Name: La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-06-07T14:15:00.000+00:00
Duration: 9 min 39 s
Description: Aprende a evaluar la estimulación de corriente directa en rebanadas de cerebro de ratón mediante matrices multi-electrodo para registrar actividad convulsiva. Este método permite analizar vías neuronales específicas y su respuesta a la estimulación catódica en modelos in vitro.

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Estamos agradecidos por el apoyo técnico del Núcleo de Electrofisiología de Circuitos Neuronales de Academia Sinica. Este trabajo contó con el apoyo del Consejo Nacional de Ciencias (102-2320-B-001-026-MY3 y 100-2311-B-001-003-MY3) y del Programa de Neurociencias de la Academia Sinica.

Procedimientos que involucran sujetos animales fueron aprobados por el Cuidado de Animales y el Institucional utilización, Academia Sinica, Taipei, Taiwán. 1. Preparación de la solución experimental y Equipo para multielectrode grabación de matriz <ol><li> Preparar artificial líquido cefalorraquídeo (ACSF; NaCl 124 mM, KCl 4,4 mM, 1 mM NaH 2 PO 3, 2 mM de MgSO4, CaCl2 2 mM, NaHCO3 25 mM y glucosa 10 mM, burbujeado con 95% de O2 y 5% de CO 2). </li><li> Utilizar dos tipos de sondas MEA: 6 x 10 MEA plana y 8 x 8 MEA. La primera sonda abarca la región que comprende la corteza, el cuerpo estriado y el tálamo. Esta última sonda cubre sólo la región cortical. </li><li> Utilice un amplificador de 60 canales con un filtro de paso de banda establecido entre 0,1 Hz y 3 kHz a 1200 de amplificación. Adquirir datos a una velocidad de muestreo de 10 kHz. </li><li> Coloque dos cables de plata recubiertos con AgCl dentro de la cámara de MEA para DCS. Utilice el AgClcables de plata recubiertas para producir campos eléctricos que son generados por un estimulador aislado. </li><li> Colocar un electrodo de tungsteno (diámetro, 127 m; longitud, 7,62 cm; 8 ° CA punta cónica, resistencia, 5 mO) para la estimulación del tálamo, y colocar el electrodo de referencia en la cámara de MEA. Entregar las corrientes del electrodo de tungsteno utilizando un estimulador aislado que es controlado por un generador de impulsos. </li></ol> 2. Preparación de la rebanada del cerebro <ol><li> Utilice macho C57BL / 6J, de 4-8 semanas de edad. La casa de los animales en una habitación con aire acondicionado (21-23 ° C; humedad relativa del 50%; 12 h luz / 12 h / ciclo de oscuridad, luces encendidas a las 8:00 AM) con acceso libre a comida y agua. </li><li> Tomar una alícuota de 250 ml de la ACSF que se preparó en el paso 1.1, y colocarlo en un vaso de precipitados que contiene hielo. Al mismo tiempo, el suministro de gas continuo que se compone de 95% de O 2 y 5% de CO 2. </li><li> Cirugía <ol><li> Anestesiar al animal con 4% de isoflurano en un vasocaja durante aproximadamente 3 min. Una vez que el animal alcanza una profundidad de la anestesia quirúrgica (indicado por la falta de una respuesta a la pizca dedo del pie), colocarlo en una bandeja poco profunda que está lleno de hielo picado, y quitar la cabeza con unas tijeras. </li><li> Exponer el cráneo, y recorte el músculo restante. A continuación, utilizando unas pinzas, retire la superficie dorsal del cráneo del cerebro. Recorte los lados del cráneo usando unas pinzas. Esterilizar todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75%. </li><li> Usando una espátula, cortar los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro, y quitar el cerebro. Después de la decapitación, transferir rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de ACSF oxigenada enfriada con hielo. </li></ol></li><li> Preparación de Medial Tálamo (MT) -ACC cerebro rebanada Nota: Preparar las rebanadas que contienen la vía de la MT en ACC 13. <ol><li> Mano-cortar el bloque cerebro con dos cortes sagitales 2,0 mm lateral a la línea media en cada hemisferiopara visualizar la anatomía subcortical. A continuación, hacer dos cortes en ángulo. Hacer que el primero de corte transversal paralelo al tracto de fibra visible en el cuerpo estriado. </li><li> Hacer que el segundo de corte transversal de la conexión entre el cerebelo y la corteza visual en el punto medio entre la comisura anterior y tracto óptico que son ventral y en paralelo a la vía thalamocingulate. </li><li> Coloque el bloque del cerebro a una placa angular (~ 120 °) con adhesivo de cianoacrilato, y haga un corte justo por encima del punto de inflexión de la vía. Despliegue la placa, aplanarlo, y la cola en el escenario de una cámara de vibratome. </li><li> Mediales hacen cortes de cerebro tálamo-ACC (500 m de espesor) y luego les sumergen en helado oxigenados rebanadas aCSF.Transfer a la cámara de grabación, y mantienen a 32 ° C bajo perfusión continua (12 ml / min) con ACSF oxigenada durante 1 hora </li></ol></li></ol> 3. Preparación de la cámara de perfusión para la grabación de matriz multielectrode <ol><li> Preparaciónde cámara de perfusión <ol><li> Colocar una sonda de MEA en un sistema multi-canal, y el uso de dos tubos de polietileno separadas para conectar la sonda a una bomba peristáltica. Use un tubo para guiar el LCRa en la cámara de MEA y el otro tubo para guiar el LCRa fuera de la cámara. Finalmente, perfundir continuamente la preparación con cálido LCRa (29-30 ° C) oxigenado (8 ml / min). </li></ol></li><li> Transferencia de cortes de cerebro de MEA. Mantenga pulsado el corte de cerebro en la MEA con un bastoncillo de algodón húmedo. mover con cuidado el corte de cerebro para asegurar la ACC se orienta por encima de los electrodos. </li><li> Utilice las unidades de anclaje rebanada y pisadores para presionar el corte de cerebro. Este paso asegura una buena conexión eléctrica entre la división y electrodos. </li></ol> 4. Generación de campos eléctricos por DCS Nota: La definición de la orientación del campo eléctrico se basa en la dirección del eje axodendritic en el ACC. Las orientaciones de los compartimentos de las dendritas y soma eranconfirmada mediante tinción de Golgi 12. <ol><li> Coloque el electrodo AgCl (definido como el ánodo) proximal a la ACC, y coloque el otro electrodo (definido como el cátodo) distal a la ACC. Registrar la intensidad de campo que se genera por las dos orientaciones de campo (paralelas y perpendiculares a las fibras axodendritic ACC) por parte de la MEA, y entregar las corrientes de los campos eléctricos a través del estimulador. </li><li> Fijar la distancia de los electrodos AgCl (alrededor de 1,5 a 2 cm), y ajustar la fuerza actual del estimulador para hacer que el DCS entre 0,5 y 2 mA. </li></ol> 5. eléctricamente inducida respuestas corticales sinápticas Nota: inducir respuestas sinápticas en el CAC por la estimulación eléctrica en el MT, en la que un generador de estímulo eléctrico programable produce pulsos de corriente bifásica rectangular. <ol><li> Repetir el apartado 3 anterior. </li><li> Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar impulsos del estimulador a la Thalregión amic de las rodajas a través de electrodos de tungsteno bipolar. </li><li> El uso de diversas intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta ACC. Aquí, utilizar una intensidad de ± 150 mu y la duración de 200 microsegundos, lo que provocó una respuesta máxima del 80% en la ACC en la mayoría de las rebanadas. </li><li> Mover el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía thalamocingulate (de MT al cuerpo calloso) en el segmento de MT-ACC para obtener los perfiles de respuesta óptimos. </li><li> Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y utilizar el software de forma automática a un promedio de la totalidad de la ACC evocado por la estimulación MT. El resultado ISS las respuestas sinápticas en el CAC inducidas por la estimulación por vía MT MT-ACC. </li></ol> 6. inducida eléctricamente episodios de tipo convulsivo Nota: La actividad convulsiva-como se indujo por la aplicación de 4-aminopiridina (4-AP; 250 mM) y bicuculina (5 M). Anteriores estudios de control de tiempo mostraron que las respuestas máximas y estables aparecieron2-3 horas después de la aplicación del fármaco 14. <ol><li> Repita el apartado 5 anterior. </li><li> Añadir fármacos para la solución de perfusión. Utilice 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M). Mezclar los medicamentos de manera uniforme, y continuar la perfusión durante 2-3 horas. </li><li> Para facilitar la actividad convulsiva, mantener la bomba de perfusión a un ritmo relativamente rápido de perfusión (8 ml / min), que también puede ayudar a prevenir la acumulación de un gradiente de pH. </li><li> Colocar un electrodo de tungsteno en el MT, y entregar la estimulación eléctrica (150 mu, 200 microsegundos de duración) para obtener perfiles de respuesta del CAC. </li><li> Hacer barridos 10-20 y un promedio de las respuestas. </li><li> Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas. Repita el paso 6.5. </li></ol> 7. Efecto Ensayos de DCS sobre las respuestas corticales evocados <ol><li> Repita las secciones 3 y 4. Asegurar que los campos eléctricos uniformes se generan haciendo pasar corrientes entre dos alambres de plata recubiertos con AgCl paralelas que se colocan dentro de la Mcámara de EA. Si no hay problemas, la DCS se mantiene entre 0,5 y 2 mA. </li><li> Apagar el DCS, y colocar un electrodo de tungsteno para estimular el tálamo (± 150 mu, 200 microsegundos de duración). Para obtener las respuestas sinápticas máximas en el CAC, hacer barridos de 10-20 y un promedio de las respuestas. </li><li> Al mismo tiempo activar la DCS (2 mV / mm Resistencia a la DCS) y la estimulación del tálamo (350 mu, 200 microsegundos de duración). Evaluar los cambios de amplitud de la respuesta evocada por estimulación ACC talámica durante DCS. </li><li> Apagar el DCS, y añadir 4-AP (250 mM) y bicuculina (5 M) a la solución de perfusión. Luego, esperar 2-3 horas. Cuando los medicamentos afectan el corte de cerebro, el corte produce respuestas convulsivos corticales. </li><li> Hacer 10-20 barridos de las respuestas del CAC, y luego medir la amplitud y la duración de las respuestas evocadas corticales convulsiones eléctricas. </li><li> Después del paso 7.5, gire simultáneamente en el DCS (2 mV / mm DCS fuerza) y la estimulación del tálamo (150 mu, 200 duratien microsegundos). Evaluar los cambios en la amplitud y la duración de las respuestas convulsivos corticales evocados durante la aplicación DCS. </li><li> Vuelva a colocar la solución de perfusión con ACSF fresca para lavar las drogas, y repita los pasos 7.2 y 7.3. </li><li> Recoger todos los datos de la grabación, y el grupo de los datos en las diferentes condiciones experimentales. Evaluar la amplitud y la duración de las respuestas de convulsiones corticales bajo diferentes condiciones experimentales. </li></ol> Análisis de datos 8. <ol><li> Utilizar el software (por ejemplo, el software del estante MC) a medio automáticamente las respuestas registradas, y exportar los datos en bruto a una hoja de cálculo. Analizar la amplitud y la duración de los datos en bruto y generar figuras en color. </li><li> Para detectar eventos convulsivos oscilatorios, utilizar software para medir el valor de referencia y las desviaciones estándar (DE). Set 3 SD del nivel de ruido como el umbral. Amplitudes de los picos durante un evento de oscilación que superan este umbral se detectan de manera automáticaed. </li><li> Realizar el análisis estadístico utilizando la prueba t de Student. </li><li> Mediciones rápidas y análisis unidireccional de la varianza (ANOVA) resultados en el texto como media ± SE, con n que indica el número de cortes estudiaron 12. </li></ol>

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<li>Lee, C. M., Chang, W. C., Chang, K. B., Shyu, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+organization+and+input-specific+short-term+plasticity+in+anterior+cingulate+cortical+neurons+with+intact+thalamic+inputs%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic organization and input-specific short-term plasticity in anterior cingulate cortical neurons with intact thalamic inputs.</a> Eur. J. Neurosci. 25 (9), 2847-2861 (2007).</li>
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<li>Fritsch, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+current+stimulation+promotes+BDNF-dependent+synaptic+plasticity%3A+potential+implications+for+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Direct current stimulation promotes BDNF-dependent synaptic plasticity: potential implications for motor learning.</a> Neuron. 66 (2), 198-204 (2010).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

En el presente estudio, se evaluaron los efectos de la duración y la orientación de DCS en la actividad convulsiva ACC. Para obtener datos estables en cortes de cerebro de ratón, cómo mantener la integridad de la vía MT-ACC y para evitar daños es fundamental, sobre todo los pasos en los que se realizan dos cortes en ángulo ventral y dorsal de un corte de la corteza. Por otra parte, el tiempo para preparar el corte de cerebro también puede afectar a la actividad de la sección de cerebro, que debe ser el menor tiempo posi...

La epilepsia es un trastorno neurológico común. El treinta por ciento de los pacientes con epilepsia sufren de convulsiones resistentes a los medicamentos. La estimulación transcraneal de corriente directa (tDCS) proporciona un enfoque no invasivo para controlar o alterar las actividades de la red en grandes áreas del cerebro, como las convulsiones. Los estudios clínicos han demostrado que la tDCS trata eficazmente las convulsiones intratables2 y puede producir efectos supresores a corto y largo plazo sobre las convulsiones3-5. Sin embargo, el mecanismo terapéutico de las acciones de la tDCS aún no está claro. El modelo de corte de cerebro presentado es un método in vitro para investigar cómo el mecanismo terapéutico de las acciones de la tDCS altera los síntomas de las actividades cerebrales similares a las convulsiones. En consecuencia, para lograr sus efectos óptimos, los parámetros de estimulación específicos, incluida la orientación, la intensidad del campo y la duración de la estimulación, deben probarse en un modelo experimental. Estudios previos han demostrado que la orientación del campo eléctrico es importante para obtener efectos terapéuticos6. Por lo tanto, es factible probar y organizar la orientación de los electrodos en relación con la posición del corte de cerebro probado.
Las convulsiones de epilepsia del lóbulo frontal y de la corteza cingulada anterior (ACC) suelen ser resistentes a los fármacos7,8. Algunos estudios han reportado la aplicación de tDCS en la corteza cingulada9-11. Se ha demostrado que la tDCS afecta la vigilancia, la toma de decisiones y las emociones a través de la alteración de las actividades del ACC, y puede modular la excitabilidad neuronal y la actividad convulsiva en esta región del cerebro12. Por lo tanto, los efectos supresores de la tDCS en las convulsiones de ACC podrían ser útiles para el tratamiento clínico y la evaluación de tratamientos alternativos.
El presente protocolo describe la preparación de un electrodo en la cámara de registro para la EDC de un corte de cerebro y su efecto en el registro de la actividad similar a las convulsiones con una matriz de electrodos múltiples (MEA).

<table><tbody><tr><td><fuerte>anestésico: </fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Halocarbon Products Corporation&nbsp;</td><td>NDC 12164-002-25</td><td>4%</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>aCSF (total:1 L):</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>MERCK</td><td>1.08337.1000</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>Carbonato de hidrógeno sódico</td><td>MERCK</td><td>1.06329.0500</td><td>25 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>MERCK</td><td>1.06404.1000</td><td>124 mM</td></tr><tr><td>(+)-L-ascorbato de sodio, >=98%</td><td>SIGMA</td><td>A4034-100G</td><td>0.15 g/2 c.c</td></tr><tr><td>Sulfato de magnesio, anhidro, ReagentPlus</td><td>SIGMA</td><td>M7506-500G</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de calcio dihidratado</td><td>MERCK</td><td>1.02382.1000</td><td>2 mM</td></tr><tr><td>Dihidrógeno fosfato de sodio monohidrato</td><td>MERCK</td><td>1.06346.1000</td><td>1 mM</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio</td><td>May & Baker LTD Dagenham Inglaterra</td><td>MS 7616</td><td>4.4 mM</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Medicamentos:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-Bicuculline</td><td>TOCRIS</td><td>0130</td><td>5 &micro; M en aCSF</td></tr><tr><td>4-Aminopiridina</td><td>TOCRIS</td><td>0940</td><td>250 &micro; M en aCSF</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte</td></tr><tr><td>><fuerte>Rebanada de cerebro Preparación:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Serie</td><td>1000</td><td>Bloque cortado en 500 &micro; m rodajas gruesas</td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td><fuerte>Sistema MEA:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sondas de matriz multielectrodo (MEA): 6 x 10 sistemas multicanal MEA planos</td><td></td><td>planos 60MEA500/30iR-Ti-pr MEAS 6x10</td><td>diámetro del electrodo, 30 y micro; m; espaciado de electrodos, 500 y micro; m; impedancia, 50 k&Omega; a 200 Hz</td></tr><tr><td>Sondas de matriz de electrodos múltiples (MEA): 8 x 8 MEA&nbsp;</td><td>Ayanda Biosystems</td><td>60MEA200/10iR-Ti-pr MEAS 8x8</td><td>electrodo de forma piramidal; diámetro, 40 y micro; m; altura de la punta, 50 y micro; m; espaciado de electrodos, 200 y micro; m; impedancia, 1.000 k&Omega; a 200 Hz</td></tr><tr><td>Se utilizó un amplificador de 60 canales con un filtro de paso de banda ajustado entre 0,1 Hz y 3 KHz con una amplificación de 1.200X</td><td>Sistemas multicanal</td><td>MEA-1060-BC</td><td></td></tr><tr><td>MC Software Rack a una frecuencia de muestreo de 10 KHz</td><td>Sistemas</td><td></td> multicanal <td>Software para la recogida de datos y registros</td></tr><tr><td>Control de un generador de impulsos</td><td>Sistemas multicanal</td><td>STG 1002</td><td></td></tr><tr><td>Kits de anclaje y sujeciones de corte</td><td>Warner Instruments</td><td>SHD-26H/10; WI64-0250</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica-minipuls3</td><td>Gilsom</td><td>MINIPULS3</td><td>tasa de perfusión: 8 ml/min</td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comentarios</td></tr><tr><td>Sistema de estimulación:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Estimulador aislado</td><td>Sistemas A-M Modelo</td><td>2100</td><td>intensidad de &plusmn; 350 &mu; A , duración de 200 &mu; sec</td></tr><tr><td>Electrodo de tungsteno</td><td>A-M Systems</td><td>575300</td><td>colocado en el tálamo</td></tr></tbody></table>

la estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Direct-current Stimulation and Multi-electrode Array Recording of Seizure-like Activity in Mice Brain Slice Preparation

Catódica transcraneal estimulación de corriente directa (tDCS) induce efectos supresores sobre las convulsiones resistentes a los medicamentos. Para llevar a cabo acciones efectivas, los parámetros de estimulación (por ejemplo, orientación, intensidad de campo, y la duración de estimulación) deben ser examinados en el tramo preparativos ratones cerebrales. Pruebas y la organización de la orientación del electrodo respecto a la posición de la rebanada de cerebro de ratones son factibles. El presente método conserva la vía thalamocingulate para evaluar el efecto de DCS sobre las actividades que parecen convulsiones corteza cingulada anterior. Los resultados de los registros de matriz multicanal indicaron que catódica DCS disminuyó significativamente la amplitud de las respuestas de estimulación evocado y duración de 4-aminopiridina y la actividad convulsiva-como bicuculina inducida. Este estudio también encontró que las aplicaciones DCS catódica en 15 min causó depresión a largo plazo en la vía thalamocingulate. El presente estudio investiga los efectos de DCS en thalamocingulate plasticidad sináptica y actividades agudos que parecen convulsiones. El procedimiento actual puede poner a prueba los parámetros de estimulación óptimos incluyendo la orientación, intensidad de campo, y la duración de estimulación in vitro en un modelo de ratón en. Además, el método puede evaluar los efectos de DCS en las actividades corticales que parecen convulsiones, tanto a nivel celular y de la red.

Preparación de la instalación de Thalamocingulate rebanada y sistema de grabación MEA La rebanada MT-ACC de los ratones es una rebanada preparación especial que permite la exploración de las propiedades electrofisiológicas de la vía thalamocingulate. La Figura 1A muestra la manera en que se preparó la rebanada MT-ACC. El cerebro del ratón se retiró rápidamente y se mantiene en LCRa oxigenado fresco (Fi...

Los estudios han demostrado que la estimulación catódica transcraneal de corriente directa puede producir efectos supresores sobre las convulsiones resistentes a los medicamentos. En este estudio, se diseñó una configuración experimental in vitro en la que se evaluó la estimulación de corriente continua y el registro de la matriz de múltiples electrodos de la actividad similar a las convulsiones en la preparación de cortes de cerebro de ratones. Se evaluaron los parámetros de estimulación de corriente continua.

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

Cathodal transcranial direct-current stimulation (tDCS) induces suppressive effects on drug-resistant seizures. To perform effective actions, the ...

El objetivo general de este procedimiento experimental es acceder a la disposición de los electrodos en la cámara de registro para la estimulación con corriente continua de una sección de cerebro y evaluar su efecto sobre la actividad similar a convulsiones registrada mediante una matriz de múltiples electrodos. Esto puede ayudar mejor a responder preguntas clave sobre la estimulación con corriente continua y la actividad similar a convulsiones registrada con una matriz de múltiples electrodos en secciones cerebrales de ratón. Una ventaja de esta técnica es que los efectos de la estimulación con corriente continua pueden evaluarse en una vía específica de la sección cerebral de ratón.La procedura será demostrada por Hsiang Chin y Wei-Jen Chang, técnicos de mi laboratorio. En este procedimiento, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75 % antes del experimento. Luego, exponga el cráneo del animal y retire el músculo restante.A continuación, retire la superficie dorsal del cráneo utilizando rongeurs y corte los lados. Posteriormente, con una espátula, corte los bulbos olfatorios y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro antes de extraerlo. Transfiera rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno con ACSF frío con hielo y oxigenado.Para preparar cortes que contengan la vía MT-ACC, realice un corte sagital a 2 mm lateral a la línea media en cada hemisferio, para exponer la anatomía subcortical. Luego, haga un corte transversal angular paralelo al tracto de fibras visible en el estriado. Realice el segundo corte transversal angular desde la conexión entre el cerebelo y la corteza visual hasta el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico, ubicado ventralmente y paralelo a la vía tálamo-cingulada.Después de eso, fije el bloque cerebral a una placa angular con un adhesivo de cianoacrilato. Realice un corte justo por encima del punto de giro de la trayectoria. A continuación, desdoble la placa, aplanele y pegue sobre la plataforma de la cámara de un vibrátomo.Posteriormente, seccionar las muestras de cerebro con un grosor de 500 micrómetros y mantenerlas en ACSF oxigenado y frío con hielo. Transferir una muestra a la cámara de registro a 32 grados Celsius con perfusión continua de ACSF oxigenado durante una hora. Confirmar la colocación de una sonda MEA en el sistema multicanal.Utilice un tubo para guiar el ACSF hacia la cámara del MEA y el otro tubo para guiar el ACSF fuera de la cámara. Perfunda continuamente la preparación con ACSF calentado y oxigenado a 30 grados Celsius. Con un hisopo de algodón humedecido, transfiera una sección del cerebro al MEA.Mueva cuidadosamente la sección del cerebro para orientar la CAC sobre los electrodos y luego estabilice la sección con un anclaje para secciones, asegurando así una buena conexión eléctrica entre la sección y los electrodos. Posteriormente, coloque el electrodo anódico próximo a la CAC y el electrodo catódico distal a la CAC. Registre la intensidad del campo mediante las dos orientaciones del campo de la EMA.Luego, aplique las corrientes eléctricas utilizando un estimulador. Ajuste la distancia entre los dos electrodos de cloruro de plata a aproximadamente 1,5 a 2 cm y regule la intensidad de la corriente del estimulador para que la DCS esté entre 0,5 y 2 miliamperios. En este procedimiento, coloque un electrodo de tungsteno en MT y aplique pulsos desde el estimulador a la región tálamica del corte.A continuación, utilice diversas intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta en la CAC. Desplace el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía tálamo-cingular para obtener el perfil de respuesta óptimo. Registre de 1 a 20 respuestas de la CAC y utilice el software para promediar automáticamente todas las respuestas de la CAC evocadas por la estimulación del MT.Para inducir actividad similar a una convulsión, agregue 250 micromolar de 48P y 5 micromolar de bicuculina a la solución de perfusión, y continúe perfundiendo la sección durante dos o tres horas. Mantenga la bomba a una velocidad de perfusión relativamente rápida, lo que puede ayudar a prevenir la formación de un gradiente de pH. A continuación, coloque el electrodo de tungsteno en MT y aplique estimulación eléctrica para obtener un perfil de respuesta de la CAC.Registre 10-20 barridos y promedie las respuestas. Posteriormente, sustituya la solución prefusión con ACSF fresco para lavar los fármacos. En este procedimiento, asegúrese de generar campos eléctricos uniformes, haciendo pasar corrientes entre dos alambres de plata recubiertos de cloruro de plata colocados dentro de la cámara del MEA.Si no hay problemas, el DCS debe mantenerse entre 0,5 y 2 miliamperios. A continuación, apague el DCS y estimule el tálamo con un electrodo de tungsteno. Para obtener respuestas sinápticas máximas en la CAC, registre 10-20 respuestas y luego promédialas.Luego, encienda el DCS y estimule simultáneamente el tálamo. Evalúe los cambios en la amplitud de la respuesta del cíngulo anterior evocada por la estimulación talámica durante el DCS. Ahora, apague el DCS, agregue 250 micromolar de 48P y 5 micromolar de bicuculina a la solución de perfusión, y espere de 2 a 3 horas.Si los fármacos afectan la sección cerebral, la sección debe producir respuestas epilépticas corticales. Posteriormente, recolecte 10-20 respuestas corticales del cíngulo anterior y mida la amplitud y duración de las respuestas epilépticas corticales evocadas eléctricamente. A continuación, encienda el DCS y estimule simultáneamente el tálamo.Evalúe los cambios en la amplitud y duración de las respuestas corticales epilépticas evocadas durante la aplicación de DCS. Después, reemplace la solución de perfusión con ACSF fresca para eliminar los fármacos. Esta figura muestra diferentes respuestas evocadas, que incluyen las respuestas evocadas por estimulación talámica en la ACC, la actividad semejante a convulsiones inducida por fármacos y la actividad semejante a convulsiones inducida tanto por estimulación talámica como por fármacos.Esta figura muestra el efecto de diferentes orientaciones en la DCS, como distintas orientaciones en el campo eléctrico, respuestas evocadas por estimulación talámica con DCS y el efecto de la DCS catódica sobre la actividad tipo convulsión. En esta figura, se muestra que 15 minutos de DCS catódica indujeron efectivamente una depresión a largo plazo y disminuyeron las respuestas evocadas. La duración de las convulsiones disminuyó significativamente tras 15 minutos de DCS catódica en comparación con la ausencia de aplicación de DCS.más rápido, esto técnicamente puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Tras este procedimiento, se pueden realizar otras intervenciones como la estimulación magnética transcraneal, con el fin de responder preguntas adicionales, tales como ofrecer enfoques no invasivos para controlar las convulsiones resistentes. Tras este avance, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia no invasiva exploraran tratamientos contra las convulsiones en modelos animales.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar la estimulación eléctrica para evaluar la actividad similar a convulsiones en cortes cerebrales.

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Investigación

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Neurociencia

Este video describe un protocolo para implantar una sonda de silicio lineal de múltiples vástagos en el cerebro del ratón para medir los potenciales de campo local. El procedimiento consiste en asegurar la sonda a una unidad estereotáxica, colocarla con precisión sobre la región del cerebro objetivo, insertarla en el cerebro y asegurarla con cemento dental. Después de la implantación, el conjunto se protege con una carcasa. Después de la recuperación, la configuración permite registrar los...

Registro de la actividad eléctrica cerebral en ratones que se comportan utilizando sondas de silicio lineales de vástago múltiple

Este protocolo implica el uso de una matriz de microelectrodos (MEA) para registrar la actividad eléctrica en un corte de cerebro expuesto a una droga inductora de convulsiones. El procedimiento incluye la colocación del corte de cerebro en una cámara de registro MEA, la aplicación de estimulación eléctrica para inducir convulsiones artificiales y el análisis de las señales resultantes.

Monitorización de la actividad eléctrica neuronal inducida por convulsiones en cortes de cerebro mediante matrices de microelectrodos

En este video, se investigan los efectos de la estimulación transcraneal de corriente directa (tDCS) en cortes de cerebro que contienen las regiones de la corteza cingulada anterior (ACC) y el tálamo, utilizando una matriz de electrodos múltiples (MEA) para medir las señales eléctricas. Mediante la administración de pulsos eléctricos y la infusión de fármacos inductores de convulsiones, el estudio investiga la respuesta del ACC a las convulsiones.

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El video muestra un estudio para evaluar el impacto de la estimulación de corriente continua (EDC) en los ataques epilépticos en cortes de cerebro de ratón. Los cortes de cerebro que contienen las regiones conectadas del tálamo medial (MT) y la corteza cingulada anterior (ACC) se colocan en una matriz de electrodos múltiples (MEA). Se aplican estímulos eléctricos a la MT y fármacos inductores de convulsiones para inducir crisis epilépticas en el ACC. A continuación, se aplica la EDC para...

Impacto de la estimulación de corriente continua en las convulsiones epilépticas evocadas en cortes de cerebro de ratón

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Generación de eventos ictales espontáneos y bajo demanda en cortes corticales del cerebro de ratón

Estamos aquí describimos cómo realizar múltiples grabaciones de electrodos de matriz de tejido cortical humano epiléptico. Resección del tejido epiléptico, preparación rebanada y matriz de electrodos múltiples grabaciones de eventos interictales y ictales se demuestran en detalle.

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Modelos de convulsión aguda son importantes para el estudio de los mecanismos subyacentes a los eventos epileptiformes. Además, la capacidad para generar eventos epileptiformes en demanda proporciona un método altamente eficiente para estudiar la secuencia exacta de los eventos subyacentes a su iniciación. Aquí, describimos los modelos de crisis cortical aguda 4-aminopiridina en tejido humano y ratón.

Generación y demanda inicio de la actividad Ictal aguda en roedores y tejido humano

El protocolo presentado describe el transporte y la preparación del tejido hipocampal humano resecado con el objetivo final de utilizar las rebanadas cerebrales vitales como una herramienta de evaluación preclínica para posibles sustancias antiepilépticas.

Preparación de rebanadas agudas de hipocampo humano para grabaciones electrofisiológicas

Aquí, describimos un protocolo para el uso de sistemas complementarios de matriz de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico (CMOS-HD-MEA) para registrar la actividad similar a las convulsiones de cortes de cerebro ex vivo .

Actividad similar a las convulsiones de alta calidad a partir de cortes agudos de cerebro utilizando un sistema complementario de matriz de microelectrodos de alta densidad de semiconductores de óxido metálico

Aprende a evaluar la estimulación de corriente directa en rebanadas de cerebro de ratón mediante matrices multi-electrodo para registrar actividad convulsiva. Este método permite analizar vías neuronales específicas y su respuesta a la estimulación catódica en modelos in vitro.

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación (Video) | JoVE Journal

La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

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