Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior In Situ La hibridación en larvas lamprea de mar

Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.

El objetivo general de este procedimiento es realizar una disección completa de la médula espinal, la transección y el cerebro para el estudio de la guía de los axones después de una lesión. Esto se logra mediante el primer seccionamiento, una médula espinal lampre a nivel de la quinta branquia. A continuación, se disecciona el cerebro y se fija a la guardia siliana.

Después de fijar el cerebro, puede almacenarse en metanol o usarse inmediatamente para la hibridación in situ que finalmente cambia la expresión de axonal. Los receptores de guía se pueden ver en una vértebra en regeneración después de una lesión de la médula espinal. La ventaja de la técnica que vamos a demostrar hoy sobre el corte de parafina más convencional o el corte de criostato, es que permite ver todo el cerebro, incluidas las neuronas que se proyectan a la médula espinal que son grandes e identificadas.

La Dra. Kathy Zang, científica investigadora de nuestro laboratorio, demuestra el procedimiento. Desde los arroyos que alimentan los afluentes del lago Michigan hasta el río Delaware en Pensilvania, o los arroyos en Maine. Larva silvestre de lampre de mar de la especie. Se obtuvieron mascotas en Marus.

Las larvas de cuatro a 7 años miden de 10 a 14 centímetros de largo y son lo suficientemente grandes para la lesión y la disección. Manténgalos en grupos de 52, cien. En tanques de agua dulce de 50 galones a 16 grados centígrados.

El tanque requiere un sustrato de grava de una pulgada para que la lamprea pueda tomar prestada. Toda el agua agregada al tanque debe acondicionarse con carbón vegetal, filtrado y aireación durante al menos 48 horas antes de agregarla al tanque. Siempre que los animales se utilicen en el plazo de un año, no es necesario alimentarlos para este procedimiento. Tenga a mano la solución de timbre recién preparada.

Primero transfiera una lámpara a una solución acuosa saturada de benzocaína. Una vez anestesiado, transfiéralo a un plato medio lleno de sil guard. Coloque el plato en hielo y cúbralo con hielo.

Timbres fríos. Asegure al animal con tres alfileres de insectos de 0,15 de diámetro, uno en el hocico y dos en la quinta branquia. A continuación, colóquelo bajo un microscopio estereoscópico para la cirugía.

Comience usando un bisturí número 11 para hacer una incisión longitudinal a lo largo de la línea media dorsal al nivel de la quinta branquia. Esto revelará la médula espinal mientras se hace esta incisión. Use dos ganchos hechos con alfileres de insectos para asegurar las paredes del cuerpo con las tijeras Castro número ocho.

Haz un corte perpendicular a través de la médula espinal expuesta. Inspeccione los extremos cortados de la médula espinal para asegurarse de que la transección esté completa. Luego, con pinzas, vuelva a alinear los extremos cortados y cierre la herida.

Transfiera la lava de lampre a un trozo de papel de filtro empapado en una solución de timbre. Mueva la preparación sobre un lecho de hielo durante una hora para que la herida se seque después de una hora. Transfiera la lava a su propio tanque pequeño de agua helada.

Deje que sane allí durante 24 horas. Después de 24 horas, verifique si hay movimiento cordal a la transección. Si hay algún movimiento, la transección estaba incompleta.

Si no los hay, entonces el transecto fue bueno y el animal puede ser trasladado a un tanque a temperatura ambiente para su recuperación mientras el animal se recupera. Cambie el agua cada dos o tres días. Una vez que el animal seccionado esté suficientemente recuperado, anestesiarlo y prepararlo para la disección como se describió anteriormente.

Para diseccionar el cerebro, comience con una incisión transversal entre la fosa nasal y el órgano pineal. Luego, con la ternera Castro, las tijeras cortan el tejido que rodea el cerebro mientras aseguran al animal. Con pinzas.

Las estructuras ovaladas blancas a ambos lados del tronco encefálico son las cápsulas óticas. Una vez que el cerebro esté expuesto, use fórceps para extirpar el plexo coroideo. A continuación, utilice los ganchos de alfiler modificados para separar la cabeza del animal y exponer los nervios craneales.

A continuación, corte la médula espinal transversalmente con las tijeras mientras asegura la médula espinal con pinzas. Corta los nervios craneales para diseccionar el cerebro. A continuación, transfiere el cerebro a un pequeño trozo de silicona y asegúralo allí.

Usando un alfiler de insecto en la médula espinal y un alfiler a través de uno de los bulbos olfativos. Luego, con las tijeras, corte la comisura del bulbo interolfatorio, la comisura del protector cerebral y el extremo del tronco encefálico a lo largo de la línea media dorsal. Una vez cortadas las comisuras y el oex, desviar lateralmente las placas A LR y sujetarlas planas a la silicona con un total de siete alfileres de insectos, dos en los bulbos olfatorios, dos en los bordes del corte, comisura del protector cerebral, dos en el oex extendido y uno en la línea media de la médula espinal.

Ahora, utilizando reactivos libres de ARN, fije la preparación en formaldehído al 4% a temperatura ambiente durante tres horas con una agitación suave. A continuación, los cerebros pueden ser analizados por hibridación in situ de dos utilizando el método descrito se identificó la expresión de neógeno en transcripciones en la médula espinal, proyectando neuronas de control, animales y en animales. Dos semanas después de la lesión, aquí se observa un control representativo sin lesiones.

Después de la transección completa de la médula espinal, hubo cambios en la expresión del receptor de neógenos. Después de dos semanas, el receptor neógeno en el no control se expresó preferentemente en regeneradores defectuosos como las neuronas M1 I uno I dos I cuatro o MTH. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para nuestra capacidad de explorar la expresión de los receptores guía, los receptores para el sulfato de condroitina, el protio, los glicanos y la activación de las bases de molde, todo en el mismo cerebro.