Una estrategia para validar el papel de callosa mediada Plasmodesmal de apertura de puerta en la respuesta Tropic

El objetivo general de este procedimiento es examinar los genes implicados en la activación plasmodesmal mediada por callosa durante la respuesta trópica. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo de las plantas, como qué genes desconocidos controlan la señalización de célula a célula por plasmodesmos durante la respuesta trópica. La principal ventaja de esta técnica es que es sencilla, funciona también y se repite.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el manejo de los hipocótilos etiolados de Arabidopsis sin ningún daño durante todo el proceso es un desafío. La primera vez que tuvimos la idea de este método fue cuando establecimos la regla de GSL8, una glucosa sintasa en la activación plasmodásmica. La demostración visual de este método es fundamental, ya que los procedimientos mencionados en el audio no han explicado los pasos críticos, que son difíciles de ejecutar porque necesitaban una configuración y un manejo especiales.

Prepare Murashige y Skoog, o medio MS, un día antes del experimento. Esterilizarlo en autoclave y llenar placas cuadradas de 125 milímetros con 50 mililitros de medio por placa. Al día siguiente, coloque las semillas que han sido esterilizadas con hipoclorito de sodio al 1,1% en placas semisecas.

A partir de una punta de micropipeta de 1 milímetro, salpique las semillas con 200 microlitros de agua. Coloque las semillas en cinco filas, a 1,8 centímetros de distancia, con las semillas separadas por un mínimo de 0,1 centímetros en las filas. Deje que se evapore un poco de agua antes de cubrir y sellar las placas con cinta quirúrgica.

Luego envuelva los platos en papel de aluminio y colóquelos dentro de una caja. Incubar la caja a cuatro grados centígrados durante tres días. Después de tres días de tratamiento en frío, transfiera la caja de semillas a 22 grados centígrados durante tres días.

Después de tres días más, en una habitación oscura, verifique el estado de germinación de las semillas bajo luz verde. Por lo general, las plántulas etioladas Col-0 de tres días de edad crecen hasta 1,6 centímetros de largo. Bajo la luz verde, analice la respuesta fototrópica y gravittrópica alterada.

Con una púa esterilizada, seleccione plántulas de tamaño similar con crecimiento recto y vertical. Levante suavemente las plántulas de la parte más baja de su hipocótilo sin tocar ninguna otra parte. Luego, transfiera con cuidado las plántulas seleccionadas a una placa de agar MS fresca.

En el nuevo plato, oriente los ganchos de las plántulas de la misma manera. Seleccione al menos 20 plántulas de cada fondo genético para hacer cada fila y haga un duplicado de cada plato. Cada placa contiene dos genotipos en dos filas.

Para verificar la respuesta fototrópica, coloque las placas en una caja negra para que las plántulas estén orientadas verticalmente. Deje un lado de la caja abierto hasta el borde de los platos. Luego, incuba la caja en una cámara de crecimiento de plantas con luz blanca unilateral.

Para verificar la respuesta gravitótropa, envuelva los platos con papel de aluminio y colóquelos en una caja negra para que las plántulas queden horizontales. En varios puntos de tiempo, generalmente comenzando a los 90 minutos y extendiéndose a 12 horas, tome imágenes de las placas en condiciones de poca luz. Utilice un conjunto de escáner para recopilar imágenes JPEG de 600 PPP.

Para medir el ángulo de flexión de las plántulas, cargue sus imágenes en el software ImageJ. Utilice la herramienta de aumento para acercar y desplácese hasta una plántula para analizarla. Luego use la herramienta de ángulo para medir el ángulo en el que se dobla la plántula.

Para hacer esto, haga doble clic con el botón izquierdo en el punto A de la dirección de crecimiento del hipocótilo original y arrastre el mouse hasta el punto de inicio de flexión B. Luego, use un clic izquierdo para dibujar la primera línea. Ahora, arrastre el mouse desde el punto B hasta el extremo de flexión, el punto C, y use un clic izquierdo para dibujar la segunda línea, formando un ángulo, A. El verdadero ángulo de flexión es el ángulo B, que es igual a 180 grados menos el ángulo A. Ahora, mida y registre el ángulo A presionando M en el teclado. El archivo de resultados se abrirá por separado.

Repita el paso anterior para medir el resto de las plántulas y mida el ángulo promedio de dos fondos diferentes utilizando el archivo de hoja de cálculo del conjunto de datos. La preparación de los bloques de agarosa HPTS necesarios para este ensayo se trata en el protocolo de texto. Comience con la preparación de las muestras de plantas.

En este ejemplo, se analizan mutantes con un límite de exclusión del tamaño de los plasmodesmos alterado. En primer lugar, cree una plataforma para el ensayo. Coloque un portaobjetos de la cubierta del microscopio en una nueva placa de medio MS.

A continuación, de las placas MS con plántulas etioladas de tres días, use unas tijeras quirúrgicas afiladas para extraer cuidadosamente las plántulas de la base del anzuelo y transfiéralas al cubreobjetos. Transfiera al menos cinco plántulas por fondo genético. Oriente las plántulas de modo que solo 0,5 centímetros de hipocótilo de la posición de escisión permanezcan en el portaobjetos de cobertura y el resto del hipocótilo toque el medio.

Luego, coloque un bloque de agarosa HPTS encima de las plántulas extirpadas para que el área extirpada esté en contacto con el bloque HPTS. Asegúrese de que se haga el contacto. Deje que el bloque se asiente sobre los hipocótilos durante cinco minutos.

Luego, transfiera los hipocótilos a una placa de Petri de 10 milímetros que contenga agua bidestilada y lávelos agitándolos durante 15 minutos. A continuación, transfiera las plántulas lavadas a un portaobjetos. Coloque cada mutante junto a un control para hacer comparaciones directas.

Cubra los hipocótilos con 100 a 150 microlitros de agua bidestilada y aplique un portaobjetos de cobertura. Ahora, analice el portaobjetos utilizando microscopía confocal como se describe en el protocolo de texto. Para este ensayo, use un tinte recién preparado que tenga menos de dos días y que se mantenga en la oscuridad.

Para inhibir la síntesis de calosa de novo, agregue 1,5 milimolar de 2-desoxi-D-glucosa al colorante. Comience este ensayo seleccionando plántulas etioladas de tres días de edad para la tinción de calosa, con o sin respuesta trópica. Corta las plántulas de su región de gancho con unas tijeras quirúrgicas finas.

Luego, con la punta de un palillo, transfiera las plántulas a una pequeña placa de Petri que contenga dos mililitros de tampón para manchas. Incubar las plántulas en el tampón de tinción en la oscuridad durante dos horas con agitación continua a 30 RPM. Después de teñir, lave las plántulas con agua destilada doble durante dos minutos para eliminar el exceso de tampón de tinción.

Una vez lavado, seleccione al menos cinco plántulas de cada fondo para el análisis confocal. Mida la intensidad de la señal de calosa con el software ImageJ. Abra el archivo de microscopía confocal ya guardado en formato JPEG en el software de imágenes.

A continuación, con la herramienta de selección rectangular, arrastre el cursor sobre la imagen y seleccione el área que se va a examinar. A continuación, mida y registre los valores numéricos de la intensidad de la señal pulsando M.El archivo de resultados se abrirá por separado. En el archivo de resultados, el término "Media" indica la intensidad de la señal del área seleccionada, no la media de varias áreas.

Uno por uno, analice la señal de esta manera para cada plántula. Repita el paso anterior para medir el resto de las plántulas y mida el ángulo promedio de dos fondos diferentes utilizando el archivo de hoja de cálculo del conjunto de datos. Utilizando los protocolos descritos, se analizaron las líneas de ARNi inducibles por dexametasona de AtGSL8.

Las plántulas de DsGSL8 eran claramente defectuosas en fototropismo y gravitropismo. No mostraron flexión bajo la influencia de ninguna de las dos fuerzas. Las alteraciones en el movimiento siplásmico mostraron que el movimiento del colorante HPTSA fue sustancialmente más extenso en las eliminaciones de ARNi de dsGSL8 que en cualquiera de los controles.

La callosa es uno de los reguladores clave del límite de exclusión del tamaño de los plasmodesmosmos, y AtGSL8 es una conocida calosa sintasa de plasmodesmos. Por lo tanto, se llevó a cabo la tinción con azul de calosa anilina. En el control, la calosa se acumuló después de seis horas, marcada con flechas amarillas.

Sin embargo, después de seis horas, los mutantes tenían niveles persistentemente bajos de plasmodesmos calosa. Esta ausencia de síntesis de calosa fue mensurablemente menor tan pronto como tres horas después del fototropismo. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo hacer un cribado rápido de genes en el control de variantes de activación plasmodesmal debido a la respuesta trópica mediante la modulación pura callosa.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente seis horas después de tres días de germinación de las plántulas de Arabidopsis. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe evitar dañar las plántulas mientras las transfiere. Además, es importante hacer un contacto adecuado entre el agar y el hipocótilo durante el ensayo de carga.

Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino de la biología del desarrollo para explorar genes, nuevos genes, que juegan un papel en el control de la conductividad simpásmica durante el trópico