La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

El objetivo general de este procedimiento experimental es acceder a la disposición de los electrodos en la cámara de registro para la estimulación con corriente continua de una sección de cerebro y evaluar su efecto sobre la actividad similar a convulsiones registrada mediante una matriz de múltiples electrodos. Esto puede ayudar mejor a responder preguntas clave sobre la estimulación con corriente continua y la actividad similar a convulsiones registrada con una matriz de múltiples electrodos en secciones cerebrales de ratón. Una ventaja de esta técnica es que los efectos de la estimulación con corriente continua pueden evaluarse en una vía específica de la sección cerebral de ratón.

La procedura será demostrada por Hsiang Chin y Wei-Jen Chang, técnicos de mi laboratorio. En este procedimiento, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75 % antes del experimento. Luego, exponga el cráneo del animal y retire el músculo restante.

A continuación, retire la superficie dorsal del cráneo utilizando rongeurs y corte los lados. Posteriormente, con una espátula, corte los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro antes de extraerlo. Transfiera rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno con ACSF frío con hielo y oxigenado.

Para preparar cortes que contengan la vía MT-ACC, realice un corte sagital a 2 mm lateral a la línea media en cada hemisferio, para exponer la anatomía subcortical. Luego, haga un corte transversal angular paralelo al tracto de fibras visible en el estriado. Realice el segundo corte transversal angular desde la conexión entre el cerebelo y la corteza visual hasta el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico, ubicado ventralmente y paralelo a la vía tálamo-cingulada.

Después de eso, fije el bloque cerebral a una placa angular con un adhesivo de cianoacrilato. Realice un corte justo por encima del punto de giro de la trayectoria. A continuación, desdoble la placa, aplanele y pegue sobre la plataforma de la cámara de un vibrátomo.

Posteriormente, seccionar las muestras de cerebro con un grosor de 500 micrómetros y mantenerlas en ACSF oxigenado y frío con hielo. Transferir una muestra a la cámara de registro a 32 grados Celsius con perfusión continua de ACSF oxigenado durante una hora. Confirmar la colocación de una sonda MEA en el sistema multicanal.

Utilice un tubo para guiar el ACSF hacia la cámara del MEA y el otro tubo para guiar el ACSF fuera de la cámara. Perfunda continuamente la preparación con ACSF calentado y oxigenado a 30 grados Celsius. Con un hisopo de algodón humedecido, transfiera una sección del cerebro al MEA.

Mueva cuidadosamente la sección del cerebro para orientar la CAC sobre los electrodos y luego estabilice la sección con un anclaje para secciones, asegurando así una buena conexión eléctrica entre la sección y los electrodos. Posteriormente, coloque el electrodo anódico próximo a la CAC y el electrodo catódico distal a la CAC. Registre la intensidad del campo mediante las dos orientaciones del campo de la EMA.

Luego, aplique las corrientes eléctricas utilizando un estimulador. Ajuste la distancia entre los dos electrodos de cloruro de plata a aproximadamente 1,5 a 2 cm y regule la intensidad de la corriente del estimulador para que la DCS esté entre 0,5 y 2 miliamperios. En este procedimiento, coloque un electrodo de tungsteno en MT y aplique pulsos desde el estimulador a la región tálamica del corte.

A continuación, utilice diversas intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta en la CAC. Desplace el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía tálamo-cingular para obtener el perfil de respuesta óptimo. Registre de 1 a 20 respuestas de la CAC y utilice el software para promediar automáticamente todas las respuestas de la CAC evocadas por la estimulación del MT.

Para inducir actividad similar a una convulsión, agregue 250 micromolar de 48P y 5 micromolar de bicuculina a la solución de perfusión, y continúe perfundiendo la sección durante dos o tres horas. Mantenga la bomba a una velocidad de perfusión relativamente rápida, lo que puede ayudar a prevenir la formación de un gradiente de pH. A continuación, coloque el electrodo de tungsteno en MT y aplique estimulación eléctrica para obtener un perfil de respuesta de la CAC.

Registre 10-20 barridos y promedie las respuestas. Posteriormente, sustituya la solución prefusión con ACSF fresco para lavar los fármacos. En este procedimiento, asegúrese de generar campos eléctricos uniformes, haciendo pasar corrientes entre dos alambres de plata recubiertos de cloruro de plata colocados dentro de la cámara del MEA.

Si no hay problemas, el DCS debe mantenerse entre 0,5 y 2 miliamperios. A continuación, apague el DCS y estimule el tálamo con un electrodo de tungsteno. Para obtener respuestas sinápticas máximas en la CAC, registre 10-20 respuestas y luego promédialas.

Luego, encienda el DCS y estimule simultáneamente el tálamo. Evalúe los cambios en la amplitud de la respuesta del cíngulo anterior evocada por la estimulación talámica durante el DCS. Ahora, apague el DCS, agregue 250 micromolar de 48P y 5 micromolar de bicuculina a la solución de perfusión, y espere de 2 a 3 horas.

Si los fármacos afectan la sección cerebral, la sección debe producir respuestas epilépticas corticales. Posteriormente, recolecte 10-20 respuestas corticales del cíngulo anterior y mida la amplitud y duración de las respuestas epilépticas corticales evocadas eléctricamente. A continuación, encienda el DCS y estimule simultáneamente el tálamo.

Evalúe los cambios en la amplitud y duración de las respuestas corticales epilépticas evocadas durante la aplicación de DCS. Después, reemplace la solución de perfusión con ACSF fresca para eliminar los fármacos. Esta figura muestra diferentes respuestas evocadas, que incluyen las respuestas evocadas por estimulación talámica en la ACC, la actividad semejante a convulsiones inducida por fármacos y la actividad semejante a convulsiones inducida tanto por estimulación talámica como por fármacos.

Esta figura muestra el efecto de diferentes orientaciones en la DCS, como distintas orientaciones en el campo eléctrico, respuestas evocadas por estimulación talámica con DCS y el efecto de la DCS catódica sobre la actividad tipo convulsión. En esta figura, se muestra que 15 minutos de DCS catódica indujeron efectivamente una depresión a largo plazo y disminuyeron las respuestas evocadas. La duración de las convulsiones disminuyó significativamente tras 15 minutos de DCS catódica en comparación con la ausencia de aplicación de DCS.

más rápido, esto técnicamente puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otras intervenciones como la estimulación magnética transcraneal, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como ofrecer enfoques no invasivos para controlar las convulsiones resistentes. Tras este avance, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia no invasiva exploraran tratamientos contra las convulsiones en modelos animales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la estimulación eléctrica para evaluar la actividad similar a convulsiones en cortes cerebrales.