La estimulación de corriente directa y multi-electrodo matriz de registro de la actividad convulsiva en ratones cerebro rebanada preparación

El objetivo general de este procedimiento experimental es acceder a la disposición de los electrodos en la cámara de registro para la estimulación de corriente continua de un corte de cerebro y su efecto sobre la actividad similar a las convulsiones registrada con una matriz de electrodos múltiples. Esto puede ayudar a responder mejor a las preguntas clave en la estimulación de corriente continua, y una matriz de electrodos múltiples registró una actividad similar a una convulsión en un corte de cerebro de ratón. Una ventaja de esta técnica es que los efectos de la estimulación de corriente continua se pueden evaluar en la vía específica del corte de cerebro del ratón.

Hsiang Chin y Wei-Jen Chang, técnicos de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento. En este procedimiento, esterilice todos los instrumentos quirúrgicos con una solución de etanol al 75% antes del experimento. Luego, expone el cráneo del animal y recorta el músculo restante.

A continuación, pela la superficie dorsal del cráneo con rongeurs y recorta los lados. Posteriormente, con una espátula, corte los bulbos olfativos y las conexiones nerviosas a lo largo de la superficie ventral del cerebro antes de retirarlo. Transfiera rápidamente el cerebro a un vaso de precipitados lleno de ACSF oxigenado y helado.

Para preparar cortes que contengan la vía MT-ACC, haga un corte sagital, 2 mm lateral a la línea media en cada hemisferio, para mostrar la anatomía subcortical. Luego, haga un corte transversal en ángulo paralelo al tracto de fibras visible en el cuerpo estriado. Realice el segundo corte transversal en ángulo desde la conexión entre el cerebelo y la corteza visual, hasta el punto medio entre la comisura anterior y el tracto óptico, que son ventrales y paralelos a la vía cingulada del tálamo.

Después de eso, fije el bloque cerebral a una placa angular con un adhesivo de cianoacrilato. Haga un corte justo por encima del punto de inflexión del camino. Después de eso, despliega la placa, aplánala y pégala en la etapa de la cámara de un vibrátomo.

Posteriormente, seccione las rodajas de cerebro de 500 micrómetros de espesor y manténgalas en ACSF oxigenado helado. Transfiera un corte a la cámara de registro a 32 grados centígrados con profusión continua de ACSF oxigenado durante una hora. Confirme la ubicación de una sonda MEA en el sistema multicanal.

Utilice un tubo para guiar el ACSF dentro de la cámara MEA y el otro tubo para guiar el ACSF fuera de la cámara. Perfundir continuamente la preparación con ACSF caliente y oxigenado a 30 grados centígrados. Con un hisopo de algodón húmedo, transfiera un trozo de cerebro al MEA.

Mueva con cuidado el corte de cerebro para orientar el ACC por encima de los electrodos, luego, estabilice el corte de cerebro con un anclaje de corte para garantizar una buena conexión eléctrica entre el corte y los electrodos. A continuación, coloque el electrodo del ánodo proximal al ACC y el electrodo del cátodo distal al ACC. Registre la intensidad de campo mediante las dos orientaciones de campo de MEA.

A continuación, suministre las corrientes eléctricas mediante un estimulador. Ajuste la distancia entre los dos electrodos de cloruro de plata a aproximadamente 1,5 a 2 cm y ajuste la intensidad de corriente de los estimuladores para que el DCS esté entre 0,5 y 2 miliamperios. En este procedimiento, coloque un electrodo de tungsteno en MT y administre pulsos desde el estimulador a la región talámica de la rebanada.

A continuación, utilice varias intensidades de corriente para determinar el umbral que provoca una respuesta ACC. Mueva el electrodo de tungsteno a lo largo de la vía cingulada del tálamo para obtener el perfil de respuesta óptimo. Registre de 1 a 20 respuestas ACC y use el software para promediar automáticamente todas las respuestas ACC evocadas por mi estimulación MT.

Para inducir una actividad similar a la de las convulsiones, agregue 250 micromolares 48P y 5 micromolares bicucullina a la solución de perfusión, y continúe profusando el corte durante dos o tres horas. Mantenga la bomba a una tasa de perfusión relativamente rápida, lo que puede ayudar a prevenir la acumulación de un gradiente de pH. A continuación, coloque el electrodo de tungsteno en MT y administre estimulación eléctrica para obtener un perfil de respuesta ACC.

Registre de 10 a 20 barridos y promedie las respuestas. Después, reemplace la solución de prefusión con ACSF fresco para lavar los medicamentos. En este procedimiento, asegure la generación de campos eléctricos uniformes, haciendo pasar corrientes entre dos cables paralelos de plata recubiertos de cloruro de plata que se colocan dentro de la cámara MEA.

Si no hay problemas, el DCS debe permanecer entre 0,5 y 2 miliamperios. A continuación, apague el DCS y estimule el tálamo con un electrodo de tungsteno. Para obtener respuestas sinápticas máximas en ACC, registre de 10 a 20 respuestas y luego promedie.

A continuación, encienda el DCS y estimule el tálamo simultáneamente. Evaluar los cambios de amplitud de la estimulación talámica evocada por la respuesta ACC durante la EDC. Ahora, apague el DCS, agregue 250 micromolares 48P y 5 micromolares bicucullina a la solución de perfusión y espere de 2 a 3 horas.

Si los fármacos afectan al corte del cerebro, el corte debería producir respuestas de convulsiones corticales. Posteriormente, recoja de 10 a 20 respuestas corticales cinguladas anteriores y mida la amplitud y duración de las respuestas corticales convulsivas evocadas eléctricamente. Nido, encienda el DCS y estimule el tálamo simultáneamente.

Evaluar los cambios en la amplitud y duración de las respuestas convulsivas corticales evocadas durante la aplicación de EDC. Después de eso, reemplace la solución de perfusión con ACSF fresco para lavar los medicamentos. Esta figura muestra diferentes respuestas evocadas, que incluyen las respuestas evocadas por la estimulación talámica en el ACC, la actividad similar a las convulsiones inducida por fármacos, y tanto la estimulación talámica como la actividad similar a las convulsiones inducidas por medicamentos.

Esta figura muestra el efecto de diferentes orientaciones en la EDC, como las diferentes orientaciones en el campo eléctrico, las respuestas evocadas por la estimulación talámica con la EDC y el efecto de la EDC catódica en la actividad similar a las convulsiones. Y en esta figura, se muestra que 15 minutos de EDC catódica han inducido eficazmente la depresión a largo plazo y las respuestas evocadas depresivas. La duración de las convulsiones disminuyó significativamente después de 15 minutos de EDC catódica en comparación con ninguna aplicación de EDC.

Más rápido, esto técnicamente se puede hacer en cuatro horas si se realiza correctamente. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otras cuestiones como la estimulación magnética transcraneal, con el fin de responder preguntas adicionales como proporcionar enfoques no invasivos para controlar las convulsiones de resistencia. Después de este desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la terapia no invasiva exploraran tratamientos para las convulsiones en modelos animales.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar la estimulación actual para evaluar la actividad similar a las convulsiones en los cortes de cerebro.