Identificación de secuencias de localización Plasmodesmal en proteínas en Planta

El objetivo general de este procedimiento es identificar la señal de localización de plasmodesmos en las proteínas diana. El método puede ayudar a responder preguntas clave con el estudio de las conexiones intercelulares de las plantas mediante la identificación del pensamiento crítico en las señales que dirigen las proteínas a los plasmodesmos, lo que a su vez facilita el transporte de célula a célula de grandes moléculas. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento es fiable y se puede adaptar fácilmente para el descubrimiento de secuencias de señales de localización de plasmodesmos en la mayoría de las proteínas diana de plasmodesmos.

La demostración en video de este método es fundamental, ya que la siembra, la filtración y la preparación para los pasos de observación confocal son difíciles de aprender mediante una publicación impresa típica. Plante las semillas de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo y a alta densidad. Mientras crecen, manténgalos en una cámara ambiental controlada a 20 a 25 grados centígrados y menos de 16 horas de luz por día, que contiene alrededor de 75 micromoles de fotones por metro cuadrado por segundo.

Después de que el diámetro de la u. fil alcance medio centímetro, transfiera con cuidado las plántulas a macetas más grandes y continúe su crecimiento en la misma cámara en las mismas condiciones. Mantenga las plantas hasta que crezcan a la etapa de cuatro a ocho hojas dentro de cuatro semanas.

En este punto, las hojas más grandes deben tener de cuatro a seis centímetros de diámetro. Para facilitar la identificación y el análisis, elija un sistema de expresión y marque con fluorescencia cada proteína expresada como se describe en el protocolo de texto adjunto. Prepare un plásmido basado en pPZP-RCS2 como se describe y agregue un microgramo de él en un cultivo de 100 microlitros de células competentes de Agrobacterium tumefaciens.

Incuba las células en hielo durante 30 minutos. Luego, congele rápidamente las células en nitrógeno líquido durante un minuto. A continuación, caliente las células a 28 grados centígrados durante 15 minutos y luego agregue un mililitro de medio LB a la mezcla de células competente.

Después de agregar el medio LB, vuelva a colocar las celdas a 28 grados centígrados durante dos horas. A continuación, gire las celdas a 3.000 veces G durante un minuto. Vuelva a suspender el pellet celular en 0,2 mililitros de medio LB y colóquelo en placas de agar LB selectivo con antibióticos.

Haga crecer las células en las placas a 28 grados centígrados durante 48 horas hasta que las colonias individuales sean visibles. A continuación, recoja y coloque varias colonias individuales en placas de agar LB frescas y cultive las células a 28 grados centígrados durante 48 horas. A continuación, tome una pequeña cantidad de bacterias de cada placa para su análisis y utilice la PCR de colonias para confirmar la presencia de las construcciones binarias específicas de interés.

Añadir cada colonia de agrobacterium con el constructo de interés a cinco mililitros de medio LB suplementado con los antibióticos adecuados. Haga crecer las células durante la noche a 28 grados centígrados. A continuación, centrifugar las células a 3.000 veces G.Vuelva a suspender el pellet a un OD600 de 0,5 en tampón de agroinfiltración.

Incubar la suspensión durante dos horas a temperatura ambiente y luego cargar el inóculo en una jeringa de plástico de un mililitro. Sosteniendo una hoja de N. Benthamiana completamente madura con un dedo enguantado en la cara adaxial, presione la boquilla de la jeringa contra la epidermis inferior de la hoja. Luego, introduzca lentamente la agrobacteria en el medio de infiltración inyectando el medio.

Mantenga la planta infiltrada hasta que se pueda observar. Use una cuchilla para cortar cada hoja en fragmentos entre las venas de 24 a 48 horas después de la infiltración. Coloque las rodajas de hoja en el portaobjetos con la superficie abaxial de la hoja hacia arriba.

A continuación, coloca una gota de agua sobre la rodaja de hoja y cúbrela con el cubreobjetos. Inmovilice el cubreobjetos con pequeños trozos de cinta adhesiva a cada lado. Transfiera un portaobjetos a un microscopio confocal de barrido láser y utilice una lente subjetiva 10X para identificar las células con la mejor señal.

A continuación, utiliza un objetivo subjetivo de 63X para grabar imágenes y obtener observaciones más detalladas. Además, utilice los fluorescentes adecuados para excitar las proteínas fluorescentes expresadas. Conserve todos los valores que se utilizan para la adquisición de imágenes con el fin de mantener la coherencia entre los experimentos.

En promedio, examine de 100 a 120 células para cada condición experimental. Diagnostique la localización de las proteínas analizadas utilizando las imágenes del microscopio confocal. Estas imágenes ilustran los patrones característicos de localización de plasmodesmos periféricos punteados observados para la proteína de movimiento TMV de longitud completa fusionada con la molécula de carga CFP, y para la señal de localización de plasmodesmos identificada fusionada con CFP, así como para la proteína de localización de plasmodesmos coexpresada, PDCB1 fusionada con DsRed.

En condiciones de control, la focalización de los plasmodesmos de la proteína de movimiento TMV de longitud completa fusionada con CFP y la señal de localización en la proteína de movimiento TMV fusionada con CFP, aparece como se muestra aquí con localización subcelular de CFP y localización nucleocitoplasmática del marcador DsRed2. Cuando el cuarto aminoácido, la valina, muta a alanina, se pierden los plasmodesmos dirigidos tanto por la proteína de movimiento TMV de longitud completa como por la señal de localización identificada en la proteína de movimiento TMV. Esto indica que este residuo es importante para la localización, estructura o función de la señal de localización de los plasmodesmos.

Una vez dominada, esta técnica se puede terminar en 50 horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que las plantas deben estar en muy buenas condiciones y que las plantas estén en la etapa correcta de las hojas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión no solo de cómo identificar la señal de la proteína de localización de plasmodesmos, sino también saber cómo identificar otras señales ciertas en las proteínas de las plantas.