Name: Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 7 s
Description: Aprende a identificar señales de localización en plasmodesmos de proteínas en plantas usando Nicotiana benthamiana. Este método confiable facilita el estudio del transporte intercelular y la fisiología vegetal.

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La falta de espacio, hemos citado sobre todo artículos de revisión, y pedimos disculpas a nuestros colegas cuyo trabajo original no fue citado. El trabajo en el laboratorio de V.C. es apoyado por becas del NIH, NSF, USDA/NIFA, BARD y BSF a V.C., y el laboratorio de SGL es apoyado por los NIH y los fondos de los departamentos de Fitopatología y biología planta-microorganismo a SGL

1. Material vegetal
<ol><li>Elección de especies vegetales</li>
	<li>Uso de la especie de planta nativa de la proteína de interés, es decir, uno que codifica esta proteína proteínas endógenas o que representa el huésped natural para el patógeno para las proteínas virales. Además, las especies seleccionadas deben ser susceptibles del elegido método de transformación genética transitoria. Nota: Los estudios emplean rutinariamente Nicotiana benthamiana, que representa un buen anfitrión para TMV y se transforma eficientemente por la técnica de transformación genética mediada por Agrobacterium, es decir, agroinfiltration (ver paso 3). Las plantas de N. benthamiana también se cultivan fácilmente y tienen hojas grandes, que son fácilmente inoculadas por Agrobacterium y fácilmente analizadas por microscopia confocal.</li>
	<li>
Crecimiento de las plantas
	<ol>
<li>Planta semillas de N. benthamiana en suelo mojado en alta densidad. Mantenerlas en una cámara de ambiente controlado en 20-25 ° c bajo 16 h de luz ~ 75 μmol de fotones m-2 s-1 y 8 h de oscuridad. Después de que el diámetro de euphyll llega a 0,5 cm, cuidadosamente transfiera las plantas de semillero a macetas más grandes y continuar el crecimiento en la misma cámara en las mismas condiciones.</li>
		<li>Mantener las plantas hasta que crecen a 4-8-hojas dentro de 4 semanas cuando las hojas más grandes son 4-6 cm de diámetro; en este momento, pueden ser utilizados para agroinfiltration (ver paso 3). Nota: Importante, no utilice las plantas si comenzaron a florecer porque, en esta etapa del desarrollo, la arquitectura de la hoja varía a menudo24,25, a veces lleva a resultados inconsistentes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. construcción del Vector de expresión
<ol><li>
Elección del sistema de la expresión
	<ol>
<li>Elegir la expresión sistema, es decir, vectores y vectores método de entrega, más adecuado para la expresión de la proteína de interés en las especies de plantas estudiadas. Nota: En ocasiones, tales combinaciones específicas de proteína/especies probadas pueden requieren vectores específicos y vectores método de entrega para la expresión óptima y función de la proteína de interés. De plantas dicotiledóneas más, sin embargo, seleccionar plásmidos binarios como vectores de expresión y agroinfiltration como sistema de entrega.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Proteína fluorescente etiquetado
	<ol>
<li>Etiqueta fluorescente cada proteína expresada para el análisis de su distribución subcelular22, incluyendo localización de Pd. Nota: Emplear proteínas autofluorescent, como PPC y DsRed2, como etiquetas. Etiqueta de la proteína prueba con PPC y coexpresan con un DsRed2 gratis. Funciones CFP como etiqueta y como una molécula de carga no relacionadas con virus. Funciones DsRed2 para calibrar la eficiencia global de la expresión transitoria y, por ser la célula autónoma, para identificar la célula inicialmente transformada; Esta última función es importante al evaluar el movimiento célula a célula de proteínas prueba potencialmente no celular-autónomos. Para coexpression con el marcador de Pd PDCB1, que también es la célula autónoma, etiqueta de la proteína prueba con el CFP y PDCB1 con DsRed2.</li>
		<li>Como regla general, fusible de la etiqueta de autofluorescent para la terminal carboxilo de la proteína expresada. Sin embargo, si las exposiciones tagged proteína prueba larga duración dirigidos a Pd, traslado la etiqueta al término amino de la proteína.</li>
		<li>Copia las secuencias de codificación de las proteínas para ser probado en un vector de expresión conveniente de la planta. Nota: Hay muchos vectores de expresión plantas que permiten etiquetado fluorescente. Utilizamos una serie de pSAT plásmidos26 o algunos de sus derivados27,28, que son convenientes para la clonación de la secuencia de interés directamente en marco con las etiquetas autofluorescent sugerido (ver paso 2.2.1) en ambos amino- y orientaciones del carboxilo terminal.</li>
		<li>Transferir cada cassette de expresión en un vector binario de Agrobacterium. Nota: Aunque construcciones basadas en pSAT son adecuadas para la entrega de la biolística directa en los tejidos vegetales, agroinfiltration, que es el método de transformación recomendado aquí (ver paso 3), requiere que el casete de expresión que se encuentra entre el T-ADN las fronteras de un binario vector29. Nota: Todos los vectores pSAT están diseñados para permitir dicha transferencia al pPZP RCS2 multigénica expresión vector binario26,30 por un solo paso de clonación mediante nucleasas de corte raro AscI-PpoI-SceI, -CeuI, PspI PI y PI-TliI 26. investigadores que prefieren utilizar la clonación recombinatorial, p. ej., usando sitios heterólogos lox 31pueden emplear pSAT vector variantes26,27.</li>
		<li>Para coexpression, transferencia de dos casetes de expresión, por ejemplo, proteína-PPC probada y DsRed2 o probado proteína-CFP y DsRed2 PDCB1 (ver punto 2.1), el mismo vector binario RCS2 pPZP. Nota: Como alternativa, culturas de Agrobacterium albergar constructos binarios individuales se pueden mezclar juntos para infiltración en N. benthamiana (ver paso 3.1).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Agroinfiltration
<ol><li>
Añadir 1 μg de un plásmido pPZP RCS2 basado en cultura de paso 2.2.5 a 100 μl de células competentes de cepa de Agrobacterium tumefaciens EHA105 o GV3101 preparado descrito32, incubar en hielo por 30 min, flash-congelación en nitrógeno líquido durante 1 minuto, y incubar a 28 ° C durante 15 minutos.
	<ol>
<li>Luego, añadir 1 mL de medio LB (10 G/l triptona, extracto de levadura 5 g/L y 10 g/L de NaCl) a la mezcla de células competentes e incubar a 28 ° C por 2 h. vuelta hacia abajo de las células a 3.000 x g durante 1 min, volver a suspenderlas en 0,2 mL de LB y placas de LB agar suplementado con antibióticos apropiados (p. ej., espectinomicina 100 mg/L y 50 mg/L rifampicina pPZP RSC2 basado en vectores26,30). Crezca a 28 ° C durante 48 h, hasta colonias individuales son visibles.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Recoger y placa varias colonias individuales sobre una placa fresca de agar LB (ver paso 3.1), crecen en 28 ° C durante 48 h y tomar una pequeña cantidad de bacterias para el análisis por PCR de Colonia33 para confirmar la presencia de los constructos binarios específicos.</li>
	<li>
Crecer cada colonia de Agrobacterium con el constructo de interés durante la noche a 28 ° C en 5 mL de medio LB suplementado con antibióticos apropiados (ver paso 3.1.1). Centrifugar las células a 3.000 x g y vuelva a suspenderlos OD600= 0,5 en agroinfiltration buffer (10 mM de MgCl2, 10 mM MES (pH 5.6), 150 μm acetosiringona). Incubar por 2 h a temperatura ambiente.
	<ol>
<li>Si se utiliza una mezcla de plásmidos binarios en lugar de un plásmido de expresión multigénica solo para el coexpression de proteína, mezcla las culturas de célula correspondientes en proporción de 1:1 v/v antes de la infiltración. Luego Incube las células a 28 ° C por 2 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Cargar el inóculo en una jeringa de plástico de 1 mL y sale de la boquilla de la jeringa (sin aguja) contra la epidermis inferior (abaxial) de los completamente maduros N. benthamiana de la prensa. Sostenga la hoja con un dedo enguantado en la cara adaxial34,35.
	<ol>
<li>Introducir el Agrobacterium en medio de la infiltración por inyección lenta. Para la significación estadística, infiltrarse en varias hojas en cada planta. Nota: Tenga en cuenta que las hojas más viejas no se utilizan como no rinden niveles de expresión coherente.</li>
		<li>Inocular hojas todo in situ. Mantener la planta infiltrada hasta la observación como se describe en el paso 1.2.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. confocal microscopio
<ol><li>Use una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas 24-48 h después de la infiltración, (dependiendo de la eficacia de la expresión transitoria de la proteína específica de la prueba); el tamaño de cada rebanada de tejido debe ser tal que el segmento está totalmente cubierto por el vidrio de cubierta (22 mm x 40 m m) usado para microscopía.</li>
	<li>Deslizan las láminas de la hoja en el objeto con la superficie abaxial de la hoja hacia arriba, coloque una gota de agua en el segmento de hoja y cubrir con la cubierta de vidrio. Inmovilizar el vidrio de cubierta con pequeños trozos de cinta en cada lado.</li>
	<li>
Observar los tejidos agroinfiltrated bajo un microscopio confocal de escaneo láser y grabar las imágenes resultantes.
	<ol>
<li>En primer lugar, utilice un objetivo de 10 X para identificar las células con la señal y luego usar 63 x objetivo de observaciones más detalladas.</li>
		<li>Uso el 458 nm longitud de onda un láser de ion argón para excitar PPC y 543 nm para excitar DsRed2. Guarde todos los ajustes para la adquisición de la imagen, es decir, intensidad de laser y photomultiplier tubo (PMT) ajustes, entre experimentos. En promedio, examinar las células de 100-120 para cada condición experimental.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. identificación de los PLS
<ol><li>Diagnosticar la localización de la proteína prueba utilizando microscopio confocal (sección 4). Comprobar si la proteína probada tiene el característico patrón punteado periférico25,36,37,38,39,40,41 y colocalizes con el marcador de Pd PDCB123. Esto indica que la proteína probada más probable es que contiene secuencias PLS.</li>
	<li>Después de confirmación de la actividad PLS de proteínas probadas, progresivamente subdividir su marco de lectura abierto (ORF) (número de genbank BAF93925.1) en fragmentos más pequeños, autofluorescently, (por ejemplo, PCP) etiqueta cada uno de ellos y analizar su localización subcelular como se describe en el paso 4. Inicialmente, se recomienda el tamaño de 100 residuos de aminoácidos para cada fragmento subdividido.</li>
	<li>Subdividir aún más los fragmentos truncados que tienen la actividad PLS y compruebe su localización subcelular como se describe en el paso 4 hasta el fragmento más pequeño que todavía se localiza a Pd, es decir, es suficiente para el transporte de la carga de etiqueta autofluorescent EP, se identifica. Este fragmento se supone para representar la secuencia PLS.</li>
	<li>Eliminar el supuesta PLS de la proteína prueba integral, es decir, la parte restante de la proteína prueba sin supuesta PLS autofluorescent etiqueta del fusible y determinar la localización subcelular de la proteína del mutante resultante como se describe en el paso 4. Si esta proteína mutante que carece del supuesta PLS no logra localizar a Pd, esto indicará que el identificado PLS no es solamente suficiente (véase paso 5.3), pero también necesario para el transporte de la Pd de la proteína prueba.</li>
	<li>Agroinfiltrate las hojas con una mezcla de culturas de Agrobacterium albergar la expresión construyen para el CFP-tagged PLS y DsRed2 libre (véase el paso 3.3). Observar el tejido infiltrado con microscopio confocal con objetivo de 10 x con la misma configuración en el paso 4.3.</li>
	<li>Puntuación de las celdas que contienen señales de PPC y DsRed2 como células inicialmente infiltradas y marcar las células adyacentes que contenía sólo la señal de la política pesquera común que ese movimiento de exposición. Nota: Este paso examina el PLS identificado por su potencial capacidad de movimiento de célula a célula; Esto es porque muchas proteínas que Pd (mayoría incluya planta de MPs virales) también se mueven a través de la Pd a las células vecinas. La concentración de Agrobacterium utilizada para la infiltración depende de la eficacia de la expresión de diferentes estructuras respectivamente. Para agroinfiltration, asegúrese de utilizar la dilución de la cultura de célula que garantiza (i) transformación de las células, dejando las células adyacentes transformaciones, (ii) alcanza una eficacia similar de la expresión. Por ejemplo, nuestros experimentos utilizan OD600 de 0.01 y 0.005 para la expresión de CFP-tagged PLS y DsRed2 libre, respectivamente.</li>
</ol>6. identificación de residuos clave PLS con alanina análisis42
<ol><li>Utilizar protocolos de PCR para amplificar el PLS codificación secuencia empleando a un par de cartillas diseñadas para contener la mutación deseada, es decir, sustitución del residuo del aminoácido blanco con alanina, alrededor de la región central de cada cartilla, como se describe 21. llevar a cabo el primer diseño y el uso del kit de mutagénesis sitio-dirigida por mutagénesis sitio-dirigida según las instrucciones del fabricante.</li>
	<li>Purificar los productos resultantes de la polimerización en cadena usando cualquier estándar kit de purificación de DNA y digerirlos a 37 ° C con DpnI para eliminar el parental (es decir, no transformado) desnaturalizado y hemimethylated la DNA. Esto enfriar durante 5 min a temperatura ambiente (no con hielo). Luego transformar la mezcla directamente en células competentes de e. coli 43e identificar colonias con las construcciones mutantes deseadas como se describe en el paso 3.2.</li>
	<li>Introducir las construcciones mutantes en el vector binario tal como se describe en el paso 2.2.4 realizar agroinfiltration como se describe en el paso 3 y evaluar Pd dirigido a como se describe en los pasos 4 y 5.1.</li>
</ol>

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</ol>

No hay conflicto de interés declarado.

Este protocolo tiene cuatro componentes fundamentales: el concepto de identificación de una secuencia que es necesario y suficiente para apuntar a Pd, división sistemática de la proteína de interés en los fragmentos que se reducen progresivamente en longitud, la prueba de fusión fragmentos de una proteína autofluorescent que sirve como etiqueta y como carga macromolecular y análisis funcional de EP objetivo en la vida de la planta tejidos después de la expresión transitoria de las proteínas de fusión probado. Tenga en cu...

Plasmodesmos (Pd) funcionan como conductos para el transporte intercelular de los reguladores claves del desarrollo de la planta y la morfogénesis, que van desde factores de transcripción a ARNm y pequeñas moléculas de ARN. Además, esta capacidad de transporte macromolecular de la EP es utilizada por la mayoría virus de planta para su diseminación intercelular durante la infección; para desplazarse por Pd, virus de plantas han evolucionado las proteínas especializadas, como proteínas de movimiento (MPs), que se dirigen específicamente a Pd1,2,3,4,5,6 , 7. vías moleculares de transporte Pd probablemente están íntimamente interconectadas con las secuencias específicas que atacan las proteínas transportadas en estas vías. Así, la identificación de estas señales de localización de Pd (PLSs) puede ser diagnóstico de la vía de transporte Pd correspondiente. Esto es por analogía de Pd transporte8, por ejemplo, la importación nuclear diferentes caminos, que pueden ser específicos para diferentes localización nuclear (NLS) de señal secuencias9,10. Conceptualmente, la NLSs y PLSs representan no escindibles subcelulares dirigidos a secuencias necesarias y suficientes para dirigir. Sin embargo, a diferencia de la NLSs11, la información de la secuencia sobre PLSs es severamente limitada. Específicamente, solamente cuatro secuencias de la proteína involucradas en la orientación de la Pd se han divulgado, con todos ellos derivados de proteínas endógenas de la planta. La primera está representada por un dominio de homeobox de KN112 – un factor de transcripción que se desplaza de las capas internas de la célula a la epidermis de la planta hoja13 – y sus homólogos de KNOX14. El segundo también es de un factor de transcripción, Dof, que contiene una supuesta PLS calificó el tráfico intercelular (IT) tema15. Es la tercera secuencia de la proteína de membrana de PDLP1 residente en plasmodesmos tipo 1, y está representado por un dominio transmembrana16. Por último, el cuarto Pd a secuencia fue divulgado recientemente de glicosilfosfatidilinositol (GPI)-proteínas ancladas y está representada por la modificación de glicosilfosfatidilinositol (GPI) señal17.
Curiosamente, hasta hace poco, no PLSs se han divulgado para MPs virales. Estudios previos indicaron la presencia de supuestas secuencias PLS en planta MPs virales18,19, pero no verdadera PLS, es decir, una secuencia de aminoácidos mínimo necesaria y suficiente para Pd contra una carga sin relación () molécula e.g., PPC) ha sido identificada en un MP viral. Sin embargo una de estas proteínas, MP del virus del mosaico del tabaco (TMV), fue el primero que Pd localización y transporte han sido demostrado20.
Para hacer frente a este vacío, hemos desarrollado una estrategia experimental para identificar TMV MP PLS. Esta estrategia se basa en tres conceptos. (i) define PLS como una secuencia de aminoácidos mínimo que es necesario y suficiente para apuntar de la proteína a Pd21. (ii) porque la MP del TMV Pd se dirige primero y luego se transloca a través de estos canales22, apuntamos a desacoplar estos dos actividades e identificando el PLS de buena fe, que funciona sólo para apuntar Pd y no para el transporte posterior. (iii) se analizaron PLS identificado para residuos de aminoácidos importantes para su EP dirigidos a la actividad, ya sea estructural o funcional. Usando este acercamiento, delineó una secuencia 50-amino ácida del residuo en el amino terminal de la MP del TMV que actúa como auténtico PLS. Esto se hace produciendo una serie de fragmentos de la MP del TMV que satura toda la longitud de la proteína, marcado su carboxilo-termini con PPC y transitoriamente expresarlos en los tejidos vegetales. Localización de la PD de cada uno de los fragmentos prueba determinó coexpressing con una proteína del marcador de Pd, PDCB1 (proteína 1 de Unión Callosa Pd)23. El fragmento más pequeño que todavía había localizado en Pd, pero no lo hizo atravesar Pd, era considerado para representar PLS. Finalmente, lo PLS fue alanina-explorado para determinar los residuos de aminoácidos clave para su estructura o función.
Mientras que aquí ilustramos este enfoque describiendo la identificación de la MP del TMV PLS, pueden ser empleado para descubrir PLSs en cualquier otras proteínas orientada a Pd, ya sea codificado por patógenos o por las plantas Esto es porque nuestro método no aprovechar cualquier características únicas de las MPs virales con respecto a su capacidad de destino a Pd.

<table><tbody><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal (CLSM)</td><td>Zeiss</td><td>LSM5</td><td>Cualquier CLSM con capacidades similares es apropiado</td></tr><tr><td>Software Zen para la obtención de imágenes de microscopio confocal</td><td>Zeiss</td><td>versión 2009</td><td>El software debe ser compatible con el CLSM utilizado por el</td></tr><tr><td>kit de mutagénesis dirigida al sitio Quickchange II&nbsp;</td><td>Agilent</td><td>200523</td><td></td></tr><tr><td>Acetosiringona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>69892</td><td></td></tr><tr><td>Jeringas sin agujas</td><td>BD</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>FisherScientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>Spectinomycin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S4014</td><td></td></tr><tr><td>Rifampicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3501</td><td></td></tr><tr><td>Ampicilina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td></td></tr></tbody></table>

identificación de secuencias de localización plasmodesmal en proteínas en planta

Identification of Plasmodesmal Localization Sequences in Proteins In Planta

Plasmodesmos (Pd) son las conexiones de la célula a célula que funcionan como puertas de enlace a través del cual se transportan las moléculas grandes y pequeñas entre las células vegetales. Considerando que el transporte de Pd de pequeñas moléculas, como iones y agua, se presume para ocurrir pasivamente, transporte célula a célula de las macromoléculas biológicas, tales proteínas, probablemente se produce mediante un mecanismo activo que involucra señales específicas de focalización en la molécula transportada. La escasez de señales de localización identificados plasmodesmos (Pd) (PLSs) ha restringido severamente la comprensión de la proteína-clasificación vías implicadas en la planta transporte macromolecular de la célula a célula y la comunicación. De una amplia variedad de plantas endógenas y virales proteínas conocidas al tráfico a través de la Pd, PLSs sólo tres han divulgado hasta la fecha, todas ellas de proteínas endógenas de la planta. Por lo tanto, es importante desarrollar una estrategia experimental confiable y sistemática para identificar una secuencia funcional de PLS, que es necesario y suficiente para apuntar Pd, directamente en la vida de las células de la planta. Aquí, describimos una estrategia de este tipo utilizando como paradigma de la proteína de movimiento célula a célula (MP) del virus del mosaico del tabaco (TMV). Estos experimentos, que identificaron y caracterizaron el primer planta PLS viral, puede ser adaptados para el descubrimiento de secuencias PLS en proteínas más orientada a Pd.

Los datos representativos, que fielmente ilustran los resultados esperados de los protocolos descritos e identifican la TMV MP PLS, se adaptan de Yuan et al. 21. figura 1A resume primero principales construcciones expresando el MP de TMV larga duración (1-268), TMV MP PLS (formada por los primeros 50 residuos de aminoácidos de la proteína, 1-50), y la alanina análisis derivados de V4A fusionado al CFP (generado como se describe en pasos 2....

Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

Plasmodesmata (Pd) are cell-to-cell connections that function as gateways through which small and large molecules are transported between plant cells. ...

El objetivo general de este procedimiento es identificar la señal de localización de plasmodesmos en proteínas diana. El método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las conexiones intercelulares de las plantas, identificando los elementos esenciales en las señales que dirigen a las proteínas hacia los plasmodesmos, lo que a su vez facilita el transporte de moléculas grandes de célula a célula. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento es confiable y puede adaptarse fácilmente para el descubrimiento de secuencias de señales de localización en plasmodesmos en la mayoría de las proteínas dirigidas a estos.La demostración en video de este método es fundamental, ya que los pasos de siembra, filtración y preparación para la observación confocal son difíciles de aprender mediante publicaciones impresas convencionales. Siembre semillas de planta de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo y con alta densidad. Durante el crecimiento, manténgalas en una cámara ambiental controlada a una temperatura de 20 a 25 grados Celsius y bajo 16 horas de luz por día, que contiene aproximadamente 75 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo.Una vez que el d

identification-plasmodesmal-localization-sequences-proteins

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Hibridación in situ para la localización precisa de las transcripciones de las plantas

Hemos desarrollado una técnica para probar interacciones proteína-proteína en las plantas. Una proteína amarilla fluorescente (YFP) se divide en dos fragmentos que no se superponen. Cada fragmento se clona en el marco de un gen de interés a través del sistema de puerta de enlace, lo que permite la expresión de proteínas de fusión. La reconstitución de la señal de YFP sólo ocurre cuando las proteínas interactúan investigación.

Detección de interacciones de proteínas en la planta mediante un Gateway Compatible Complementación fluorescencia bimoleculares (BiFC) del sistema

Una misión fundamental de la biología celular es definir los mecanismos que subyacen a la identidad de los orgánulos que hacen que las células eucariotas. Aquí proponemos un método para identificar los genes responsables de la integridad morfológica y funcional de los orgánulos de las plantas mediante microscopía de fluorescencia y la próxima generación de herramientas de secuenciación.

Fluorescencia microscopia de Selección y secuenciación de próxima generación: Herramientas útiles para la identificación de genes implicados en la integridad de los Orgánulos

Este trabajo describe un nuevo método para la orientación selectiva de orgánulos subcelulares en las plantas, ensayada mediante la pistola de genes BioRad.

Expresión génica transitoria en tabaco utilizando Asamblea Gibson y la pistola de genes

Formación de complejos de proteínas in vivo puede ser visualizado por complementación de fluorescencia bimolecular. Parejas de interacción se fusionan a partes complementarias de etiquetas fluorescentes y expresados ​​transitoriamente en hojas de tabaco, lo que resulta en una señal fluorescente reconstituido en una estrecha proximidad de las dos proteínas.

Interacciones proteína-proteína se visualizó por fluorescencia Bimolecular Complementación en protoplastos de tabaco y hojas

En este artículo se describen los métodos para seleccionar los genes que controlan la permeabilidad plasmodesmal y el gradiente de ahí auxina durante la respuesta trópico. Esto incluye la medición del grado de respuesta trópico en hipocotilo   de Arabidopsis thaliana y comprobar la permeabilidad plasmodesmal por el ácido 8-hidroxipireno-1,3,6-trisulfónico carga (HPTS) y la evaluación del nivel de fin de callosa.

Una estrategia para validar el papel de callosa mediada Plasmodesmal de apertura de puerta en la respuesta Tropic

Hemos desarrollado un novedoso método para expresar conjuntamente múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescentes en las plantas a superar las dificultades de los métodos convencionales. Toma ventaja del uso de un plásmido de expresión única que contiene múltiples proteínas funcionalmente independiente expresando cassettes para lograr la expresión de la proteína.

La expresión de múltiples proteínas de fusión quimérica de fluorescente de manera eficiente en las plantas

Enfoques basados en proteína fluorescentes para monitorear efectores secretados por las bacterias en las células del huésped son desafiantes. Esto es debido a la incompatibilidad entre proteínas fluorescentes y el sistema de secreción tipo III. Aquí, un optimizado superfolder GFP sistema se utiliza para la visualización de efectores secretados por las bacterias en la célula de la planta huésped.

Sistema proteína verde fluorescente para visualizar efectores entregado de las bacterias durante una infección

Aquí se describe un método de etiquetado de proximidad para la identificación de socios de interacción del dominio TIR del receptor inmune NLR en el tejido de hoja de Nicotiana benthamiana. También se proporciona un protocolo detallado para la identificación de interacciones entre otras proteínas de interés utilizando esta técnica en Nicotiana y otras especies vegetales.

Etiquetado de proximidad basado en TurboID para la identificación en planta de redes de interacción proteína-proteína

La traducción de la purificación de afinidad ribosoma (TRAP) ofrece la posibilidad de diseccionar programas de desarrollo con un procesamiento mínimo de órganos y tejidos. El protocolo produce ARN de alta calidad a partir de células dirigidas con una subunidad ribosomal etiquetada con proteína fluorescente verde (GFP). Las herramientas de análisis aguas abajo, como qRT-PCR o RNA-seq, revelan perfiles de expresión específicos del tejido y del tipo de célula.

Traducción de la purificación de afinidad de ribosoma (TRAP) para investigar el desarrollo de la raíz de Arabidopsis thaliana a una escala específica de tipo de célula

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Aprende a identificar señales de localización en plasmodesmos de proteínas en plantas usando Nicotiana benthamiana. Este método confiable facilita el estudio del transporte intercelular y la fisiología vegetal.

Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

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