Membrana de imagen potencial con dos tipos de sensores de tensión fluorescentes genéticamente codificados

El objetivo general de este procedimiento es informar ópticamente sobre los cambios en el potencial de membrana mediante un indicador genéticamente codificado de voltaje. Este método describirá las ventajas y desventajas de la obtención de imágenes con diferentes sondas fluorescentes genéticamente codificadas de voltaje. Por ejemplo, las sondas basadas en FRET ofrecerán la ventaja de la obtención de imágenes por razón de intensidad, pero proporcionarán una señal más baja.

La principal ventaja de esta técnica es que podemos visualizar la actividad neuronal en tiempo real. Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la relación señal-ruido no es muy alta y existen varias fuentes de ruido y múltiples pasos que pueden fallar. Con frecuencia, los nuevos usuarios se confunden y toman las interferencias como señales reales.

La demostración visual de este método es fundamental para determinar la validez de las sondas utilizadas y lo que realmente indican. Para el montaje, se instala un divisor de imagen entre las cámaras CCD lenta y rápida para la adquisición de imágenes del indicador GEVI basado en FRET. Antes del experimento, inserte un cubo de filtro con un espejo dicróico y dos filtros de emisión en el divisor de imagen.

Retire este segundo cubo de filtro al obtener imágenes de un GEVI con una única proteína fluorescente. Para comenzar el experimento, localice una célula HEK293 saludable que muestre una fluorescencia fuerte y localizada en la membrana en comparación con la fluorescencia interna y evite realizar el parche en células circulares, ya que estas se encuentran en división o están muriendo. Luego, aplique un pulso de prueba para verificar la respuesta de corriente.

Posteriormente, baje la pipeta del parche a una posición justo por encima de la superficie de la célula. Luego, baje lentamente la pipeta hasta que toque suavemente la membrana celular. La resistencia de la membrana debe aumentar a uno o dos megaohmios.

A continuación, establezca un sello de gigaohmios aplicando suavemente presión negativa a través de la pipeta. Una vez logrado un sello de gigaohmios, ajuste el potencial de la pipeta a un potencial de retención deseado. A continuación, enfoque la cámara CCD de alta velocidad sobre el cuerpo celular.

Para la grabación de GEVI basada en FRET, ajuste el tamaño de las imágenes divididas para obtener una vista uniformemente espaciada para cada longitud de onda de emisión utilizando los controles del divisor de imagen. Luego, rompa la membrana celular aplicando presión negativa con el fin de formar la configuración de célula íntegra. Ahora, abra el software de imagen.

Luego, haga clic en adquirir menú de la cámara SciMeasure para abrir la página de adquisición CCD. A continuación, cree un archivo de datos nuevo para guardar la grabación. Haga clic en salida analógica y luego lea un ASCII para abrir un archivo de protocolo de pulso con el fin de realizar la adquisición de imágenes.

A continuación, haga clic en promediar las repeticiones internas para promediar el número de ensayos. Luego cierre la página de salida analógica. Establezca los parámetros específicos de adquisición en la página de adquisición de CCD.

Después, ingrese los valores específicos para el número de cuadros para la adquisición y el número de ensayos. Luego, haga clic en el botón tomar datos ópticos más BNC para comenzar la grabación. Mientras se realiza la imagen de voltaje, supervise el osciloscopio para asegurar una configuración estable de célula completa durante toda la grabación.

Para calcular el cambio fraccional de fluorescencia, haga clic en archivo y luego en leer archivo de datos para abrir un archivo de datos registrado en el paso anterior. La imagen de la célula en su intensidad luminosa de reposo debe aparecer en el lado derecho. A continuación, haga clic en mostrar BNC para mostrar los valores actuales de voltaje final.

Cambie el modo de página del marco RLI al restado de marcos para utilizar la función de sustracción de marcos y así identificar los píxeles con señales ópticas responsivas. A continuación, seleccione dos puntos de tiempo para la sustracción e identifique el área celular que muestra señales en respuesta al cambio del potencial de membrana. A continuación, designe los píxeles que deben analizarse arrastrando o haciendo clic en cada píxel.

La representación gráfica de la intensidad media de fluorescencia de los píxeles seleccionados debe aparecer en el lado izquierdo de la ventana del software. Divida los píxeles restados por la intensidad luminosa en reposo haciendo clic en el botón dividir por RLI para obtener los valores fraccionales de cambio de fluorescencia. Para exportar los datos, elimine las gráficas de voltaje finales actuales desactivando el menú mostrar BNC.

Vaya a salida, guarde las trazas como ASCII mostradas para exportar la traza de fluorescencia en un formato de archivo ASCII para el análisis de ajuste de curva. En este procedimiento, dibuje la gráfica de cambio de fluorescencia versus voltaje trazando los cambios fraccionales de fluorescencia en respuesta al voltaje en un programa de análisis de datos. Luego, ajuste la curva a una función de Boltzmann para determinar el rango de voltaje de la señal óptica haciendo clic en análisis, ajuste, ajuste sigmoideo y luego abra el cuadro de diálogo.

Vuelva a trazar los cambios fraccionales normalizados de fluorescencia en respuesta al voltaje utilizando el programa de análisis de datos. Para calcular la velocidad de la respuesta óptica, abra el archivo ASCII y represente gráficamente el trazado del cambio fraccional de fluorescencia frente al tiempo. A continuación, haga clic en el selector de datos del software de análisis de datos y seleccione un punto temporal que corresponda al inicio de un pulso de voltaje escalonado y un segundo punto temporal donde la señal óptica haya alcanzado el estado estacionario.

Ajuste este rango a una función de decaimiento exponencial simple y doble haciendo clic en análisis, ajuste, ajuste exponencial, luego abra el cuadro de diálogo e informe el mejor ajuste. Esta figura muestra el cambio de fluorescencia de una célula HEK que expresa un GEVI basado en una única proteína fluorescente, Bongwoori. Este es un cambio típico de fluorescencia en respuesta a pulsos de voltaje escalonados.

Aquí, una célula HEK293 fue imagenada con una cámara CCD de alta velocidad. Esta imagen muestra la intensidad luminosa en reposo de una célula que expresa Bongwoori. Y esta es una imagen de sustracción de cuadros que indica los píxeles donde se observó un cambio en la fluorescencia.

Se muestra aquí la grabación óptica de los potenciales de acción inducidos en neuronas primarias del hipocampo de ratón que expresan Bongwoori. Los potenciales de acción fueron evocados en el modo de fijación de corriente en célula íntegra. La traza del cambio fraccional de fluorescencia se seleccionó a partir de los píxeles correlacionados con el soma.

En esta figura, el cambio de fluorescencia de una célula HEK que expresa un GEVI basado en FRET muestra las respuestas a pulsos de voltaje escalonados en dos longitudes de onda. Registrado a un kilohercio con una cámara CCD de alta velocidad. Al realizar este procedimiento, es importante recordar probar los niveles variables de fluorescencia, ya que la sobreexpresión de fluorescencia puede afectar la salud de la célula.

Después de seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como los códigos de corte para responder preguntas adicionales que involucren la actividad neuronal de diversos circuitos. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener imágenes del potencial de membrana utilizando diferentes tipos de sondas.