Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta
15 de agosto de 2017
Planta las conexiones intercelulares, los plasmodesmos (Pd), juegan un papel central en la planta las interacciones planta-virus y fisiología. Crítica para el transporte de Pd son clasificación señales que dirigen las proteínas a Pd. Sin embargo, nuestro conocimiento acerca de estas secuencias es todavía en su infancia. Se describe una estrategia para identificar señales de localización de Pd en proteínas orientada a Pd.
El objetivo general de este procedimiento es identificar la señal de localización de plasmodesmos en las proteínas diana. El método puede ayudar a responder preguntas clave con el estudio de las conexiones intercelulares de las plantas mediante la identificación del pensamiento crítico en las señales que dirigen las proteínas a los plasmodesmos, lo que a su vez facilita el transporte de célula a célula de grandes moléculas. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento es fiable y se puede adaptar fácilmente para el descubrimiento de secuencias de señales de localización de plasmodesmos en la mayoría de las proteínas diana de plasmodesmos.
La demostración en video de este método es fundamental, ya que la siembra, la filtración y la preparación para los pasos de observación confocal son difíciles de aprender mediante una publicación impresa típica. Plante las semillas de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo y a alta densidad. Mientras crecen, manténgalos en una cámara ambiental controlada a 20 a 25 grados centígrados y menos de 16 horas de luz por día, que contiene alrededor de 75 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo.
Después de que el diámetro de la u. fil alcance medio centímetro, transfiera con cuidado las plántulas a macetas más grandes y continúe su crecimiento en la misma cámara en las mismas condiciones. Mantenga las plantas hasta que crezcan a la etapa de cuatro a ocho hojas dentro de cuatro semanas.
En este punto, las hojas más grandes deben tener de cuatro a seis centímetros de diámetro. Para facilitar la identificación y el análisis, elija un sistema de expresión y marque con fluorescencia cada proteína expresada como se describe en el protocolo de texto adjunto. Prepare un plásmido basado en pPZP-RCS2 como se describe y agregue un microgramo de él en un cultivo de 100 microlitros de células competentes de Agrobacterium tumefaciens.
Incuba las células en hielo durante 30 minutos. Luego, congele rápidamente las células en nitrógeno líquido durante un minuto. A continuación, caliente las células a 28 grados centígrados durante 15 minutos y luego agregue un mililitro de medio LB a la mezcla de células competente.
Después de agregar el medio LB, vuelva a colocar las celdas a 28 grados centígrados durante dos horas. A continuación, gire las celdas a 3.000 veces G durante un minuto. Vuelva a suspender el pellet celular en 0,2 mililitros de medio LB y colóquelo en placas de agar LB selectivo con antibióticos.
Haga crecer las células en las placas a 28 grados centígrados durante 48 horas hasta que las colonias individuales sean visibles. A continuación, recoja y coloque varias colonias individuales en placas de agar LB frescas y cultive las células a 28 grados centígrados durante 48 horas. A continuación, tome una pequeña cantidad de bacterias de cada placa para su análisis y utilice la PCR de colonias para confirmar la presencia de las construcciones binarias específicas de interés.
Añadir cada colonia de agrobacterium con el constructo de interés a cinco mililitros de medio LB suplementado con los antibióticos adecuados. Haga crecer las células durante la noche a 28 grados centígrados. A continuación, centrifugar las células a 3.000 veces G.Vuelva a suspender el pellet a un OD600 de 0,5 en tampón de agroinfiltración.
Incubar la suspensión durante dos horas a temperatura ambiente y luego cargar el inóculo en una jeringa de plástico de un mililitro. Sosteniendo una hoja de N. Benthamiana completamente madura con un dedo enguantado en la cara adaxial, presione la boquilla de la jeringa contra la epidermis inferior de la hoja. Luego, introduzca lentamente la agrobacteria en el medio de infiltración inyectando el medio.
Mantenga la planta infiltrada hasta que se pueda observar. Use una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas de 24 a 48 horas después de la infiltración. Coloque las rodajas de hoja en el portaobjetos con la superficie abaxial de la hoja hacia arriba.
A continuación, coloca una gota de agua sobre la rodaja de hoja y cúbrela con el cubreobjetos. Inmovilice el cubreobjetos con pequeños trozos de cinta adhesiva a cada lado. Transfiera un portaobjetos a un microscopio confocal de barrido láser y utilice una lente subjetiva 10X para identificar las células con la mejor señal.
A continuación, utiliza un objetivo subjetivo de 63X para grabar imágenes y obtener observaciones más detalladas. Además, utilice los fluorescentes adecuados para excitar las proteínas fluorescentes expresadas. Conserve todos los valores que se utilizan para la adquisición de imágenes con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos.
En promedio, examine de 100 a 120 células para cada condición experimental. Diagnostique la localización de las proteínas analizadas utilizando las imágenes del microscopio confocal. Estas imágenes ilustran los patrones característicos de localización de plasmodesmos periféricos punteados observados para la proteína de movimiento TMV de longitud completa fusionada con la molécula de carga CFP, y para la señal de localización de plasmodesmos identificada fusionada con CFP, así como para la proteína de localización de plasmodesmos coexpresada, PDCB1 fusionada con DsRed.
En condiciones de control, la focalización de los plasmodesmos de la proteína de movimiento TMV de longitud completa fusionada con CFP y la señal de localización en la proteína de movimiento TMV fusionada con CFP, aparece como se muestra aquí con localización subcelular de CFP y localización nucleocitoplasmática del marcador DsRed2. Cuando el cuarto aminoácido, la valina, muta a alanina, se pierden los plasmodesmos dirigidos tanto por la proteína de movimiento TMV de longitud completa como por la señal de localización identificada en la proteína de movimiento TMV. Esto indica que este residuo es importante para la localización, estructura o función de la señal de localización de los plasmodesmos.
Una vez dominada, esta técnica se puede terminar en 50 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las plantas deben estar en muy buenas condiciones y que las plantas estén en la etapa correcta de las hojas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión no solo de cómo identificar la señal de la proteína de localización de plasmodesmos, sino también saber cómo identificar otras señales ciertas en las proteínas de las plantas.
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Descripción general
Este estudio se centra en identificar señales de localización de plasmodesmata en proteínas diana, lo cual es crucial para comprender las conexiones intercelulares en plantas. El método descrito es fiable y adaptable para descubrir estas señales en varias proteínas dirigidas a plasmodesmata.
Componentes clave del estudio
Área de la ciencia
- Fisiología vegetal
- Biología celular
- Interacciones planta-virus
Antecedentes
- Los plasmodesmata (Pd) son esenciales para el transporte célula-célula en plantas.
- Las señales de clasificación dirigen las proteínas al Pd, facilitando el transporte.
- El conocimiento actual de estas secuencias es limitado.
- Comprender estas señales puede mejorar nuestro conocimiento de la fisiología vegetal.
Propósito del estudio
- Identificar señales de localización de plasmodesmata en proteínas diana.
- Mejorar la comprensión de las conexiones intercelulares en plantas.
- Facilitar el estudio de los mecanismos de transporte de proteínas.
Métodos utilizados
- Siembra de semillas de Nicotiana benthamiana en condiciones controladas.
- Mantener condiciones de crecimiento óptimas (20-25掳C, 16 horas de luz).
- Utilizar técnicas de observación confocal para el análisis.
- Proporcionar una demostración en video para pasos complejos.
Resultados principales
- El método identifica eficazmente las señales de localización en las proteínas.
- Es adaptable para varias proteínas dirigidas a plasmodesmata.
- Los recursos de video mejoran la comprensión del procedimiento.
- Los resultados fiables contribuyen al campo de la biología vegetal.
Conclusiones
- El estudio proporciona una técnica valiosa para identificar señales de localización de Pd.
- Comprender estas señales puede conducir a avances en la investigación de la fisiología vegetal.
- La fiabilidad del método lo convierte en una herramienta útil para los investigadores.
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Identifying plasmodesmata localization signals enables mechanistic de-risking of plant-based expression systems used in recombinant protein production. This approach supports target validation by clarifying subcellular trafficking pathways critical for biologics manufacturing in plant hosts. The method enhances predictive confidence in protein localization, informing go/no-go decisions for plant-derived therapeutic candidates.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates protein-sorting mechanisms to validate functional targeting signals necessary for plasmodesmata transport.
- Operational Value: Provides a reliable, adaptable strategy to identify necessary and sufficient localization signals directly in living plant cells.
- Predictive Value: Enables functional confirmation of targeting motifs through mutagenesis, such as valine-to-alanine substitution disrupting localization.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Uses fluorescent tagging and confocal microscopy to generate quantitative, reproducible localization readouts.
- Scalability: Supports screening of multiple protein variants via Agrobacterium-mediated transient expression in Nicotiana benthamiana.
- Platform Reuse: The workflow can be applied to diverse plasmodesmata-targeted proteins beyond viral movement proteins.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Connects discovery of localization signals to downstream evaluation of protein mobility and intercellular transport efficiency.
- Disease-Relevant System: Utilizes a well-established plant model system compatible with transient expression for rapid signal validation.
- Mechanistic De-risking: Reduces uncertainty in protein trafficking by defining cis-acting elements required for plasmodesmata targeting.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within early discovery workflows where subcellular localization informs protein engineering and construct design for plant-based expression platforms.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of targeting sequences via direct visualization of protein localization in planta.
- Screening: Enables assessment of signal functionality through co-localization with plasmodesmata markers like PDCB1-DsRed.
- Analytics: Generates imaging-based quantitative data on subcellular distribution patterns under controlled expression conditions.
- Translational Research: Provides mechanistic insight into intercellular transport, relevant for optimizing protein yield and mobility in plant bioproduction.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized pipeline for localization signal discovery applicable across multiple protein targets.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target confidence by defining minimal functional sequences required for plasmodesmata localization.
- Operational Value: Delivers a reproducible, video-supported protocol reducing variability in localization assays.
- Strategic Value: Informs construct optimization to enhance intracellular trafficking in plant expression systems.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of protein candidates based on validated subcellular targeting.
Implementation Considerations
- Requires expertise in plant transient expression, confocal microscopy, and fluorescent protein tagging.
- Dependent on Agrobacterium infiltration infrastructure and controlled plant growth chambers.
- Necessitates standardization of imaging settings and analysis criteria across experimental conditions.
- Adaptation to different plant species may require optimization of infiltration and growth parameters.
- Limited to proteins that can be stably expressed and fluorescently tagged in planta without disrupting native function.
