclein+accumulation+is+associated+with+cell-specific+neuronal+death+after+spinal+cord+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Synuclein accumulation is associated with cell-specific neuronal death after spinal cord injury.</a> J Comp Neurol. 520, 1751-1771 (2012).</li>
<li>Shifman, M. I., Zhang, G., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Delayed+death+of+identified+reticulospinal+neurons+after+spinal+cord+injury+in+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Delayed death of identified reticulospinal neurons after spinal cord injury in lampreys.</a> J Comp Neurol. 510, 269-282 (2008).</li>
<li>Swain, G. P., Jacobs, A. J., Frei, E., Selzer, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+in+situ+hybridization+in+wholemounted+lamprey+brain+neurofilament+expression+in+larvae+and+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Exp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">A method for in situ hybridization in wholemounted lamprey brain neurofilament expression in larvae and adults.</a> Exp. Neurol. 126, 256-269 (1994).</li>
<li>Bullock, T. H., Moore, J. K., Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+myelin+sheaths%3A+both+lamprey+and+hagfish+lack+myelin%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Evolution of myelin sheaths: both lamprey and hagfish lack myelin.</a> Neurosci Lett. 48, 145-148 (1984).</li>
<li>Cohen, A. H., Kiemel, T., Pate, V., Blinder, J., Guan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temperature+can+alter+the+function+outcome+of+spinal+cord+regeneration+in+larval+lampreys%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Temperature can alter the function outcome of spinal cord regeneration in larval lampreys.</a> Neuroscience. 90, 957-965 (1999).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Aquí presentamos un protocolo detallado para realizar un corte transversal de la médula espinal completa y la disección del cerebro posterior en las lampreas marinas larvales. Este procedimiento permite analizar las diferencias en la expresión génica entre identificable de la médula espinal que se proyectan neuronas después de la lesión de la médula espinal por medio de un cerebro todo el montaje hibridación in situ. El paso crítico en el procedimiento es el correcto funcionamiento de una transección completa de la médu...

En los mamíferos lesión de la médula espinal (SCI) es una enfermedad devastadora que conduce a la pérdida permanente de la función por debajo del sitio de la lesión, porque los axones lesionados no se regeneran a través de la zona de trauma y se vuelven a conectar a sus objetivos adecuados. En contraste con los mamíferos, lampreas recuperar la locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. 1 Curiosamente, lampreas tienen un conjunto de 36 neuronas de la médula espinal que se proyecta que son individualmente identificable en todo el montaje preparaciones cerebrales debido a su gran tamaño 2,3 (Figura 1) . Todas estas neuronas espinales están proyectando axotomizadas por transección de la médula espinal completa de alto nivel. Estudios anteriores de nuestro grupo y otros han demostrado que, incluso en la presencia de la recuperación funcional después de SCI algunas de estas neuronas muestran una capacidad regenerativa muy bajo (se consideran &quot;malos regeneradores&quot;), mientras que otros por lo general se regeneran su axón a través del sitio de la lesión (se consideran &quot;gregeneradores ood &quot;). 2,3 Esta característica hace que las lampreas un modelo vertebrado interesante estudiar las diferencias en la expresión génica entre el bien y el mal regenerador neuronas espinales que se proyecta que a su vez dará lugar a las diferencias en la capacidad regenerativa intrínseca de las neuronas que intentan regenerar sus axones en el mismo entorno extrínseca. 1 El uso de este modelo que hemos demostrado anteriormente que-espinal proyectando las neuronas con baja capacidad regenerativa muestran la expresión de los receptores de moléculas guía axonal como UNC5 4,5 y neogenin, 6 que median la acción inhibitoria de netrina y RGM respectivamente. Además, mediante el uso de este método nuestro grupo ha demostrado también que sólo las buenas regeneradores muestran una recuperación de la expresión de neurofilamentos después de la lesión y durante el proceso de regeneración. Recientemente, Busch y Morgan 7 han demostrado por inmunofluorescencia que los malos regeneradores muestran un increasexpresión ed de sinucleína después de la lesión, que se ha relacionado por los autores sobre el hecho de que las &quot;malas regenerador&quot; neuronas espinales proyectar mueren lentamente después de una médula espinal transección completa 5,7,8. Así, el modelo de la lamprea de una lesión completa de la médula espinal se ha convertido en un modelo muy útil para entender lo que hace que un cable de la proyección de las neuronas de la médula de un &quot;mal regenerador&quot; después de axotomía. Para llevar a cabo nuestros estudios estamos llevando a cabo un protocolo completo de la médula espinal y cirugía transección una disección del cerebro posterior en los momentos deseados después de la lesión para realizar wholemount hibridación in situ. En el presente artículo metodológico se presenta un protocolo detallado para el correcto cumplimiento de la cirugía de lesión medular completa en las lampreas de larvas, el mantenimiento posterior de los animales y la disección del cerebro final y preparación del cerebro para una wholemount hibridación in situ. Un protocolo detallado a performa la wholemount hibridación in situ en el cerebro de las lampreas de larvas ha sido informado previamente. 9 Además, este protocolo para la lesión de la médula espinal y la disección del cerebro puede también ser utilizado entonces para procesar los cerebros de inmunohistoquímica u otros métodos histológicos.

<table><tbody><tr><td>Sulonato de metano tricaína</td><td>Spectrum</td><td>TR108</td><td>Solución saturada de benzocaína en PBS para sacrificio</td></tr><tr><td>Bisturí #3</td><td>Fine Science Tools (FST)</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Cuchillas para bisturí: #11</td><td>Fine Science Tools&nbsp;</td><td>10011-00</td><td></td></tr><tr><td>Tijeras Castroviejo #8</td><td>Herramientas de Ciencia Fina&nbsp;</td><td>15002-08</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas #4 & #5</td><td>Dumont, Suiza</td><td>Roboz RS4955</td><td>#4 para la disección de la médula espinal; #5 para la extirpación de meninges</td></tr><tr><td>Microscopio de disección</td><td>Olympus</td><td>SZ51</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning Co.</td><td>184</td><td></td></tr><tr><td>Pasadores para insectos 0,15, 0,20 mm</td><td>Austerlitz</td><td>Sin catálogo #</td><td>0,15 mm para sujetar el cerebro y la médula espinal; 0,20 mm para el cuerpo</td></tr><tr><td>7 ml Tubos de centelleo de PEAD con tapas</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-337-1</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído 16%</td><td>Electrónica Microscopy Science (EMS)</td><td>19210</td><td>Diluido al 4% en PBS</td></tr></tbody></table>

lesiones de la médula espinal completo y protocolo disección del cerebro por wholemount posterior<em&gt; in situ</em&gt; la hibridación en larvas lamprea de mar

Complete Spinal Cord Injury and Brain Dissection Protocol for Subsequent Wholemount In Situ Hybridization in Larval Sea Lamprey

Después de una lesión completa de la médula espinal, las lampreas de mar en primera están paralizados por debajo del nivel de corte transversal. Sin embargo, se recuperan locomoción después de varias semanas, y esto se acompaña de la regeneración corta distancia (unos pocos mm) de los axones propioespinal y axones-espinales que se proyecta desde el tronco cerebral. Entre los 36 grandes neuronas espinales proyectar identificables, algunos son buenos y otros son regeneradores malas regeneradores. Estas neuronas pueden ser más fáciles de identificar en las preparaciones del SNC wholemount. Con el fin de comprender los mecanismos de las neuronas intrínsecas que favorecen o inhiben la regeneración de axones después de la lesión del SNC en los vertebrados, determinamos diferencias en la expresión génica entre los regeneradores buenas y malas, y cómo la expresión es influenciada por transección de la médula espinal. Este documento ilustra las técnicas de larvas vivienda y recientemente transformado lampreas marinas adultas en depósitos de agua potable, la producción de transección medular completa bajo visión microscópica, y la preparación brain y wholemounts médula espinal para la hibridación in situ. En pocas palabras, los animales se mantienen a 16 &#160; ° C y anestesiado en el 1% de benzocaína en Ringer lamprea. La médula espinal se secciona con tijeras de iridectomía a través de un enfoque dorsal y se permite que el animal pueda recuperarse en depósitos de agua potable a 23 ° C. Para la hibridación in situ, los animales se reanesthetized y el cerebro y el cordón removidos a través de un enfoque dorsal.

Como ejemplo de los resultados que se pueden obtener cuando se utiliza este método, las imágenes representativas de cerebros wholemounted que muestran la expresión de las transcripciones neogenin en neuronas de la médula espinal identificables de proyección del control y 2 semanas después de la lesión de larvas lampreas de mar se muestran en la Figura 2. Los lectores pueden consultar a un estudio previo 6 informar de la relación entre la expresión de neogenin después de una transección comple...

Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación en larvas lamprea de mar

After a complete spinal cord injury, sea lampreys at first are paralyzed below the level of transection. However, they recover locomotion after several ...

El objetivo general de este procedimiento es realizar una transección completa de la médula espinal y una disección del encéfalo para el estudio de la guía de los axones tras una lesión. Esto se logra primero transeccionando la médula espinal de un lamprea a nivel de la quinta branquia. Luego, el encéfalo se disecciona y fija sobre sylgard.Después de fijar el cerebro, este puede almacenarse en metanol o usarse inmediatamente para hibridación in situ. Finalmente, se pueden observar cambios en la expresión de receptores de guía axonal en una vértebra en regeneración tras una lesión de la médula espinal. La ventaja de la técnica que vamos a demostrar hoy frente a métodos más convencionales como el corte en parafina o el corte con criostato es que permite visualizar todo el cerebro, incluyendo neuronas que se proyectan hacia la médula espinal, que son grandes e identificadas.Quien demuestra el procedimiento es la Dra. Kathy Zang, científica investigadora en nuestro laboratorio. Desde los arroyos que alimentan los afluentes del lago Michigan hasta el río Delaware en Pensilvania, o arroyos en Maine, se obtuvieron larvas silvestres de lamprea de mar, de la especie Petromyzon marinus.Las larvas de cuatro a siete años miden entre 10 y 14 centímetros de longitud y son lo suficientemente grandes para realizar la lesión y la disección. Manténgalas en grupos de cincuenta y dos, un centenar, en tanques de agua dulce de 50 galones a 16 grados Celsius.El tanque requiere un sustrato de grava de una pulgada para que la lamprea pueda excavar. Toda el agua que se agregue al tanque debe estar acondicionada con filtrado de carbón y aireación durante al menos 48 horas antes de añadirla. Siempre que los animales se utilicen dentro de un año, no es necesario alimentarlos para este procedimiento. Tenga listo una solución de Ringer recién preparada.Primero transfiera una lamprea a una solución acuosa saturada de benzocaína. Una vez anestesiada, transfiérala a un recipiente lleno hasta la mitad con Silgard. Coloque el recipiente sobre hielo y cúbralo con hielo.Anilina fría. Sujete el animal con tres alfileres entomológicos de 0,15 de diámetro, uno en el hocico y dos en la quinta branquia. A continuación, colóquelo bajo un microscopio estereoscópico para la cirugía.Comience utilizando un escalpelo número 11 para realizar una incisión longitudinal a lo largo de la línea media dorsal, al nivel de la quinta branquia. Esto revelará la médula espinal al hacer esta incisión. Utilice dos ganchos hechos de alfileres para insectos para sujetar las paredes corporales, empleando el retractador Castro número ocho y tijeras.Realice un corte perpendicular a través de la médula espinal expuesta. Inspeccione los extremos cortados de la médula espinal para asegurarse de que la sección sea completa. Luego, utilizando fórceps, vuelva a alinear los extremos cortados y cierre la herida.Transfiera la larva de lamprea a un trozo de papel de filtro empapado en solución de Ringer. Coloque el preparado sobre una cama de hielo durante una hora para que la herida se seque. Transfiera la larva a su propio pequeño tanque con agua helada.Deje que sane durante 24 horas. Después de 24 horas, verifique si hay movimientos cordales en el sitio de la transección. Si se observan movimientos, la transección fue incompleta.Si no los hay, entonces el transecto fue adecuado y el animal puede trasladarse a un tanque a temperatura ambiente para su recuperación mientras este se recupera. Cambie el agua cada dos o tres días. Una vez que el animal transectado se haya recuperado suficientemente, anestésielo y prepárelo para la disección como se describió anteriormente.Para diseccionar el cerebro, comience con una incisión transversal entre la nariz y el órgano pineal. Luego, con tijeras de Castro, corte el tejido que rodea al cerebro mientras sujeta al animal. Con pinzas.Las estructuras ovales blancas a ambos lados del tronco encefálico son las cápsulas óticas. Una vez expuesto el cerebro, use pinzas para eliminar el plexo coroideo. A continuación, use ganchos de alfiler modificados para separar la cabeza del animal y exponer los nervios craneales.Luego, corte la médula espinal transversalmente con las tijeras mientras la sostiene con pinzas. Corte los nervios craneales para diseccionar el cerebro. A continuación, transfiera el cerebro a un pequeño trozo de silicona y fíjelo allí.Usando un alfiler de insecto en la médula espinal y otro a través de uno de los bulbos olfatorios. Luego, con las tijeras, corte el comisura interbulbar, el comisura del protector cerebral y el oex del tronco encefálico a lo largo de la línea media dorsal. Una vez cortadas las comisuras y el oex, desvíe lateralmente las placas A LR y fíjelas planas sobre la silicona con un total de siete alfileres de insecto: dos en los bulbos olfatorios, dos en los bordes del corte de la comisura del protector cerebral, dos en el oex extendido y uno en la línea media de la médula espinal.Ahora, utilizando reactivos libres de ARN, fije la preparación en paraformaldehído al 4 % a temperatura ambiente durante tres horas con agitación suave. Luego, los cerebros pueden analizarse mediante hibridación in situ doble utilizando el método descrito; la expresión de transcritos de neogenina se identificó en la médula espinal y en neuronas proyectantes de animales control y de animales lesionados. Dos semanas después de la lesión, se muestra aquí un control representativo no lesionado.Tras la transección completa de la médula espinal, se observaron cambios en la expresión del receptor de neogenina. Después de dos semanas, el receptor de neogenina en el grupo no control se expresó preferentemente en malos regeneradores como las neuronas M1 I uno I dos I cuatro, o MTH. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para nuestra capacidad de explorar la expresión de receptores de orientación, receptores para sulfato de condroitina, proteoglicanos y la activación de bases de cast en el mismo cerebro.

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Este video muestra un método para investigar la lesión cerebral de las larvas de pez cebra utilizando microscopía electrónica de transmisión de barrido (STEM) a gran escala, una técnica que combina elementos de microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía electrónica de transmisión (TEM) para producir imágenes de alta resolución. Describe los pasos involucrados en la preparación de muestras y la adquisición de imágenes STEM de alta resolución para identificar lesiones cerebrales.

Investigación de una lesión cerebral de larva de pez cebra mediante microscopía electrónica de transmisión de barrido a gran escala

Los procesos de desarrollo tales como la proliferación, el patrón, la diferenciación, y guía de axones se pueden modelar fácilmente en la médula espinal pez cebra. En este artículo se describe un procedimiento de montaje para los embriones de pez cebra, que optimiza la visualización de estos eventos.

La disección y de montaje lateral de embriones de pez cebra: Análisis para el Desarrollo de la médula espinal

Después de la transección de la médula, el pez cebra adulto tenga la recuperación funcional a las seis semanas posteriores a la lesión. Para aprovechar las ventajas de la transparencia de las larvas y una recuperación más rápida, se presenta un método para seccionar la médula espinal de las larvas. Después de transección, se observa la recuperación sensorial a partir de los 2 días después de la lesión, y el movimiento C-doble por 3 días después de la lesión.

La transección de la médula espinal en el pez cebra larval

El registro de las corrientes de Ca2+ en la membrana frontal de liberación presináptica es clave para una comprensión precisa de la entrada de Ca2+ y la liberación de neurotransmisores. Presentamos una disociación aguda de la médula espinal de la lamprea que produce axones reticuloespinales aislados funcionales, lo que permite el registro directo desde la membrana de la cara de liberación de las terminales presinápticas individuales.

Agudo Disociación de lamprea reticuloespinal axones para permitir la grabación del estreno de la cara de la membrana de individuales Terminales presinápticos funcionales

Presentamos un protocolo que utiliza microscopía de lapso de tiempo de excitación de dos fotones para visualizar simultáneamente la dinámica de las lesiones de axones y mielinas en tiempo real. Este protocolo propuesto permite estudiar los factores intrínsecos y extrínsecos que pueden influir en el destino de los axones mielinizados centrales después de una lesión y contribuir a la discapacidad clínica permanente.

Una Ex Vivo Médula espinal inducida por láser Lesiones modelo para evaluar los mecanismos de degeneración axonal en tiempo real

Las enfermedades desmielinizantes se pueden modelar en animales mediante la aplicación focal de lisolecitina en el SNC. Una sola inyección de lisolecitina en la médula espinal del ratón produce una lesión que se repara espontáneamente con el tiempo. El objetivo es estudiar los factores implicados en la desmielinización y la remielinización, y probar agentes para mejorar la reparación.

Experimental La desmielinización y remielinización de la Médula Espinal murino por inyección Focal de lisolecitina

La microscopía electrónica (EM) 2D a gran escala, o nanotomía, es la aplicación en todo el tejido de la EM de resolución a nanoescala. Aquí describimos un método universal de nanotomía aplicado para investigar el cerebro de las larvas de pez cebra en la salud y en caso de lesión cerebral no invasiva.

A gran escala de barrido Microscopía Electrónica de Transmisión (Nanotomy) de pez cebra cerebrales saludables y lesionados

Este manuscrito describe métodos para registros electrofisiológicos de neuronas espinales de embriones de pez cebra y larvas. La preparación mantiene las neuronas in situ y a menudo implica la disección mínimo. Estos métodos permiten para el estudio electrofisiológico de una variedad de neuronas de la médula, de la adquisición inicial de la excitabilidad eléctrica a través de las primeras etapas larvales.

El pez cebra<em&gt; In Situ</em&gt; Médula Espinal Preparación para Registros electrofisiológicos de Spinal Sensory y neuronas motoras

Modificamos el modelo de caída de peso de Marmarou para peces cebra adultos para examinar una amplia gama de patologías después de una lesión cerebral traumática por fuerza contundente (LCT) y los mecanismos subyacentes a la regeneración neuronal posterior. Este modelo de LCT de fuerza contundente es escalable, induce una LCT leve, moderada o grave y recapitula la heterogeneidad de lesiones observada en una LCT humana.

Un modelo escalable para estudiar los efectos de la lesión por fuerza contundente en peces cebra adultos

El presente protocolo describe un método para inducir lesiones específicas de tejido y altamente reproducibles en larvas de pez cebra utilizando un sistema de lesiones láser combinado con una plataforma microfluídica automatizada para el manejo de larvas.

Lesiones controladas semiautomatizadas inducidas por láser para estudiar la regeneración de la médula espinal en larvas de pez cebra

La transección de la médula espinal del renacuajo Xenopus laevis es un método de lesión relevante para estudiar la lesión y regeneración de la médula espinal mediante la realización de un corte transversal que corta completamente la médula espinal a nivel torácico.

Transección de la médula espinal en renacuajos Xenopus laevis

Aprende técnicas de sección completa de médula espinal y disección cerebral en lampreas marinas para estudiar regeneración neuronal. Este método permite visualizar neuronas espinales grandes mediante hibridación in situ en montaje completo.

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior In Situ La hibridación en larvas lamprea de mar (Video) | JoVE Journal

Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior

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