Lesiones de la Médula Espinal completo y Protocolo Disección del cerebro por Wholemount posterior In Situ La hibridación en larvas lamprea de mar
14 de octubre de 2014
Las lampreas recuperan locomoción después de una lesión completa de la médula espinal. Sin embargo, algunas neuronas espinales-proyectar regeneradores son buenos y otros no lo son. Este documento ilustra las técnicas de larvas de lamprea de mar vivienda (y adultos recientemente transformadas), la producción de transección completa de la médula espinal y la preparación de los cerebros y las médulas espinales wholemount para la hibridación in situ.
El objetivo general de este procedimiento es realizar una disección completa de la médula espinal, la transección y el cerebro para el estudio de la guía de los axones después de una lesión. Esto se logra mediante el primer seccionamiento, una médula espinal lampre a nivel de la quinta branquia. A continuación, se disecciona el cerebro y se fija a la guardia siliana.
Después de fijar el cerebro, puede almacenarse en metanol o usarse inmediatamente para la hibridación in situ que finalmente cambia la expresión de axonal. Los receptores de guía se pueden ver en una vértebra en regeneración después de una lesión de la médula espinal. La ventaja de la técnica que vamos a demostrar hoy sobre el corte de parafina más convencional o el corte de criostato, es que permite ver todo el cerebro, incluidas las neuronas que se proyectan a la médula espinal que son grandes e identificadas.
La Dra. Kathy Zang, científica investigadora de nuestro laboratorio, demuestra el procedimiento. Desde los arroyos que alimentan los afluentes del lago Michigan hasta el río Delaware en Pensilvania, o los arroyos en Maine. Larva silvestre de lampre de mar de la especie. Se obtuvieron mascotas en Marus.
Las larvas de cuatro a 7 años miden de 10 a 14 centímetros de largo y son lo suficientemente grandes para la lesión y la disección. Manténgalos en grupos de 52, cien. En tanques de agua dulce de 50 galones a 16 grados centígrados.
El tanque requiere un sustrato de grava de una pulgada para que la lamprea pueda tomar prestada. Toda el agua agregada al tanque debe acondicionarse con carbón vegetal, filtrado y aireación durante al menos 48 horas antes de agregarla al tanque. Siempre que los animales se utilicen en el plazo de un año, no es necesario alimentarlos para este procedimiento. Tenga a mano la solución de timbre recién preparada.
Primero transfiera una lámpara a una solución acuosa saturada de benzocaína. Una vez anestesiado, transfiéralo a un plato medio lleno de sil guard. Coloque el plato en hielo y cúbralo con hielo.
Timbres fríos. Asegure al animal con tres alfileres de insectos de 0,15 de diámetro, uno en el hocico y dos en la quinta branquia. A continuación, colóquelo bajo un microscopio estereoscópico para la cirugía.
Comience usando un bisturí número 11 para hacer una incisión longitudinal a lo largo de la línea media dorsal al nivel de la quinta branquia. Esto revelará la médula espinal mientras se hace esta incisión. Use dos ganchos hechos con alfileres de insectos para asegurar las paredes del cuerpo con las tijeras Castro número ocho.
Haz un corte perpendicular a través de la médula espinal expuesta. Inspeccione los extremos cortados de la médula espinal para asegurarse de que la transección esté completa. Luego, con pinzas, vuelva a alinear los extremos cortados y cierre la herida.
Transfiera la lava de lampre a un trozo de papel de filtro empapado en una solución de timbre. Mueva la preparación sobre un lecho de hielo durante una hora para que la herida se seque después de una hora. Transfiera la lava a su propio tanque pequeño de agua helada.
Deje que sane allí durante 24 horas. Después de 24 horas, verifique si hay movimiento cordal a la transección. Si hay algún movimiento, la transección estaba incompleta.
Si no los hay, entonces el transecto fue bueno y el animal puede ser trasladado a un tanque a temperatura ambiente para su recuperación mientras el animal se recupera. Cambie el agua cada dos o tres días. Una vez que el animal seccionado esté suficientemente recuperado, anestesiarlo y prepararlo para la disección como se describió anteriormente.
Para diseccionar el cerebro, comience con una incisión transversal entre la fosa nasal y el órgano pineal. Luego, con la ternera Castro, las tijeras cortan el tejido que rodea el cerebro mientras aseguran al animal. Con pinzas.
Las estructuras ovaladas blancas a ambos lados del tronco encefálico son las cápsulas óticas. Una vez que el cerebro esté expuesto, use fórceps para extirpar el plexo coroideo. A continuación, utilice los ganchos de alfiler modificados para separar la cabeza del animal y exponer los nervios craneales.
A continuación, corte la médula espinal transversalmente con las tijeras mientras asegura la médula espinal con pinzas. Corta los nervios craneales para diseccionar el cerebro. A continuación, transfiere el cerebro a un pequeño trozo de silicona y asegúralo allí.
Usando un alfiler de insecto en la médula espinal y un alfiler a través de uno de los bulbos olfativos. Luego, con las tijeras, corte la comisura del bulbo interolfatorio, la comisura del protector cerebral y el extremo del tronco encefálico a lo largo de la línea media dorsal. Una vez cortadas las comisuras y el oex, desviar lateralmente las placas A LR y sujetarlas planas a la silicona con un total de siete alfileres de insectos, dos en los bulbos olfatorios, dos en los bordes del corte, comisura del protector cerebral, dos en el oex extendido y uno en la línea media de la médula espinal.
Ahora, utilizando reactivos libres de ARN, fije la preparación en formaldehído al 4% a temperatura ambiente durante tres horas con una agitación suave. A continuación, los cerebros pueden ser analizados por hibridación in situ de dos utilizando el método descrito se identificó la expresión de neógeno en transcripciones en la médula espinal, proyectando neuronas de control, animales y en animales. Dos semanas después de la lesión, aquí se observa un control representativo sin lesiones.
Después de la transección completa de la médula espinal, hubo cambios en la expresión del receptor de neógenos. Después de dos semanas, el receptor neógeno en el no control se expresó preferentemente en regeneradores defectuosos como las neuronas M1 I uno I dos I cuatro o MTH. El desarrollo de esta técnica allanó el camino para nuestra capacidad de explorar la expresión de los receptores guía, los receptores para el sulfato de condroitina, el protio, los glicanos y la activación de las bases de molde, todo en el mismo cerebro.
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Descripción general
Este estudio demuestra técnicas para realizar transecciones completas de la médula espinal y disecciones cerebrales en lampreas marinas. Destaca la recuperación de la locomoción tras una lesión de la médula espinal y las capacidades de regeneración de neuronas específicas que proyectan hacia la médula espinal.
Componentes Clave del Estudio
Área de la Ciencia
- Neurociencia
- Biología Regenerativa
- Respuesta a Lesiones
Antecedentes
- Las lampreas marinas pueden recuperar la locomoción tras una lesión completa de la médula espinal.
- Algunas neuronas que proyectan a la médula espinal exhiben buenas propiedades regenerativas.
- Comprender la guía axonal tras la lesión es crucial para obtener conocimientos sobre la regeneración de la médula espinal.
- Este estudio utiliza técnicas de hibridación in situ para el análisis.
Objetivo del estudio
- Investigar los mecanismos de guía axonal tras una lesión de la médula espinal.
- Ilustrar las técnicas para la sección de la médula espinal y la disección del encéfalo.
- Analizar los cambios en la expresión de receptores de guía axonal.
Métodos Utilizados
- Sección completa de la médula espinal a nivel de la quinta branquia.
- Diseción del cerebro y fijación para su análisis.
- Almacenamiento de muestras cerebrales en metanol o uso inmediato para hibridación in situ.
- Preparación de montaje completo para visualizar neuronas identificadas grandes que proyectan hacia la médula espinal.
Resultados principales
- Se demostró la recuperación de la locomoción en lampreas tras una lesión.
- Se identificaron diferencias en las capacidades de regeneración entre neuronas con proyección espinal.
- Se observaron cambios en la expresión de receptores de guía axonal en vértebras en regeneración.
- Se destacaron las ventajas de las técnicas de montaje completo frente a los métodos tradicionales de corte por secciones.
Conclusiones
- Las técnicas presentadas proporcionan información valiosa sobre la regeneración de la médula espinal.
- Comprender la regeneración de neuronas puede orientar estrategias terapéuticas futuras.
- Las preparaciones en montaje completo permiten un análisis exhaustivo de las conexiones neuronales.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este protocolo permite la eliminación de riesgos mecanicistas de los objetivos de regeneración axonal al proporcionar un sistema relevante para la enfermedad que estudia las respuestas neuronales intrínsecas a la lesión de la médula espinal. La preparación en montaje completo permite la validación de objetivos mediante la visualización directa de neuronas grandes y identificables que proyectan hacia la médula espinal, facilitando el análisis comparativo de la expresión génica entre buenos y malos regeneradores. Este enfoque mejora la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento al vincular fenotipos moleculares con resultados funcionales de regeneración en un modelo del SNC de vertebrados.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la evaluación de hipótesis terapéuticas mediante la comparación de perfiles de expresión génica entre poblaciones neuronales funcionalmente distintas.
- Valor operativo: Proporciona un método reproducible para aislar y analizar subtipos neuronales específicos implicados en el fracaso o éxito de la regeneración.
- Valor estratégico: Facilita la priorización de objetivos al identificar firmas moleculares asociadas con la capacidad regenerativa.
Desarrollo de ensayos y cribado
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para la evaluación cuantitativa de los cambios en la expresión de receptores de guía axonal tras una lesión.
- Valor operativo: Estandariza la preparación de CNS en montaje completo para obtener resultados consistentes de hibridación in situ entre diferentes condiciones experimentales.
- Valor estratégico: Permite la cribado escalable de receptores de orientación, receptores de sulfato de condroitina y objetivos relacionados en una sola plataforma.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Establece relevancia patológica mediante la modelización de la lesión y la dinámica de regeneración del sistema nervioso central de vertebrados en la lamprea marina.
- Valor operativo: Garantiza la continuidad traslacional desde el descubrimiento hasta la validación preclínica mediante una preparación consistente de montaje completo.
- Valor estratégico: Apoya decisiones de avance ajustadas al riesgo al permitir la reducción mecanicista de riesgos en las vías de guía axonal.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
El método se integra en el continuo de descubrimiento desde la validación del blanco hasta la identificación de compuestos iniciales, proporcionando lecturas moleculares que informan estrategias de modulación de vías.
- Biología del Descubrimiento: Facilita la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al permitir la comparación directa de la expresión génica en neuronas regenerativas frente a no regenerativas identificadas.
- Selección: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante una preparación estandarizada de preparados completos, compatible con hibridación in situ múltiple para receptores de guía axonal.
- Análisis: Genera lecturas espaciales cuantitativas de los cambios en la expresión de receptores que permiten a los equipos correlacionar modificaciones moleculares con resultados fenotípicos de regeneración.
- Investigación Traducional: Se conecta con la continuidad preclínica mediante un modelo de lesión del SNC en vertebrados que muestra recuperación funcional y regeneración axonal proximal.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para estudiar múltiples familias de receptores de guía (por ejemplo, Neogenina, sulfato de condroitina, proteoglicanos) en el mismo contexto neuronal.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva al reducir la ambigüedad mecanicista en las vías de regeneración axonal mediante resolución neuronal directa.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y reproducibilidad del disección y fijación neuronales para análisis molecular posterior.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al proporcionar evidencia temprana de biomarcadores sobre la interacción con el blanco en neuronas con capacidad de regeneración.
- Impacto en la cartera: Orienta la priorización ajustada al riesgo de objetivos de guía axonal basándose en la dinámica de expresión en poblaciones neuronales validadas.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en técnicas de microcirugía para la transección de la médula espinal y la disección cerebral en lamprea marina larvaria.
- Depende del acceso a microscopía estereoscópica, alfileres para insectos, sustratos de silicona y reactivos libres de RNasas para la preparación y fijación de preparaciones completas.
- Necesita una estandarización entre equipos de los protocolos de anestesia, recuperación y fijación para garantizar una calidad de tejido constante.
- Implica consideraciones de adaptación al transferir los protocolos entre diferentes estadios de desarrollo o especies, debido a las variaciones en la anatomía y el tamaño del sistema nervioso central.
- Está limitado por la ventana de 24 horas posteriores a la lesión necesaria para confirmar la transección completa antes de proceder a la recuperación y la disección.
