Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

El objetivo general de este experimento es identificar las especies de material botánico utilizando espectrometría de masas de ionización ambiental. En conjunto con el análisis estadístico multivariante. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química y la biología, como, por ejemplo, qué especie de planta tiene en función de su huella química.

Y también se puede obtener información sobre las moléculas bioactivas que se encuentran en el tejido vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que se necesita muy poca preparación de la muestra para el análisis y los datos se pueden adquirir en pocos minutos. Este método también se puede utilizar para resolver otros problemas de química.

Por ejemplo, el seguimiento de productos intermedios de reacción y productos en síntesis orgánica, el análisis de matrices complejas de diferentes tipos y la realización de análisis de espacio de cabeza. Para preparar el material de hoja fresca de kratom, use una perforadora de seis milímetros de diámetro para crear trozos uniformes de material de hoja de kratom de la planta M. speciosa. Repite este proceso cinco veces.

Para extraer el polvo de kratom, trabaje en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros y suspenda una pequeña cantidad de polvo de kratom Bali en un mililitro de una mezcla de etanol a agua. Repite este proceso cinco veces. Sonicar las muestras de extracto de kratom en polvo de Bali en un baño ultrasónico durante 30 minutos a temperatura ambiente.

A continuación, centrifuga las muestras de extracto de kratom en polvo de Bali durante dos minutos a 750 veces G a temperatura ambiente. Decantar el disolvente del polvo residual para su posterior análisis. Para preparar las semillas de datura, corte una semilla de D. stramonium por la mitad a lo largo del plano transversal con una cuchilla de afeitar.

Repite este proceso usando cinco semillas diferentes. Después de configurar el espectrómetro de masas o los parámetros MS como se describe en el protocolo de texto, presione Iniciar ejecución en el software de control del espectrómetro de masas para analizar la hoja de kratom. Suspenda el chad de material vegetal de hoja de kratom entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta obtener un espectro.

Repita este procedimiento cinco veces con trozos separados de material vegetal. Para calibrar el espectro con polietilenglicol 600 abreviado PEG, sumerja el extremo cerrado de un tubo capilar de punto de fusión en el patrón de clavija. Suspenda el capilar recubierto entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas.

Seleccione el botón Detener para finalizar la ejecución analítica. Presione Start Run en el software de control del espectrómetro de masas para analizar la hoja de kratom seca. Suspenda una pequeña cantidad de material de hoja seca entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta obtener un espectro.

Repita la adquisición cinco veces analizando nuevo material vegetal cada vez. Calibre el espectro con PEG como antes y, a continuación, seleccione el botón Detener para finalizar la ejecución analítica. Para analizar el polvo de kratom, presione Start Run en el software de control del espectrómetro de masas.

Sumerge el extremo cerrado de un capilar de punto de fusión en el polvo de kratom. Suspenda el capilar recubierto entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas hasta obtener un espectro. Repita el análisis cinco veces con un nuevo capilar cada vez, seguido de la calibración PEG.

Para analizar el extracto de kratom, sumerja el extremo de un tubo capilar en el extracto. Suspenda el tubo capilar en el soporte de 12 muestras en el riel lineal del espectrómetro de masas. Repita cinco veces con un extracto diferente cada vez.

Presione Iniciar ejecución en el software de control del espectrómetro de masas. Usando el panel de control, seleccione el botón de avance hacia adelante para avanzar el riel lineal a través de la corriente de iones a una velocidad de un milímetro por segundo para recopilar espectros. Calibra el espectro con PEG como antes y pulsa Stop para finalizar la ejecución analítica.

Para analizar las semillas de datura, presione Iniciar ejecución en el software de control del espectrómetro de masas. Suspenda la mitad de la semilla de datura entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta que se recoja un espectro. Asegúrese de que el lado de corte esté orientado hacia la fuente de iones.

Repita este procedimiento cinco veces analizando una nueva mitad de semilla cada vez. Complete el análisis con la calibración PEG y pulse Detener para finalizar la ejecución analítica. Después de realizar el procesamiento de datos como se describe en el protocolo de texto, realice el análisis de componentes principales navegando a la sección Clasificar del software de análisis espectral en la pestaña Configuración y creando clases para el procesamiento de datos seleccionando Agregar clase.

Importe los archivos de texto de los datos seleccionando Agregar archivos. Asigne archivos de datos a la clase apropiada de planta seleccionando Archivos de texto y Establecer clase para archivos seleccionados. Seleccione las masas de características para la discriminación de MS del conjunto de entrenamiento y establezca el porcentaje de umbral en 1%A continuación, establezca una tolerancia de masa en 10 y seleccione Construir vectores a partir de archivos de datos.

En la sección Proceso, realice el análisis de componentes principales marcando la casilla Gráfico PCA 3D y seleccione Calcular. Para realizar la validación cruzada de dejar una salida, seleccione Validar. A continuación, genere el mapa de calor de los datos navegando a la pestaña Gráfico de frecuencia del software de análisis espectral y seleccionando Mapa de calor.

Seleccione Umbral de datos guardados para establecer el umbral de abundancia en 1%Exporte el mapa de calor a una hoja de cálculo seleccionando Guardar mapa de calor en Excel. En el programa de hoja de cálculo, guarde el mapa de calor exportado como un archivo de texto. A continuación, para realizar el análisis de agrupación jerárquica, importe el mapa de calor como un archivo de texto en el software Cluster 3.0.

En la pestaña Jerárquico del clúster 3.0, en Genes y matrices, marque las casillas Clúster y Calcular ponderaciones. Establezca el valor límite en 0,1 y el exponente en uno. Seleccione la agrupación en clústeres de enlace único para realizar el análisis.

Por último, vea el archivo de datos cdt generado en la vista de árbol de Java. Aquí se muestran espectros representativos del modo de iones positivos de ionización suave de los productos de kratom. Se identificaron compuestos previamente aislados de M. speciosa.

Incluyendo los biomarcadores psicoactivos Mitraginina y 7-Hidroxi-Mitraginina. Aquí se muestran espectros representativos del modo de iones positivos de ionización suave de las semillas de datura. Se identificaron compuestos previamente aislados de la datura, incluyendo los biomarcadores psicoactivos Atropina y Escopolamina.

Aquí se ilustran las representaciones del mapa de calor de los datos de espectrometría de masas. Se muestra un análisis de componentes principales o gráfico PCA de los datos de kratom y datura. El gráfico PCA muestra claramente que los datos de kratom y los datos de datura están bien resueltos entre sí.

El análisis del PCA también reveló que las variedades individuales de kratom y las diferentes especies de datura pueden identificarse y distinguirse entre sí. Se muestran los resultados del análisis de agrupamiento jerárquico o HCA de los datos espectrales de masas de kratom y datura. Los resultados de HCA revelaron la diferenciación de clases, especies y variedades basada únicamente en el análisis directo en datos derivados de espectrometría de masas de alta resolución en tiempo real y confirmaron los resultados del análisis de PCA.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en menos de una hora, dependiendo del número de muestras que se tengan, si se hace correctamente. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo usar el análisis directo y la espectrometría de masas en tiempo real para analizar muestras complejas y utilizar el procesamiento de análisis estadístico de los datos para obtener información sobre las especies. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la muestra en la corriente de iones durante un período de tiempo adecuado para adquirir un espectro de masas completo de la muestra.

Esta técnica ha permitido a los investigadores en muchos campos, incluyendo la Química Vegetal, Forense, Orgánica y Analítica, explorar el análisis de los volátiles emitidos por las plantas, identificar alternativas legales para obtener medicamentos y monitorear los productos de reacción en tiempo real.