Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

El objetivo general de este procedimiento es informar ópticamente los cambios de potencial de membrana con un indicador de voltaje codificado genéticamente. Este método describirá las fortalezas y debilidades de la obtención de imágenes con diferentes sondas fluorescentes de voltaje codificadas genéticamente. Por ejemplo, las sondas basadas en FRET ofrecerán la ventaja de la imagen radiométrica, pero darán una señal más baja.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos visualizar la actividad neuronal en tiempo real. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la relación señal-ruido no es muy grande y hay varias fuentes de ruido y múltiples pasos que pueden salir mal. Los nuevos usuarios a menudo se confunden y las interferencias se toman como señales reales.

La demostración visual de este método es fundamental para determinar la validez de las sondas que se utilizan y lo que realmente indica. Para la configuración, se instala un divisor de imágenes entre las cámaras CCD lentas y rápidas para la obtención de imágenes de GEVI basadas en FRET. Antes del experimento, inserte un cubo de filtro con un espejo dicroico y dos filtros de emisión en el divisor de imagen.

Retire este segundo cubo de filtro cuando obtenga imágenes de un GEVI con una sola proteína fluorescente. Para comenzar el experimento, localice una célula HEK293 sana que muestre una fluorescencia de membrana fuerte y localizada en comparación con la fluorescencia interna y evite parchear las células circulares mientras se dividen o mueren. A continuación, aplique un pulso de prueba para comprobar la respuesta actual.

A continuación, baje la pipeta de pinza de parche justo por encima de la superficie de la célula. A continuación, baje lentamente la pipeta hasta que toque suavemente la membrana celular. La resistencia de la membrana debe aumentar a uno o dos megaohmios.

Después de eso, establezca un sello de gigaohmios aplicando suavemente presión negativa a través de la pipeta. Una vez que se haya logrado un sellado de gigaohmios, ajuste el potencial de la pipeta a un potencial de retención deseado. A continuación, enfoque la cámara CCD de alta velocidad en el cuerpo de la célula.

Para la grabación GEVI basada en FRET, ajuste el tamaño de las imágenes divididas para dar como resultado una vista espaciada uniformemente para cada longitud de onda de emisión utilizando las perillas del divisor de imagen. A continuación, rompe la membrana celular aplicando presión negativa para formar la configuración celular completa. Ahora, abra el software de imágenes.

A continuación, haga clic en el menú de adquisición de la cámara SciMeasure para abrir la página de adquisición de CCD. A continuación, crea un nuevo archivo de datos para guardar la grabación. Haga clic en la salida analógica y, a continuación, lea un ASCII para abrir un archivo de protocolo de pulso con el fin de realizar las imágenes.

A continuación, haga clic en promediar las repeticiones internas para promediar el número de ensayos. A continuación, cierre la página de salida analógica. Establezca los parámetros de adquisición específicos en la página de adquisición de CCD.

Después de eso, ingrese los valores específicos para el número de tramas para la adquisición y el número de ensayos. A continuación, haz clic en el botón de toma de datos óptico más BNC para iniciar la grabación. Mientras se realizan las imágenes de voltaje, supervise el osciloscopio para garantizar una configuración estable de toda la celda durante todo el registro.

Para calcular el cambio de fluorescencia fraccional, haga clic en archivo y, a continuación, en leer archivo de datos para abrir un archivo de datos que se registró en el paso anterior. La imagen de la célula en su intensidad de luz en reposo debe verse en el lado derecho. A continuación, haga clic en mostrar BNC's para mostrar los valores de voltaje final actual.

Cambie el modo de página de fotograma RLI a sustracción de fotograma para utilizar la función de sustracción de fotogramas para identificar los píxeles con señales ópticas sensibles. A continuación, seleccione dos puntos de tiempo para la sustracción e identifique el área de la celda que muestra señales en respuesta al cambio de potencial de la membrana. A continuación, designe los píxeles que deben analizarse arrastrando o haciendo clic en cada píxel.

La representación gráfica de la intensidad media de fluorescencia de los píxeles seleccionados debe aparecer en el lado izquierdo de la ventana del software. Divida los píxeles sustraídos con intensidad de luz en reposo haciendo clic en el botón dividir por RLI para adquirir los valores de cambio de fluorescencia fraccional. Para exportar los datos, elimine los gráficos de voltaje final de corriente desmarcando el menú mostrar BNC.

Vaya a la salida, guarde las trazas como ASCII mostradas para exportar la traza de fluorescencia en un formato de archivo ASCII para el análisis de ajuste de curvas. En este procedimiento, dibuje el gráfico de cambio de fluorescencia frente a voltaje trazando los cambios de fluorescencia fraccionales en respuesta al voltaje en un programa de análisis de datos. Después de eso, ajuste la curva a una función de Boltzmann para determinar el rango de voltaje de la señal óptica haciendo clic en análisis, ajuste, ajuste sigmoidal y luego abra el cuadro de diálogo.

Vuelva a trazar los cambios de fluorescencia fraccional normalizados en respuesta al voltaje utilizando el programa de análisis de datos. Para calcular la velocidad de la respuesta óptica, abra el archivo ASCII y trace la traza de cambio de fluorescencia fraccional en función del tiempo. A continuación, haga clic en el selector de datos del software de análisis de datos y seleccione un punto de tiempo correspondiente al comienzo de un pulso de tensión escalonado y un segundo punto de tiempo en el que la señal óptica haya alcanzado el estado estacionario.

Ajuste este rango a una función de decaimiento exponencial simple y doble haciendo clic en análisis, ajuste, ajuste exponencial, luego abra el cuadro de diálogo e informe el mejor ajuste. Esta figura muestra el cambio de fluorescencia de una célula HEK que expresa un único GEVI Bongwoori basado en FP. Este es un cambio de fluorescencia típico en respuesta a los pulsos de voltaje escalonados.

Aquí se fotografió una célula HEK293 con una cámara CCD de alta velocidad. Esta imagen muestra la intensidad de la luz en reposo de una célula que expresa Bongwoori. Y esta es una imagen de sustracción de fotogramas que indica los píxeles donde se observó el cambio de fluorescencia.

Aquí se muestra el registro óptico de los potenciales de acción inducidos de las neuronas primarias del hipocampo del ratón que expresan Bongwoori. Los potenciales de acción se evocaron bajo el modo de pinza de corrientes de celda completa. La traza de cambio de fluorescencia fraccional se seleccionó de los píxeles correlacionados con el soma.

En esta figura, el cambio de fluorescencia de una célula HEK que expresa GEVI basado en FRET muestra las respuestas a los pulsos de voltaje escalonados en dos longitudes de onda. Grabado a un kilohercio con una cámara CCD de alta velocidad. Al intentar este procedimiento, es importante recordar probar los niveles de fluorescencia variables, ya que la sobreexpresión de fluorescencia puede afectar la salud de la célula.

Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como las codificaciones de corte, para responder preguntas adicionales relacionadas con la actividad neuronal de varios circuitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes del potencial de membrana utilizando diferentes tipos de sondas.