Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

El objetivo general de este procedimiento es identificar la señal de localización de plasmodesmos en proteínas diana. El método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las conexiones intercelulares de las plantas, identificando los elementos esenciales en las señales que dirigen a las proteínas hacia los plasmodesmos, lo que a su vez facilita el transporte de moléculas grandes de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento es confiable y puede adaptarse fácilmente para el descubrimiento de secuencias de señales de localización en plasmodesmos en la mayoría de las proteínas dirigidas a estos.

La demostración en video de este método es fundamental, ya que los pasos de siembra, filtración y preparación para la observación confocal son difíciles de aprender mediante publicaciones impresas convencionales. Siembre semillas de planta de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo y con alta densidad. Durante el crecimiento, manténgalas en una cámara ambiental controlada a una temperatura de 20 a 25 grados Celsius y bajo 16 horas de luz por día, que contiene aproximadamente 75 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo.

Una vez que el diámetro del u. fil alcance medio centímetro, traslade cuidadosamente las plántulas a macetas más grandes y continúe su crecimiento en la misma cámara y bajo las mismas condiciones. Mantenga las plantas hasta que alcancen de cuatro a ocho hojas dentro de cuatro semanas.

En este punto, las hojas más grandes deben tener entre cuatro y seis centímetros de diámetro. Para facilitar la identificación y el análisis, seleccione un sistema de expresión y marque fluorescentemente cada proteína expresada según se describe en el protocolo de texto adjunto. Prepare un plásmido basado en pPZP-RCS2 según se indica y agregue un microgramo del mismo a un cultivo de 100 microlitros de células competentes de Agrobacterium tumefaciens.

Incube las células en hielo durante 30 minutos. Luego, congele rápidamente las células en nitrógeno líquido durante un minuto. A continuación, caliente las células a 28 grados Celsius durante 15 minutos y agregue un mililitro de medio LB a la mezcla de células competentes.

Después de agregar el medio LB, coloque las células nuevamente a 28 grados Celsius durante dos horas. A continuación, centrifugue las células a 3.000 ×g durante un minuto. Reuspenda el botón celular en 0,2 mililitros de medio LB y siembre en placas de agar LB selectivo con antibiótico.

Cultive las células en las placas a 28 grados Celsius durante 48 horas hasta que sean visibles colonias individuales. Luego, seleccione y plaque varias colonias individuales en placas frescas de agar LB y cultive las células a 28 grados Celsius durante 48 horas. A continuación, tome una pequeña cantidad de bacterias de cada placa para su análisis y utilice la PCR de colonia para confirmar la presencia de los constructos binarios específicos de interés.

Agregue cada colonia de agrobacterium con el constructo de interés a cinco mililitros de medio LB suplementado con los antibióticos apropiados. Incube las células durante la noche a 28 grados Celsius. Luego, centrifugue las células a 3.000 × g. Resuspenda el precipitado a una DO600 de 0,5 en tampón de agroinfiltración.

Incube la suspensión durante dos horas a temperatura ambiente y luego cargue el inóculo en una jeringa plástica de un mililitro. Sosteniendo una hoja completamente madura de N.Benthamiana con un dedo enguantado sobre la cara adaxial, presione la boquilla de la jeringa contra la epidermis inferior de la hoja. A continuación, introduzca lentamente el agrobacterium en el medio de infiltración inyectando el medio.

Mantenga la planta infiltrada hasta el momento de su observación. Utilice una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas, entre 24 y 48 horas después de la infiltración. Coloque los trozos de hoja sobre el portaobjetos con la superficie abaxial de la hoja orientada hacia arriba.

Luego, coloque una gota de agua sobre el corte del foliar y cúbralo con el cubreobjetos. Inmovilice el cubreobjetos con pequeños trozos de cinta en cada lado. Transfiera un portaobjetos debajo de un microscopio confocal de barrido láser y utilice un objetivo subjetivo de 10X para identificar las células con la mejor señal.

Luego, utilice una lente objetiva de 63X para registrar imágenes con observaciones más detalladas. Además, utilice los fluoróforos adecuados para excitar las proteínas fluorescentes expresadas. Mantenga todos los ajustes utilizados para la adquisición de imágenes con el fin de conservar la consistencia entre los experimentos.

Examine en promedio de 100 a 120 células para cada condición experimental. Diagnostique la localización de las proteínas analizadas mediante las imágenes del microscopio confocal. Estas imágenes ilustran los patrones característicos de localización periférica punteada en los plasmodesmos observados para la proteína de movimiento completa del TMV fusionada a la molécula transportadora CFP, para la señal de localización en plasmodesmos identificada fusionada a CFP, así como para la proteína de localización en plasmodesmos coexpresada, PDCB1 fusionada a DsRed.

Bajo condiciones de control, la localización de la proteína de movimiento completa del TMV fusionada a CFP y la señal de localización en la proteína de movimiento del TMV fusionada a CFP en los plasmodesmos aparece como se muestra aquí con la localización subcelular de CFP y la localización nucleocitoplasmática del marcador DsRed2. Cuando el cuarto aminoácido, valina, se muta a alanina, se pierde la localización en los plasmodesmos tanto de la proteína de movimiento completa del TMV como de la señal de localización identificada en la proteína de movimiento del TMV. Esto indica que este residuo es importante para la estructura o función de la señal de localización en los plasmodesmos.

Una vez dominada, esta técnica puede completarse en 50 horas si se realiza adecuadamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener las plantas en muy buenas condiciones y en la etapa foliar adecuada. Después de ver este video, deberías tener una buena comprensión, no solo de cómo identificar la señal de la proteína de localización de los plasmodesmos, sino también de cómo identificar otras señales específicas en proteínas vegetales.