Name: Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-02-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Aprende a imaginar cambios de potencial de membrana con indicadores de voltaje genéticamente codificados. Este método permite visualizar la actividad neural en tiempo real usando sondas FRET y proteínas fluorescentes únicas.

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Este trabajo fue apoyado por el programa World Class Institute (WCI) de la Fundación Nacional de Investigación de Corea financiado por el Ministerio de Educación, Ciencia y Tecnología de Corea Subvención WCI 2009-003 y el Proyecto del Programa Institucional del Instituto de Ciencia y Tecnología de Corea 2E24210. Sungmoo Lee contó con el apoyo del programa Global Ph.D. Fellowship (NRF-2013H1A2A1033344) de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) del Ministerio de Educación (MOE, Corea).

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Los autores no tienen nada que revelar.

El sistema nervioso utiliza el voltaje de varias maneras diferentes, la inhibición provoca una ligera hiperpolarización, entrada sináptica provoca una ligera despolarización y una acción resultados potenciales en un cambio relativamente grande de tensión. La capacidad de medir los cambios en el potencial de membrana por GeViS ofrece el potencial prometedor de análisis de varios componentes de los circuitos neuronales simultáneamente. En este informe se demuestra un método fundamental para los cambios de imagen en el pot...

El principal objetivo de este trabajo es demostrar la formación de imágenes ópticas de los cambios en los potenciales de membrana in vitro utilizando proteínas fluorescentes genéticamente codificados. cambios de imagen en el potencial de membrana ofrece la excitante posibilidad de estudiar la actividad de los circuitos neuronales. Cuando los cambios en el potencial de membrana resultado en un cambio de intensidad de fluorescencia, cada píxel de la cámara se convierte en un electrodo de sustituto que permite mediciones no intrusivas de la actividad neuronal. Durante más de cuarenta años, los colorantes orgánicos sensibles al voltaje han sido útiles para la observación de los cambios en el potencial de membrana 1-4. Sin embargo, estos colorantes carecen de especificidad celular. Además, algunos tipos de células son difíciles de teñir. indicadores de tensión codificados genéticamente (GeViS) superar estas limitaciones por tener las células a ser estudiadas específicamente expresan la sonda fluorescente sensible al voltaje. Hay tres clases de GeViS. La primera clase de GEVI utiliza la voDominio de la fosfatasa de detección de voltaje ltage de detección, ya sea con una proteína única fluorescente (FP) 5-9 o una transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) 10-12. La segunda clase de sensores utiliza rodopsina microbiana como un indicador fluorescente directamente 13-15 o por medio de FRET electrocrómico 16,17. La tercera clase utiliza dos componentes, el componente genético de ser una membrana anclada FP y un segundo componente que es un colorante unido a la membrana de temple 18-20. Mientras que las clases segunda y tercera son útiles para los experimentos in vitro y rebanada 19,20, sólo la primera clase de sensores son actualmente útil para los análisis in vivo 6. En este informe vamos a demostrar la proyección de imagen del potencial de membrana utilizando la primera clase de GeViS (Figura 1) in vitro. Esta primera clase de sensores de voltaje es el más fácil hacer la transición a imágenes in vivo. Desde GeViS utilizing un dominio de detección de voltaje fusionado a un FP son aproximadamente 50 veces más brillante que la clase de sensores rodopsina, que se pueden visualizar utilizando la iluminación de la lámpara de arco en lugar de requerir un potente láser. Otra consecuencia de la disparidad en el brillo es que la primera clase de GeViS puede superar fácilmente la auto-fluorescencia del cerebro. Las sondas basadas en la rodopsina no puede. La tercera clase de sensor es tan brillante como la primera clase, sino que requiere la adición de un inhibidor químico que es difícil de administrar in vivo. Nosotros, por lo tanto, demostrar la adquisición de una sonda con una sola FP (Bongwoori) 8 y una sonda que consiste en un par de FRET (Nabi 2) 12. El FRET construye en este informe son versiones de mariposa VSFP-CR (proteínas fluorescentes sensibles al voltaje - Trébol-mRuby2) 11 que consta de un donante fluorescente verde, trébol, y un aceptor fluorescente de color rojo, mRuby2, llamado Nabi 2.242 y 2.244 Nabi <shasta&gt; 12. En la introducción de este tipo de grabaciones debe dar a los investigadores una mejor comprensión del tipo de información puede proporcionar GeViS. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/53566/53566fig1.jpg" /> Figura 1. Dos Tipos de indicadores codificados genéticamente Tensión (GeViS) con imágenes formadas en este informe (A) Un mono FP basado GEVI que tiene un dominio de detección de voltaje transmembrana y una proteína fluorescente. (B) Un GEVI basado FRET compuesto por un dominio de detección de voltaje transmembrana, un donante de FRET y aceptor. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53566/53566fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>60X lente objetivo (apertura numérica = 1.35)</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO 60XO</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Semrock</td><td>&nbsp; FF02-472/30</td><td>Para la obtención de imágenes de voltaje de pHluorin súper eclíptica en el</td></tr><tr><td>espejo dicroico</td> Bongwoori <td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Semrock</td><td>FF01-497/LP</td><td></td></tr><tr><td>75W Lámpara de arco de xenón</td><td>CAIRN</td><td>OptoSource Illuminator</td><td>Los LED y los láseres también son fuentes de luz efectivas</td></tr><tr><td>Cámara CCD de baja velocidad</td><td>Hitachi</td><td>KP-D20BU</td><td></td></tr><tr><td>Adaptador de cámara de doble puerto</td><td>Olympus</td><td>U-DPCAD</td><td></td></tr><tr><td>Cámara CCD de alta velocidad</td><td>RedShirtImaging, LLC</td><td>NeuroCCD-SM</td><td></td></tr><tr><td>Divisor de imagen</td><td>CAIRN</td><td>Optosplit 2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de excitación</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/23-25</td><td>Para imágenes de voltaje de GEVI basado en pares FRET que consta de Clover y mRuby2)</td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF495-Di03-25x36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma</td><td>ET520/40</td><td></td></tr><tr><td>Espejo dicroico</td><td>Semrock</td><td>FF560-FDi01-25X36</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de emisión</td><td>Chroma</td><td>ET645/75</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de aislamiento de vibraciones</td> Sistemas <td>cinéticos</td><td>250BM-IC, 5702E-3036-31</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de parcheo</td><td>Warner instruments</td><td>RC-26G, 64-0235</td><td></td></tr><tr><td>#0 Micro Cubreobjetos (22 x 40 mm)</td><td>Microscopía Electrónica Ciencias</td><td>72198-20</td><td></td></tr><tr><td>Controlador de temperatura</td><td>Warner instruments</td><td>TC-344B</td><td></td></tr><tr><td>#0 (0.08 ~ 0.13 mm) - 10 mm de diámetro cubreobjetos de vidrio</td><td>Ted Pella</td><td>260366</td><td></td></tr><tr><td>Agente de lipofección</td><td>Life Technologies</td><td>11668-027</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de fosfato de calcio</td><td>Clontech - Takara</td><td>631312</td><td></td></tr><tr><td>Amplificador de abrazadera de parche</td><td>HEKA</td><td>EPC 10 Amplificador</td><td></td>USB</tr><tr><td>Software de adquisición de datos multicanal</td><td>HEKA</td><td>Patchmaster</td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición y análisis de imágenes</td><td>RedShirtImaging</td><td>Neuroplex</td><td></td></tr><tr><td>Software de aplicación de hojas de cálculo</td><td>Microsoft</td><td>Microsoft Excel 2010</td><td></td></tr><tr><td>Software</td> <td>de análisis de datosOriginLab</td><td>Demagnificador OriginPro 8.6.0</td><td></td></tr><tr><td>Acoplador</td> de cámara estándar <td>Qioptiq LINOS</td><td>Optem 0.38x SC38 J</td> clamp <td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal</td><td></td><td>Nikon</td><td>Nikon A1R</td></tr><tr><td>Reactivo antidecoloración</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Imaging Membrane Potential with Two Types of Genetically Encoded Fluorescent Voltage Sensors

Los indicadores de voltaje codificados genéticamente (GEVIs) han mejorado hasta el punto en que están empezando a ser útiles para las grabaciones in vivo. Si bien el objetivo final es obtener imágenes de la actividad neuronal in vivo, uno debe ser capaz de obtener imágenes de la actividad de una sola célula para garantizar el éxito de las preparaciones in vivo. Este procedimiento describirá cómo obtener imágenes del potencial de membrana en una sola célula para proporcionar una base para obtener imágenes in vivo. Aquí describimos los métodos para obtener imágenes de GEVI que consisten en un dominio de detección de voltaje fusionado con una sola proteína fluorescente (FP) o dos proteínas fluorescentes capaces de transferir energía por resonancia de Förster (FRET) in vitro. El uso de un divisor de imágenes permite la proyección de imágenes creadas por dos longitudes de onda diferentes en la misma cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) simultáneamente. El divisor de imagen coloca un segundo cubo de filtro en la trayectoria de la luz. Este segundo cubo de filtro consta de un dicroico y dos filtros de emisión para separar las longitudes de onda fluorescentes del donante y del aceptor en función de los FP del GEVI. Esta configuración permite el registro simultáneo de los socios fluorescentes aceptor y donante, mientras que el potencial de membrana se manipula a través de la configuración de abrazadera de parche de célula completa. Cuando se utiliza un GEVI que consta de un solo FP, el segundo cubo de filtro se puede quitar, lo que permite que los espejos del divisor de imágenes proyecten una sola imagen en la cámara CCD.

Transitoriamente células transfectadas pueden exhibir una variación significativa en la intensidad de fluorescencia y el grado de expresión en la membrana de plasma. Incluso en el mismo cubreobjetos algunas células tendrán diferentes niveles de fluorescencia interna. Esto es más probable debido a la cantidad de agente de transfección absorbido por la célula. De vez en cuando, el exceso de expresión hace que la célula de experimentar la respuesta de la proteína desplegada que resulta en a...

Se describe un método para obtener imágenes de los cambios en el potencial de membrana utilizando indicadores de voltaje codificados genéticamente.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

Genetically encoded voltage indicators (GEVIs) have improved to the point where they are beginning to be useful for in vivo recordings. While the ultimate ...

El objetivo general de este procedimiento es informar ópticamente sobre los cambios en el potencial de membrana mediante un indicador genéticamente codificado de voltaje. Este método describirá las ventajas y desventajas de la obtención de imágenes con diferentes sondas fluorescentes genéticamente codificadas de voltaje. Por ejemplo, las sondas basadas en FRET ofrecerán la ventaja de la obtención de imágenes por razón de intensidad, pero proporcionarán una señal más baja.La principal ventaja de esta técnica es que podemos visualizar la actividad neuronal en tiempo real. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la relación señal-ruido no es muy alta y existen varias fuentes de ruido y múltiples pasos que pueden fallar. Con frecuencia, los nuevos usuarios se confunden y toman las interferencias como señales reales. La demostración visual de este método es fundamental para determinar la validez de las sondas utilizadas y lo que realmente indican. Para el montaje, se instala un divisor de imagen entre las cámaras CCD lenta y rápida para la adquisición de imágenes del indicador GEVI basado en FRET. Antes del experimento, inserte un cubo de filtro co

imaging-membrane-potential-with-two-types-genetically-encoded

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Investigación

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Neurociencia

Campo eléctrico externo provoca una tensión en la membrana de una célula, denominada tensión de la membrana inducida (ΔΦ). Mediante el uso de la tintura potenciométrica di-8-ANEPPS, es posible medir el ΔΦ no invasiva. Este video muestra el protocolo para la medición de ΔΦ con di-8-ANEPPS.

La medición de la tensión de la membrana inducida con Di-8-ANEPPS

Una técnica de imagen para el monitoreo de los cambios de potencial de membrana con una resolución temporal sub-micrométrico espacial y sub-milisegundos es descrito. La técnica, basado en una excitación láser de colorantes sensibles a voltaje, permite realizar mediciones de señales en los axones y colaterales axónicas, ramas terminales individuales dendríticas, y las espinas dendríticas.

Sensibles al voltaje Dye grabación de axones, dendritas y espinas dendríticas de las neuronas individuales en rodajas de cerebro

Los protocolos descritos aquí permiten el estudio de las propiedades eléctricas de las células excitables en las condiciones fisiológicas más no invasivas mediante el empleo de embriones de pez cebra en un sistema in vivo junto con un indicador de voltaje genéticamente codificado (GEVI) basado en la transferencia de energía por resonancia fluorescente (FRET) expresado selectivamente en el tipo de célula de interés.

Potencial de membrana de la neurona motora de Biosensing en los embriones vivos de pez cebra

Aquí presentamos un método de imagen ópticamente potenciales de la acción, específicamente en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas como ventricular. El método se basa en la expresión de una proteína fluorescente sensible al voltaje impulsado por el promotor.

Potencial de acción óptica específica de subtipo grabaciones en humanos inducida por cardiomiocitos ventriculares derivadas de células madre pluripotentes

Aquí presentamos un protocolo de calcio imagen señalización en poblaciones individuales de tipos de células en la Unión neuromuscular murino.

Ex Vivo Proyección de imagen del calcio celular específicos de señalización en la sinapsis tripartita del diafragma del ratón

Presentamos la metodología para el aislamiento de miocitos murinos y cómo obtener trazas de voltaje o calcio simultáneamente con rastros de acortamiento de sarcomere utilizando fotometría de fluorescencia con mediciones simultáneas de geometría celular digital.

Imágenes ópticas de miocitos ventriculares murinos aislados

Aquí describimos la adquisición óptica y la caracterización de potenciales de acción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas utilizando un sistema de fotometría modular de alta velocidad.

Medición del potencial de acción óptica unicelular en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas por humanos

Se describen dos métodos relacionados para visualizar los eventos subcelulares necesarios para la transmisión sináptica. Estos protocolos permiten el monitoreo en tiempo real de la dinámica de la afluencia de calcio presináptico y la fusión de la membrana de vesícula sináptica utilizando imágenes de células vivas de neuronas cultivadas in vitro .

Medición fluorescente en tiempo real de las funciones sinápticas en modelos de esclerosis lateral amiotrófica

Este protocolo describe un método para el estudio de proteínas de membrana electrogénicas midiendo los cambios en el potencial de membrana. Este ensayo proporciona una plataforma para la lectura funcional de múltiples canales iónicos expresados endógenamente en líneas celulares epiteliales.

Un ensayo basado en fluorescencia del potencial de membrana para el estudio funcional de alto rendimiento de dos canales iónicos endógenos en dos líneas celulares epiteliales

Para el estudio de las respuestas de las células excitables in vitro, el protocolo describe el seguimiento óptico de los cambios en la generación de potencial de acción debidos a la electroporación en un modelo simple de célula excitable simple de células HEK con spiging tet-on modificadas genéticamente, así como los cambios en el voltaje transmembrana con extracción automatizada de parámetros relevantes.

Monitoreo de cambios inducidos por electroporación en la generación de potencial de acción en celdas HEK de Tet-On Spiking diseñadas genéticamente

Aprende a imaginar cambios de potencial de membrana con indicadores de voltaje genéticamente codificados. Este método permite visualizar la actividad neural en tiempo real usando sondas FRET y proteínas fluorescentes únicas.

Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

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