Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas
25 de junio de 2021
Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.
Este protocolo combina la hibridación in situ de ARNscope de fluorescencia y la inmunohistoquímica utilizando preparaciones cerebrales frescas congeladas o fijas. Esta técnica permite flexibilidad al demostrar una combinación de métodos de hibridación in situ e inmunohistoquímica altamente sensibles para la visualización espacial de dianas de ARN y proteínas en la misma muestra de tejido. Este método es aplicable para el marcaje múltiple en la sección de tejido cerebral, lo que ayuda a la investigación de la organización espacial y la importancia funcional del ARNm y las proteínas dentro de poblaciones neuronales heterogéneas en neurociencia.
Este protocolo se centra principalmente en los pasos de procesamiento para el tejido fresco congelado y el tejido fijado con paraformaldehído. Para comenzar a seccionar el tejido cerebral recién congelado, fíjelo al mandril de criostato preenfriado y corte secciones coronales de 14 micrómetros de grosor. Monte la sección en un portaobjetos de microscopía de vidrio cargado.
Transfiera la diapositiva montada a una caja de diapositivas. A continuación, transporta la caja al congelador a menos 80 grados centígrados sobre hielo seco. Para la fijación de tejidos, filtre la solución de paraformaldehído preparada.
Enfríelo a 4 grados centígrados. Lleve el portaobjetos montado del congelador a menos 80 grados Celsius sobre hielo seco e sumérjalo inmediatamente en la solución de paraformaldehído preenfriada durante 15 minutos, realice la deshidratación del tejido fresco congelado para asegurarse de que el portaobjetos de vidrio esté completamente seco. Después de extraer el cerebro de un soporte fijo de profusión transcárdica, utilizando un micrótomo vibratorio, corte secciones de tejido de 30 micrómetros de grosor.
Guarde las secciones cortadas en una solución crioprotectora. El día del ensayo FISH, transfiera la sección flotante libre a una placa de cultivo celular de 12 pocillos que contenga 0,1 PBS molar y agítela a 90 a 100 RPM en un agitador de plataforma giratoria para eliminar el crioprotector. Luego, con un pincel, monte la sección plana en un portaobjetos de microscopía de vidrio para evitar que se desprenda durante los lavados y seque al aire durante al menos dos horas.
Con un bolígrafo de barrera hidrofóbica, dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la sección para contener los reactivos FISH. Después del preprocesamiento, el tejido se incuba en una solución de proteasa y se hibrida con sondas de ARNscope durante dos horas según las pautas del fabricante. A continuación, se realizan pasos secuenciales de amplificación e inmunohistoquímica de fluorescencia.
Comience preparando una cámara protegida de la luz humidificada para incubar los portaobjetos. En un baño de agua, caliente el tampón de lavado 50X y las sondas a 40 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que se enfríe a temperatura ambiente, prepare un litro de tampón de lavado 1X a partir de la concentración de caldo 50X.
Prepare la mezcla de la sonda como se describe en el manuscrito del texto. Para el tratamiento con proteinasa, agregue proteinasa 3 a la sección de tejido e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para eliminar la proteinasa, sumerja suavemente el portaobjetos en PBS 0,1 molar a temperatura ambiente, evitando que la sección se desprenda.
Para la hibridación, agregue la mezcla de la sonda a la sección de tejido. Colóquelo en la cámara precalentada humidificada. Luego incubarlo durante dos horas a 40 grados centígrados.
Enjuague la sección de pañuelos con tampón de lavado dos veces durante dos minutos. Para la amplificación de la señal, con un frasco gotero, agregue una solución de amplificación para cubrir la sección de tejido e incubar como se describe en el texto. Agregue la solución de bloqueo a la sección de tejido e incube durante una hora a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica.
Mueva el portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de bloqueo después de la incubación. Ahora, incuba la sección con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave el portaobjetos tres veces con 1X TBS.
Añadir el anticuerpo secundario e incubar las secciones durante dos horas a temperatura ambiente. Examine el portaobjetos bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara. Adquiera imágenes representativas con un aumento de 20 veces y guárdelas como archivos TIF.
En el presente estudio, la calidad del tejido, la integridad y la ausencia de contaminación bacteriana fueron confirmadas por la ausencia de marcaje DAPI. El marcaje de las sondas de control positivo dirigidas a la ubiquitina C, la peptidilprolil isomerasa B y el ARNm de la ARN polimerasa IIA confirmó la integridad del ARN. En preparaciones frescas congeladas para distinguir las neuronas positivas al ARNm de GalR1 dentro del NTS, se utilizaron marcadores neuroquímicos adicionales.
El transportador vesicular unido a la membrana estaba claramente marcado. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas como la tirosina hidroxilasa y la GFP expresadas bajo el control del promotor PHOX2B se observaron débilmente y se describieron como floculantes, ya que carecen de un contorno claro. El marcaje de la sonda GalR1 FISH del ARNm citoplasmático de GalR1 fue puntuado y se observó claramente.
Para confirmar que la calidad inmunohistoquímica depende de la localización subcelular de las proteínas, se marcaron diferentes proteínas nucleares y citoplasmáticas en paralelo con FISH en las mismas secciones de tejido. La GFP citoplasmática PHOX2B tenía un aspecto floculante. Mientras que la señal nuclear de la proteína PHOX2B era clara, lo que confirmaba un inmunomarcaje de mayor calidad cuando se combinaba con FISH.
Cuando se realizó en secciones fijas congeladas en combinación con FISH, la inmunohistoquímica fue confiable independientemente de la localización subcelular. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 se localizaron ventralmente al SNT y no dentro del SNT. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 y las positivas para el ARNm de PHOX2B no se colocalizaron.
Una subpoblación de neuronas NTS positivas para ARNm de PHOX2B era tirosina hidroxilasa inmunorreactiva, y ninguna contenía ARNm de GlyT2. El ARNoscopio permite la visualización y el análisis de la distribución del ARN con una resolución de una sola molécula en células y tejidos. Potencia la investigación de nuevas especies de ARN, mecanismos de enfermedades, patrones de expresión génica, diversidad de neuronas e interacciones celulares.
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Resumen
Este estudio presenta un protocolo para combinar hibridación fluorescente in situ (FISH) e inmunohistoquímica fluorescente (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijadas. La técnica permite la visualización espacial simultánea de objetivos de ARN y proteínas, lo que facilita la investigación de poblaciones neuronales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología molecular
- Inmunohistoquímica
Antecedentes
- El estudio investiga la organización espacial de ARN mensajeros y proteínas en poblaciones neuronales heterogéneas.
- La combinación de FISH e IHC permite la etiquetación múltiple en secciones de tejido cerebral.
- Tiene como objetivo mejorar la comprensión de la expresión génica y la localización de proteínas dentro del cerebro.
- El protocolo es aplicable tanto a tejidos recién congelados como a tejidos fijados con paraformaldehído.
Objetivo del estudio
- Demostrar un método fiable y flexible de detección simultánea de ARN y proteínas.
- Mejorar la investigación sobre la distribución de ARNm y la localización de proteínas en células neuronales.
- Validar la calidad del etiquetado inmunohistoquímico cuando se combina con FISH.
Métodos Utilizados
- Se utilizaron secciones cerebrales frescas congeladas y fijadas con paraformaldehído como plataforma principal.
- El modelo biológico implicó tejido cerebral de ratón, centrándose en las señales de ARN y proteínas en neuronas.
- El método incluye pasos críticos como corte, fijación, hibridación y amplificación de la señal.
- Se siguieron protocolos detallados de incubación y lavado para garantizar resultados claros.
Resultados principales
- Las sondas de control positivo confirmaron la integridad del ARN, mientras que se observaron diversos grados de claridad de la señal en las proteínas.
- El estudio demostró la capacidad de diferenciar entre señales citoplasmáticas y nucleares en neuronas.
- Se informaron indicios de poblaciones neuronales distintas y sus expresiones de ARN/proteína.
- La combinación de FISH e IHC resultó confiable para visualizar múltiples dianas dentro de las mismas secciones.
Conclusiones
- El protocolo permite una exploración avanzada de la diversidad neuronal y las interacciones dentro del tejido cerebral.
- Este estudio proporciona un marco para futuras investigaciones sobre mecanismos neuronales y posibles modelos de enfermedades.
- El método enriquece nuestra comprensión de la dinámica molecular y celular en neurociencia.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La combinación de FISH multiplex con inmunohistoquímica de fluorescencia permite a la I+D biofarmacéutica resolver la coexpresión espacial de objetivos de ARN y proteínas dentro de poblaciones neuronales heterogéneas, apoyando la validación de objetivos y la reducción de riesgos mecanicistas en el descubrimiento de fármacos en neurociencia. Este enfoque mejora la confianza predictiva al vincular firmas moleculares con fenotipos celulares, informando decisiones de avance o interrupción en las fases iniciales del descubrimiento. La aplicabilidad del método a tejidos frescos congelados y fijados proporciona flexibilidad en el flujo de trabajo para la interrogación de objetivos en modelos preclínicos.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite la verificación de hipótesis terapéuticas mediante la detección de ARNm de baja abundancia (por ejemplo, receptor de galanina 1) y transcritos de alta abundancia dentro de núcleos cerebrales definidos inmunohistoquímicamente.
- Valor operacional: Apoya la reducción de riesgos biológicos mediante la etiqueta simultánea de ARN y proteínas, aclarando la participación del blanco y la modulación de rutas en circuitos neuronales.
- Valor predictivo: Facilita la selección de proyectos en carteras al distinguir subpoblaciones neuronales según sus firmas neuroquímicas, reduciendo la ambigüedad en la selección de blancos.
Desarrollo de Cribado y Ensayos
- Valor científico: Prepara sistemas biológicos validados para análisis posteriores mediante la confirmación de la integridad del ARN a través de sondas de control positivo (ubiquitina C, peptidilprolil isomerasa B, ARN polimerasa II A).
- Valor operativo: Permite la estandarización del ensayo mediante condiciones optimizadas de incubación con proteasa e hibridación, mejorando la reproducibilidad entre preparaciones de tejidos frescos congelados y fijados.
- Valor de escalabilidad: Facilita la reutilización de la plataforma para la detección multiplex de ARN y proteínas, ayudando a la evaluación confiable de compuestos en campañas de cribado fenotípico.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Valor científico: Mejora la alineación de biomarcadores traslacionales mediante la visualización de la organización espacial de la expresión de ARNm y proteínas en núcleos del tronco encefálico relevantes para la enfermedad (por ejemplo, NTS).
- Valor operativo: Garantiza la continuidad desde el descubrimiento hasta la validación preclínica al mantener la calidad de la inmunohistoquímica tras la hibridación in situ fluorescente, particularmente para dianas ligadas a la membrana.
- Avance ajustado al riesgo: Orienta la toma de decisiones al revelar la falta de colocalización entre neuronas positivas para ARNm de GlyT2 y neuronas positivas para ARNm de PHOX2B, refinando así los modelos mecanicistas.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se integra en la continuación del descubrimiento desde la identificación del blanco hasta la optimización del fármaco inicial, permitiendo la validación espacial de blancos moleculares en poblaciones neuronales antes del cribado fenotípico.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis y la aclaración de vías al resolver la distribución del ARN dentro de neuronas identificadas inmunohistoquímicamente, reduciendo la ambigüedad mecanicista.
- Tamizaje: Proporciona disponibilidad para ensayos mediante protocolos estandarizados de FISH-IHC, asegurando lecturas espaciales reproducibles para la evaluación de la respuesta a compuestos.
- Análisis: Genera datos espaciales cuantitativos mediante la detección de señales de fluorescencia, permitiendo la comparación de niveles de expresión de ARN y proteínas entre condiciones experimentales.
- Investigación Traductiva: Se conecta con la continuidad preclínica al validar la expresión del blanco en preparaciones de tejidos fijados, apoyando modelos de enfermedad alineados con biomarcadores.
- Reutilización Empresarial: Funciona como una capacidad reutilizable de perfilado espacial en diversos programas de descubrimiento en neurociencia, maximizando la inversión en infraestructura.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva mediante la visualización directa de la coexpresión ARN-proteína, reduciendo los falsos positivos en la validación de dianas.
- Valor operativo: Mejora la estandarización y la reproducibilidad mediante pasos optimizados de proteasa e hibridación, minimizando la variabilidad en la marcación múltiple.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al permitir la eliminación temprana de riesgos en las dianas mediante resolución subcelular, reduciendo el abandono en fases avanzadas debido a discrepancias biológicas.
- Impacto en la cartera: Apoya la priorización ajustada al riesgo al identificar subpoblaciones neuronales con perfiles distintos de ARN-proteína, orientando la selección de indicaciones.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en microscopía de fluorescencia, manipulación de sondas de ARN y optimización de anticuerpos para controlar la especificidad de la señal.
- Depende de ambientes libres de RNasas, herramientas de corte como criostatos o microtomos, y sistemas de imagen de fluorescencia con conjuntos de filtros adecuados.
- Necesita la estandarización entre equipos de los tiempos de incubación con proteasas y los protocolos de validación de anticuerpos para garantizar una calidad constante de la IHQ tras la FISH.
- Requiere adaptación según la localización subcelular de la proteína, ya que los objetivos citoplasmáticos pueden necesitar una resolución exhaustiva de problemas, mientras que las proteínas ligadas a la membrana conservan la especificidad.
- Limitado por los desafíos en el manejo de tejidos en preparaciones fijadas y congeladas, aunque la calidad de la IHQ es superior cuando se optimiza con RNAscope.
