Name: Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 36 s
Description: Aprende a combinar hibridación in situ de fluorescencia con inmunohistoquímica en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas. Este método permite visualizar ARN y proteínas simultáneamente para estudiar poblaciones neuronales.

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Este trabajo fue financiado por la subvención del Proyecto de Descubrimiento del Consejo de Investigación Australiano DP180101890 y la subvención del proyecto de la Fundación de Investigación Médica Rebecca L Cooper PG2018110

<ol><li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).</li>
<li>Annese, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+dual+ISH-IHC+technology+to+study+angiogenesis+in+diffuse+large+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry+and+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">RNAscope dual ISH-IHC technology to study angiogenesis in diffuse large B-cell lymphomas.</a> Histochemistry and Cell Biology. 153 (3), 185-192 (2020).</li>
<li>Morrison, J. A., McKinney, M. C., Kulesa, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+in+vivo+gene+expression+during+collective+cell+migration+using+an+integrated+RNAscope%2C+immunohistochemistry+and+tissue+clearing+method%5BTitle%5D)+AND+%22Mechanisms+of+Development%22%5BJournal%5D)">Resolving in vivo gene expression during collective cell migration using an integrated RNAscope, immunohistochemistry and tissue clearing method.</a> Mechanisms of Development. 148, 100-106 (2017).</li>
<li>Gross-Thebing, T., Paksa, A., Raz, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+high-resolution+detection+of+multiple+transcripts+combined+with+localization+of+proteins+in+whole-mount+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biology%22%5BJournal%5D)">Simultaneous high-resolution detection of multiple transcripts combined with localization of proteins in whole-mount embryos.</a> BMC Biology. 12, 55(2014).</li>
<li>Stempel, A. J., Morgans, C. W., Stout, J. T., Appukuttan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+visualization+and+cell-specific+confirmation+of+RNA+and+protein+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Vision%22%5BJournal%5D)">Simultaneous visualization and cell-specific confirmation of RNA and protein in the mouse retina.</a> Molecular Vision. 20, 1366-1373 (2014).</li>
<li>Kersigo, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+RNAscope+whole+mount+approach+that+can+be+combined+with+immunofluorescence+to+quantify+differential+distribution+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Tissue+Research%22%5BJournal%5D)">A RNAscope whole mount approach that can be combined with immunofluorescence to quantify differential distribution of mRNA.</a> Cell and Tissue Research. 374 (2), 251-262 (2018).</li>
<li>Grabinski, T. M., Kneynsberg, A., Manfredsson, F. P., Kanaan, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+for+combining+RNAscope+in+situ+hybridization+with+immunohistochemistry+in+thick+free-floating+brain+sections+and+primary+neuronal+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A method for combining RNAscope in situ hybridization with immunohistochemistry in thick free-floating brain sections and primary neuronal cultures.</a> PLoS One. 10 (3), 0120120(2015).</li>
<li>Baleriola, J., Jean, Y., Troy, C., Hengst, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+axonally+localized+mRNAs+in+brain+sections+using+high-resolution+in+situ+hybridization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Detection of axonally localized mRNAs in brain sections using high-resolution in situ hybridization.</a> Journal of Visualized Experiments. (100), e52799(2015).</li>
<li>Fe Lanfranco, M., Loane, D. J., Mocchetti, I., Burns, M. P., Villapol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combination+of+fluorescent+in+situ+hybridization+%28FISH%29+and+immunofluorescence+imaging+for+detection+of+cytokine+expression+in+microglia%2Fmacrophage+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocol%22%5BJournal%5D)">Combination of fluorescent in situ hybridization (FISH) and immunofluorescence imaging for detection of cytokine expression in microglia/macrophage cells.</a> Bio-Protocol. 7 (22), (2017).</li>
<li>Dereli, A. S., Yaseen, Z., Carrive, P., Kumar, N. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+of+respiratory-related+brain+regions+to+long-term+hypercapnia%3A+focus+on+neuropeptides+in+the+RTN%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Adaptation of respiratory-related brain regions to long-term hypercapnia: focus on neuropeptides in the RTN.</a> Frontiers in Neuroscience. 13, 1343(2019).</li>
<li>Lazarenko, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acid+sensitivity+and+ultrastructure+of+the+retrotrapezoid+nucleus+in+Phox2b-EGFP+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Acid sensitivity and ultrastructure of the retrotrapezoid nucleus in Phox2b-EGFP transgenic mice.</a> Journal of Comparative Neurology. 517 (1), 69-86 (2009).</li>
<li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> Journal of Visualized Experiments. (65), e3564(2012).</li>
<li>Paxinos, G., Franklin, K. B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPaxinos%2C+G+%22The+mouse+brain+in+stereotaxic+coordinates%22">The mouse brain in stereotaxic coordinates</a>. , Academic Press. (2004).</li>
<li>Abercrombie, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+nuclear+population+from+microtome+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Anatomical+Records%22%5BJournal%5D)">Estimation of nuclear population from microtome sections.</a> Anatomical Records. 94, 239-247 (1946).</li>
<li>Kerr, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+generation+of+knock-in+mice+expressing+fluorescently+tagged+galanin+receptors+1+and+2%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neurosciences%22%5BJournal%5D)">The generation of knock-in mice expressing fluorescently tagged galanin receptors 1 and 2.</a> Molecular and Cellular Neurosciences. 68, 258-271 (2015).</li>
<li>Kachidian, P., Pickel, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+tyrosine+hydroxylase+in+neuronal+targets+and+efferents+of+the+area+postrema+in+the+nucleus+tractus+solitarii+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Localization of tyrosine hydroxylase in neuronal targets and efferents of the area postrema in the nucleus tractus solitarii of the rat.</a> Journal of Comparative Neurology. 329 (3), 337-353 (1993).</li>
<li>Stornetta, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Phox2b+by+brainstem+neurons+involved+in+chemosensory+integration+in+the+adult+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of Phox2b by brainstem neurons involved in chemosensory integration in the adult rat.</a> Journal of Neuroscience. 26 (40), 10305-10314 (2006).</li>
<li>Gilmor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+putative+vesicular+acetylcholine+transporter+in+rat+brain+and+localization+in+cholinergic+synaptic+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Expression of the putative vesicular acetylcholine transporter in rat brain and localization in cholinergic synaptic vesicles.</a> Journal of Neuroscience. 16 (7), 2179-2190 (1996).</li>
<li>Fisher, J. M., Sossin, W., Newcomb, R., Scheller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+neuropeptides+derived+from+a+common+precursor+are+differentially+packaged+and+transported%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Multiple neuropeptides derived from a common precursor are differentially packaged and transported.</a> Cell. 54 (6), 813-822 (1988).</li>
<li>Towle, A. C., Lauder, J. M., Joh, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+tyrosine-hydroxylase+immunocytochemistry+in+paraffin+sections+using+pretreatment+with+proteolytic-enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Optimization of tyrosine-hydroxylase immunocytochemistry in paraffin sections using pretreatment with proteolytic-enzymes.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 32 (7), 766-770 (1984).</li>
<li>Biancardi, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+the+excitatory%2C+inhibitory%2C+and+modulatory+afferent+projections+to+the+anatomically+defined+active+expiratory+oscillator+in+adult+male+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Mapping of the excitatory, inhibitory, and modulatory afferent projections to the anatomically defined active expiratory oscillator in adult male rats.</a> Journal of Comparative Neurology. 529 (4), 853-884 (2021).</li>
<li>Matthews, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+in+the+brainstem%3A+an+excitatory+disynaptic+pathway+for+control+of+whisking%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Comparative+Neurology%22%5BJournal%5D)">Feedback in the brainstem: an excitatory disynaptic pathway for control of whisking.</a> Journal of Comparative Neurology. 523 (6), 921-942 (2015).</li>
<li>Ramos-Vara, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+and+methods+of+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Principles and methods of immunohistochemistry.</a> Methods in Molecular Biology. 1641, 115-128 (2017).</li>
<li>Shi, S. R., Key, M. E., Kalra, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antigen+retrieval+in+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%3A+an+enhancement+method+for+immunohistochemical+staining+based+on+microwave+oven+heating+of+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Antigen retrieval in formalin-fixed, paraffin-embedded tissues: an enhancement method for immunohistochemical staining based on microwave oven heating of tissue sections.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 39 (6), 741-748 (1991).</li>
<li>Yamashita, S., Katsumata, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval+in+immunohistochemistry%3A+mechanisms+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval in immunohistochemistry: mechanisms and applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1560, 147-161 (2017).</li>
<li>Yamashita, S., Okada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+heat-induced+antigen+retrieval%3A+analyses+in+vitro+employing+SDS-PAGE+and+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of heat-induced antigen retrieval: analyses in vitro employing SDS-PAGE and immunohistochemistry.</a> Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (1), 13-21 (2005).</li>
<li>Yamashita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heat-induced+antigen+retrieval%3A+mechanisms+and+application+to+histochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Histochemistry+and+Cytochemistry%22%5BJournal%5D)">Heat-induced antigen retrieval: mechanisms and application to histochemistry.</a> Progress in Histochemistry and Cytochemistry. 41 (3), 141-200 (2007).</li>
</ol>

En las neurociencias, la FISH y la IHQ se utilizan de forma rutinaria para investigar la organización espacial y la importancia funcional del ARNm o las proteínas dentro de las subpoblaciones neuronales. El protocolo descrito en este estudio mejora la capacidad de detección simultánea de ARNm y proteínas en secciones cerebrales. Nuestro ensayo combinado multiplex FISH-IHC permitió la identificación fenotípica de distintas subpoblaciones neuronales en el NTS tanto en preparaciones cerebrales frescas congeladas como fijas....

Las proteínas y los ARNm que definen neuroquímicamente las subpoblaciones de neuronas se identifican comúnmente con una combinación de inmunohistoquímica (IHQ) y/o hibridación in situ (ISH), respectivamente. La combinación de ISH con técnicas IHQ facilita la caracterización de patrones de colocalización exclusivos de las neuronas funcionales (codificación neuroquímica) al maximizar la capacidad de marcaje múltiple.
Los métodos de ISH fluorescentes (FISH), incluido el ARNoscopio, tienen una mayor sensibilidad y especificidad en comparación con los métodos de detección de ARN anteriores, como el ISH radiactivo y el ISH cromogénico no radiactivo. FISH permite la visualización de transcripciones individuales de ARNm como manchas teñidas punteadas1. Además, el ensayo RNAscope permite marcar un mayor número de dianas de ARN a la vez, utilizando diferentes etiquetas de fluoróforos. A pesar de estas ventajas, las limitaciones técnicas pueden afectar al número de fluoróforos/cromógenos que se pueden utilizar en un solo experimento. Estos incluyen la disponibilidad de juegos de filtros de microscopio; estas consideraciones se agravan cuando la identificación neuroquímica utiliza la combinación de FISH e IHQ, en comparación con el uso de cada técnica de forma aislada, ya que los pasos inherentes óptimos para un método pueden ser perjudiciales para el otro.
La aplicación previa de FISH combinada con IHQ ha demostrado la expresión de dianas celulares específicas en linfomas de células B humanas2, embriones de pollo3, embriones de pez cebra4, retina de ratón5 y células del oído interno de ratón6. En estos estudios, la preparación del tejido se realizó en parafina fijada en formol (FFPE)2,3,5 o en montura entera fresca 4,6. Otros estudios aplicaron el ARNoscopio cromogénico en preparaciones fijas de cerebro de ratón y rata 7,8,9. En particular, Baleriola et al.8 describieron dos preparaciones tisulares diferentes para la combinación de ISH-IHC; secciones fijas del cerebro del ratón y secciones del cerebro humano FFPE. En una publicación reciente, combinamos FISH e IHQ fluorescente en secciones frescas congeladas, para visualizar simultáneamente ARNm de baja abundancia (receptor de galanina 1, GalR1), ARNm de alta abundancia (transportador de glicina 2, GlyT2) y proteína10 transportadora vesicular de acetilcolina (vAChT) en la formación reticular del tronco encefálico.
El núcleo del tracto solitario (NTS, por sus siglas en inglés) es una de las principales regiones del cerebro implicada en la función autonómica. Situada en el cerebro posterior, esta población heterogénea de neuronas recibe e integra un gran número de señales autónomas, incluidas las que regulan la respiración. El NTS alberga varias poblaciones neuronales, que pueden caracterizarse fenotípicamente por el patrón de expresión de dianas de ARNm que incluyen GalR1 y GlyT2 y marcadores proteicos para la enzima tirosina hidroxilasa (TH) y el factor de transcripción Paired-like homeobox 2b (Phox2b).
El propietario de RNAscope recomienda preparaciones de tejido fresco congelado, pero el tejido preparado por fijación de perfusión transcárdica de animal entero, junto con la crioprotección a largo plazo (almacenamiento a -20 °C) de secciones fijas de tejido congelado, es común en muchos laboratorios. Por lo tanto, se buscó establecer protocolos para la FISH en combinación con IHQ utilizando preparaciones de tejido fresco congelado y congelado fijo. Aquí, proporcionamos secciones cerebrales frescas congeladas y congeladas fijas: (1) un protocolo para FISH combinado e IHQ fluorescente (2) una descripción de la calidad del ARNm y el marcaje de proteínas producido, cuando se utiliza cada preparación (3) una descripción de la expresión de GalR1 y GlyT2 en el NTS.
Nuestro estudio reveló que, cuando se combinó con la metodología de ARNoscopio, el éxito de la IHC varió en las preparaciones frescas congeladas y congeladas fijas y dependió de la localización de las proteínas diana dentro de la célula. En nuestras manos, el marcaje de proteínas unidas a la membrana siempre tuvo éxito. Por el contrario, la IHQ para la proteína citoplasmática requirió la resolución de problemas incluso en los casos en que la proteína citoplasmática estaba sobreexpresada en un animal transgénico (Phox2b-GFP)11. Finalmente, mientras que GalR1 se expresa en neuronas no catecolaminérgicas en el NTS, la expresión de GlyT2 está ausente en el NTS.

<table><tbody><tr><td>ANIMALS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6</td> ratón <td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 2159769</td><td></td></tr><tr><td>ratón Phox2b-eGFP</td><td>Australian BioResources, Moss Vale</td><td>MGI: 5776545</td><td></td></tr><tr><td><FUERTES>REACTIVOS</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cianoacrilato</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>324558</td><td></td></tr><tr><td>Heparina-Sodio</td><td>Clifford Hallam Healthcare</td><td>1070760</td><td>Consulte al proveedor veterinario local o a la farmacia.</td></tr><tr><td>Lethabarb (Pentabarbitol de Sodio) Inyección de Eutanasia</td><td>Virbac (Australia) Pty Ltd</td><td>N/A Consulte a</td><td>un veterinario para conocer las regulaciones farmacéuticas locales con respecto al Pentabarbitol de Sodio</td></tr><tr><td>Polvo de agarosa de grado molecular</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5077</td><td></td></tr><tr><td>OCT Compuesto, 118mL</td><td>Scigen Ltd</td><td>4586</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído, prilado, 95%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>441244-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Polivinilpirrolidona, promedio de moles 40,000 &nbsp; (PVP-40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>PVP40</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Invitrogen</td><td>P36930</td><td>Con o sin DAPI</td></tr><tr><td>RNAscope Multiplex Kit de reactivos fluorescentes (capacidad de hasta 3-plex)</td><td>Advanced Cell Diagnostics, Inc. (ACD Bio)</td><td>ADV320850</td><td>Incluye tampón de lavado 50x y Proteasa III</td></tr><tr><td>RNasa Away</td><td>Thermo-Fisher Scientific</td><td>7003</td><td></td></tr><tr><td>Tris (hidroximetilo)aminometano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20, para biología molecular</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416</td><td></td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td>Incubadora de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>sobremesa</td><td>Microincubadora Thermoline Scientific Modelo</td><td>: TEI-13G</td><td></td></tr><tr><td>Brain Matrix, Ratón, 30g Adulto, Coronal, 1mm</td><td>Ted Pella</td><td>15050</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica</td><td>CM1950</td><td></td></tr><tr><td>Aguja de dibujo (calibre de 23 pulgadas)</td><td>BD</td><td>0288U07</td><td></td></tr><tr><td>Bolígrafo de barrera hidrofóbica</td><td>Laboratorios vectoriales</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Kimtech Science Kimwipes Toallitas para trabajos delicados</td><td>Kimberley Clark</td> Professional <td>34120</td><td></td></tr><tr><td>Olympus BX51</td><td>Olympus</td><td>BX-51</td><td></td></tr><tr><td>Bomba</td> <td>peristálticaColeparmer Masterflex</td><td>L/S Series&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital Retiga 2000R Cámara digital</td><td>QImaging</td><td>RET-2000R-F-CLR</td><td>cámara color</td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Portaobjetos de vidrio (blanco</td><td>)Thermo-Fisher Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>micrótomo vibratorio (vibrátomo)</td><td>Papel</td> de filtro cualitativo Leica <td>VT1200S</td><td></td></tr><tr><td>Whatman, Grado 1, 110 mm de diámetro</td><td>Merck</td><td>WHA1001110</td><td></td></tr><tr><td><fuerte> SOFTWARES</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>CorelDRAW&nbsp;</td><td>Corel Corporation</td><td>Versión 7</td><td></td></tr><tr><td>FIJI (ImageJ Distribution)</td><td>Código abierto/GNU Licencia Pública General (GPL)</td><td>N/A</td><td>ImageJ 2.x: Rueden, C. T.; Schindelin, J. & Hiner, M. C. et al. (2017), "ImageJ2: ImageJ para la próxima generación de datos de imágenes científicas", BMC Bioinformatics 18:529, PMID 29187165, doi:10.1186/s12859-017-1934-z&nbsp; &nbsp; y Fiji: Schindelin, J.; Arganda-Carreras, I. & Frise, E. et al. (2012), "Fiji: una plataforma de código abierto para el análisis de imágenes biológicas", Nature methods 9(7): 676-682, PMID 22743772, doi:10.1038/nmeth.2019&nbsp;</td></tr><tr><td><ANTICUERPOS PRIMARIOS FUERTES></anticuerpo antitirosin>a</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>hidroxilasa</td><td>fuerte Millipore Sigma</td><td>AB1542</td><td>Policlonal de oveja (dilución 1:1000), RRID:</td></tr><tr><td>AB_90755 Anticuerpo antitirosina hidroxilasa, clon LNC1</td><td>Millipore Sigma</td><td>MAB318</td><td>Monoclonal de ratón (dilución 1:1000), RRID:</td></tr><tr><td>AB_2201528 Anticuerpo anti-Transportador de Acetilcolina Vesicular (VAchT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ABN100</td><td>Cabra policlonal (dilución 1:1000), RRID: AB_2630394</td></tr><tr><td>Anticuerpo GFP</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB600-308</td><td>Conejo policlonal (dilución 1:1000), RRID:</td></tr><tr><td>AB_10003058 Anticuerpo Phox2b (B-11)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-376997</td><td>Monoclonal de ratón (dilución 1:1000), RRID: AB_2813765</td></tr><tr><td><fuerte>ANTICUERPOS SECUNDARIOS</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Donkey Anti-Conejo IgG (H+L) (min x bov, ck, gt, gp, sy hms, hrs, hu, ms, rata, shp sr prot)&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>711-545-152</td><td>Burro anti-Conejo (dilución 1:400), RRID: AB_2313584</td></tr><tr><td>AMCA AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-155-147</td><td>Burro anti-Oveja (dilución 1:400), RRID: AB_AB_2340725</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Goat IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>705-175-147</td><td>Burro anti-Cabra (dilución 1:400), RRID: AB_2340415</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L) (min X Bov, Ck, Gt, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Rb, Rat, Shp Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>715-175-151</td><td>Burro anti-Ratón (dilución 1:400), RRID: AB_2619678</td></tr><tr><td>Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Sheep IgG (H+L) (min X Ck, GP, Sy Hms, Hrs, Hu, Ms, Rb, Rat Sr Prot)</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>713-175-147</td><td>Burro anti-Sheep (dilución 1:400), RRID: AB_2340730</td></tr><tr><td><fuerte>SONDAS de ARN</fuerte>Receptor de</td> galanina 1 sonda de oligonucleótidos ACDBio 448821-C1 objetivos bp 482 - 1669 (Referencia del banco de germoplasma: NM_008082.2)Sonda de oligonucleótidos del transportador de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>glicina 2</td><td>ACDBio</td><td>409741-C3</td><td>objetivos bp 925 - 2153 (Banco de germoplasma ref: NM_148931.3)</td></tr><tr><td>Sonda de oligonucleótidos Phox2b</td><td>ACDBio</td><td>407861-C2</td><td>objetivos bp 1617 - 2790 (Banco de germoplasma ref: NM_008888.3)</td></tr></tbody></table>

combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Combining Multiplex Fluorescence In Situ Hybridization with Fluorescent Immunohistochemistry on Fresh Frozen or Fixed Mouse Brain Sections

La hibridación fluorescente in situ (FISH) es una técnica molecular que identifica la presencia y distribución espacial de transcritos específicos de ARN dentro de las células. El fenotipado neuroquímico de neuronas identificadas funcionalmente suele requerir un marcaje concurrente con múltiples anticuerpos (proteína diana) mediante inmunohistoquímica (IHQ) y la optimización de la hibridación in situ (ARN dirigido), en conjunto. Se puede lograr una "firma neuroquímica" para caracterizar neuronas particulares, sin embargo, los factores que complican la situación incluyen la necesidad de verificar los objetivos de FISH e IHQ antes de combinar los métodos, y el número limitado de ARN y proteínas que pueden ser atacados simultáneamente dentro de la misma sección de tejido.
Aquí describimos un protocolo, utilizando preparaciones cerebrales de ratón frescas congeladas y fijadas, que detecta múltiples ARNm y proteínas en la misma sección cerebral utilizando RNAscope FISH seguido de inmunotinción de fluorescencia, respectivamente. Utilizamos el método combinado para describir el patrón de expresión de ARNm de baja abundancia (p. ej., receptor de galanina 1) y ARNm de alta abundancia (p. ej., transportador de glicina 2), en núcleos de tronco encefálico identificados inmunohistoquímicamente.
Las consideraciones clave para el etiquetado de proteínas aguas abajo del ensayo FISH van más allá de la preparación de tejidos y la optimización del etiquetado de la sonda FISH. Por ejemplo, descubrimos que la especificidad de unión y etiquetado de anticuerpos puede verse afectada negativamente por el paso de proteasa dentro del ensayo de sonda FISH. Las proteasas catalizan la escisión hidrolítica de los enlaces peptídicos, lo que facilita la entrada de la sonda FISH en las células, sin embargo, también pueden digerir la proteína objetivo del ensayo IHQ posterior, produciendo una unión fuera del objetivo. La localización subcelular de la proteína diana es otro factor que contribuye al éxito de la IHQ tras el ensayo de la sonda FISH. Observamos que la especificidad de la IHQ se conserva cuando la proteína diana está unida a la membrana, mientras que la IHQ dirigida a la proteína citoplasmática requirió una amplia resolución de problemas. Finalmente, encontramos que el manejo del tejido congelado fijo montado en portaobjetos es más desafiante que el tejido congelado fresco, sin embargo, la calidad de la IHQ fue en general mejor con el tejido congelado fijo, cuando se combinó con ARNscope.

Aquí, describimos un método para combinar FISH multiplex con IHQ fluorescente para localizar la expresión de ARNm para GalR1 y GlyT2 utilizando tejidos frescos congelados y fijados con paraformaldehído, respectivamente, en el NTS de ratón. En la Figura 1 y en la Figura 2 se muestra una línea de procesamiento de tejidos, FISH y procedimientos IHQ descritos en los métodos. La Tabla 1 proporciona un resumen de las combinaciones de sonda FISH y anti...

Este protocolo describe un método para combinar la hibridación fluorescente in situ (FISH) y la inmunohistoquímica de fluorescencia (IHC) en secciones de cerebro de ratón frescas congeladas y fijas, con el objetivo de lograr una señal de FISH y IHC de fluorescencia multimarca. IHQ se dirigió a proteínas citoplasmáticas y unidas a la membrana.

Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a molecular technique that identifies the presence and spatial distribution of specific RNA transcripts within ...

Este protocolo combina la hibridación in situ de ARNscope de fluorescencia y la inmunohistoquímica utilizando preparaciones cerebrales frescas congeladas o fijas. Esta técnica permite flexibilidad al demostrar una combinación de métodos de hibridación in situ e inmunohistoquímica altamente sensibles para la visualización espacial de dianas de ARN y proteínas en la misma muestra de tejido. Este método es aplicable para el marcaje múltiple en la sección de tejido cerebral, lo que ayuda a la investigación de la organización espacial y la importancia funcional del ARNm y las proteínas dentro de poblaciones neuronales heterogéneas en neurociencia.Este protocolo se centra principalmente en los pasos de procesamiento para el tejido fresco congelado y el tejido fijado con paraformaldehído. Para comenzar a seccionar el tejido cerebral recién congelado, fíjelo al mandril de criostato preenfriado y corte secciones coronales de 14 micrómetros de grosor. Monte la sección en un portaobjetos de microscopía de vidrio cargado.Transfiera la diapositiva montada a una caja de diapositivas. A continuación, transporta la caja al congelador a menos 80 grados centígrados sobre hielo seco. Para la fijación de tejidos, filtre la solución de paraformaldehído preparada.Enfríelo a 4 grados centígrados. Lleve el portaobjetos montado del congelador a menos 80 grados Celsius sobre hielo seco e sumérjalo inmediatamente en la solución de paraformaldehído preenfriada durante 15 minutos, realice la deshidratación del tejido fresco congelado para asegurarse de que el portaobjetos de vidrio esté completamente seco. Después de extraer el cerebro de un soporte fijo de profusión transcárdica, utilizando un micrótomo vibratorio, corte secciones de tejido de 30 micrómetros de grosor.Guarde las secciones cortadas en una solución crioprotectora. El día del ensayo FISH, transfiera la sección flotante libre a una placa de cultivo celular de 12 pocillos que contenga 0,1 PBS molar y agítela a 90 a 100 RPM en un agitador de plataforma giratoria para eliminar el crioprotector. Luego, con un pincel, monte la sección plana en un portaobjetos de microscopía de vidrio para evitar que se desprenda durante los lavados y seque al aire durante al menos dos horas.Con un bolígrafo de barrera hidrofóbica, dibuje una barrera hidrofóbica alrededor de la sección para contener los reactivos FISH. Después del preprocesamiento, el tejido se incuba en una solución de proteasa y se hibrida con sondas de ARNscope durante dos horas según las pautas del fabricante. A continuación, se realizan pasos secuenciales de amplificación e inmunohistoquímica de fluorescencia.Comience preparando una cámara protegida de la luz humidificada para incubar los portaobjetos. En un baño de agua, caliente el tampón de lavado 50X y las sondas a 40 grados centígrados durante 10 minutos. Una vez que se enfríe a temperatura ambiente, prepare un litro de tampón de lavado 1X a partir de la concentración de caldo 50X.Prepare la mezcla de la sonda como se describe en el manuscrito del texto. Para el tratamiento con proteinasa, agregue proteinasa 3 a la sección de tejido e incube a temperatura ambiente durante 30 minutos. Para eliminar la proteinasa, sumerja suavemente el portaobjetos en PBS 0,1 molar a temperatura ambiente, evitando que la sección se desprenda.Para la hibridación, agregue la mezcla de la sonda a la sección de tejido. Colóquelo en la cámara precalentada humidificada. Luego incubarlo durante dos horas a 40 grados centígrados.Enjuague la sección de pañuelos con tampón de lavado dos veces durante dos minutos. Para la amplificación de la señal, con un frasco gotero, agregue una solución de amplificación para cubrir la sección de tejido e incubar como se describe en el texto. Agregue la solución de bloqueo a la sección de tejido e incube durante una hora a temperatura ambiente para evitar la unión inespecífica.Mueva el portaobjetos para eliminar el exceso de tampón de bloqueo después de la incubación. Ahora, incuba la sección con anticuerpos primarios durante la noche a 4 grados centígrados. Al día siguiente, lave el portaobjetos tres veces con 1X TBS.Añadir el anticuerpo secundario e incubar las secciones durante dos horas a temperatura ambiente. Examine el portaobjetos bajo un microscopio de epifluorescencia equipado con una cámara. Adquiera imágenes representativas con un aumento de 20 veces y guárdelas como archivos TIF.En el presente estudio, la calidad del tejido, la integridad y la ausencia de contaminación bacteriana fueron confirmadas por la ausencia de marcaje DAPI. El marcaje de las sondas de control positivo dirigidas a la ubiquitina C, la peptidilprolil isomerasa B y el ARNm de la ARN polimerasa IIA confirmó la integridad del ARN. En preparaciones frescas congeladas para distinguir las neuronas positivas al ARNm de GalR1 dentro del NTS, se utilizaron marcadores neuroquímicos adicionales.El transportador vesicular unido a la membrana estaba claramente marcado. Por el contrario, las proteínas citoplasmáticas como la tirosina hidroxilasa y la GFP expresadas bajo el control del promotor PHOX2B se observaron débilmente y se describieron como floculantes, ya que carecen de un contorno claro. El marcaje de la sonda GalR1 FISH del ARNm citoplasmático de GalR1 fue puntuado y se observó claramente.Para confirmar que la calidad inmunohistoquímica depende de la localización subcelular de las proteínas, se marcaron diferentes proteínas nucleares y citoplasmáticas en paralelo con FISH en las mismas secciones de tejido. La GFP citoplasmática PHOX2B tenía un aspecto floculante. Mientras que la señal nuclear de la proteína PHOX2B era clara, lo que confirmaba un inmunomarcaje de mayor calidad cuando se combinaba con FISH.Cuando se realizó en secciones fijas congeladas en combinación con FISH, la inmunohistoquímica fue confiable independientemente de la localización subcelular. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 se localizaron ventralmente al SNT y no dentro del SNT. Las neuronas positivas para el ARNm de GlyT2 y las positivas para el ARNm de PHOX2B no se colocalizaron.Una subpoblación de neuronas NTS positivas para ARNm de PHOX2B era tirosina hidroxilasa inmunorreactiva, y ninguna contenía ARNm de GlyT2. El ARNoscopio permite la visualización y el análisis de la distribución del ARN con una resolución de una sola molécula en células y tejidos. Potencia la investigación de nuevas especies de ARN, mecanismos de enfermedades, patrones de expresión génica, diversidad de neuronas e interacciones celulares.

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Investigación

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Neurociencia

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Preparación del tejido de cerebro de ratón para inmunomicroscopía

Doble fluorescencia In situ La hibridación en las secciones del cerebro fresco

Una combinación de diferentes técnicas para maximizar la recogida de datos a partir de tejido de ratón se presenta.

La combinación de colorantes lipofílicos, In situ</emHibridación>, inmunohistoquímica y la histología

Fuente: Jolly, S., et.al. Combinación de hibridación de doble fluorescencia in situ con inmunomarcaje para la detección de la expresión de tres genes en secciones de cerebro de ratón. J. Vis. Exp. (2016). Este video demuestra el uso de la hibridación in situ de doble fluorescencia para visualizar la expresión de dos dianas de ARN en secciones del cerebro de ratón. El protocolo implica la detección secuencial de ARN mediante sondas marcadas con isotiocianato de fluoresceína y digoxigenina,...

 Realización de hibridación in situ de doble fluorescencia para detectar la expresión génica en secciones del cerebro de ratón

Fuente: Baleriola, J., et. al., Detección de ARNm localizados axonalmente en secciones cerebrales mediante hibridación in situ de alta resolución.  J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra la detección de ARNm dentro de axones colinérgicos en cortes fijos de hipocampo de ratón utilizando hibridación fluorescente in situ y tinción de anticuerpos. La microscopía de fluorescencia revela la localización espacial de los ARNm marcados con sonda y la colina acetiltransferasa en las neuronas...

Inmunotinción de neuronas en cortes de cerebro de ratón después de la hibridación fluorescente in situ

La localización de la expresión génica a tipos específicos de células puede ser un desafío debido a la falta de anticuerpos específicos. En este trabajo describimos un protocolo para la detección simultánea de la triple expresión génica mediante la combinación de hibridación in situ de ARN de doble fluorescencia con inmunotinción.

La combinación de doble fluorescencia<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación con Immunolabelling para la detección de la expresión de tres genes en las secciones de cerebro de ratón

Este protocolo describe un flujo de trabajo paso a paso para la costaría inmunofluorescente de IBA1 y TMEM119, además del análisis de la densidad microglial, la distribución y la morfología, así como la infiltración de células mieloides periféricas en el tejido cerebral del ratón.

Tinción de inmunofluorescencia utilizando IBA1 y TMEM119 para la densidad microglial, morfología y análisis de infiltración de células mieloides periféricas en el cerebro del ratón

Describimos un método de tinción rápida para realizar imágenes multiespectrales en tejidos congelados.

Un método rápido para imágenes de fluorescencia multiespectral de secciones de tejido congelado

La técnica de flotación libre permite a los investigadores realizar tinciones histológicas, incluida la inmunohistoquímica en secciones de tejido fijo para visualizar estructuras biológicas, tipo de célula y expresión y localización de proteínas. Esta es una técnica histoquímica eficiente y confiable que puede ser útil para investigar una multitud de tejidos, como el cerebro, el corazón y el hígado.

Tinciones histológicas con secciones de tejido flotante libre

Este protocolo describe un enfoque eficiente y reproducible para los estudios histológicos cerebrales de ratón, incluida la perfusión, la seccionamiento cerebral, la inmunotinción flotante, el montaje de tejidos y las imágenes.

Inmunotinción flotante de cerebros de ratón

Aprende a combinar hibridación in situ de fluorescencia con inmunohistoquímica en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas. Este método permite visualizar ARN y proteínas simultáneamente para estudiar poblaciones neuronales.

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Combinación de hibridación in situ de fluorescencia múltiple con inmunohistoquímica fluorescente en secciones de cerebro de ratón frescas, congeladas o fijas

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