Rápida de alto rendimiento Identificación de Especies de material botánico Uso del análisis directo en tiempo real de alta resolución Espectrometría de Masas

El objetivo general de este experimento es identificar la especie de material botánico utilizando espectrometría de masas con ionización ambiental. En conjunto con el análisis estadístico multivariado. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química y la biología, tales como, por ejemplo, qué especie de planta se tiene según su huella química.

Y también se puede obtener información sobre las moléculas bioactivas que se encuentran en el tejido vegetal. La principal ventaja de esta técnica es que se necesita muy poca preparación de la muestra para el análisis y los datos se pueden obtener en pocos minutos. Este método también puede utilizarse para resolver otros problemas en química.

Por ejemplo, rastrear intermediarios y productos de reacción en la síntesis orgánica, analizar matrices complejas de diferentes tipos y realizar análisis de espacio de cabeza. Para preparar el material de hoja fresca de kratom, utilice un perforador de seis milímetros de diámetro para crear trozos uniformes de material de hoja de kratom de la planta M. speciosa. Repita este proceso cinco veces.

Para extraer el polvo de kratom, trabaje en un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros y suspenda una pequeña cantidad de polvo de kratom Bali en un mililitro de una mezcla de etanol y agua en proporción uno a uno. Repita este proceso cinco veces. Someta las muestras de extracto de polvo de kratom Bali a sonicación en un baño ultrasónico durante 30 minutos a temperatura ambiente.

Luego, centrifugue las muestras del extracto de polvo de kratom Bali durante dos minutos a 750 veces G a temperatura ambiente. Decante el disolvente del polvo residual para su posterior análisis. Para preparar las semillas de datura, corte una semilla de D.stramonium por la mitad a través del plano transversal utilizando una cuchilla de afeitar.

Repita este proceso utilizando cinco semillas diferentes. Después de configurar los parámetros del espectrómetro de masas o MS según se describe en el protocolo escrito, presione Iniciar análisis en el software de control del espectrómetro de masas para analizar la hoja de kratom. Suspenda el material vegetal de la hoja de kratom entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta obtener un espectro.

Repita este procedimiento cinco veces con fragmentos separados de material vegetal. Para calibrar el espectro con polietilenglicol 600, abreviado como PEG, sumerja el extremo cerrado de un tubo capilar de punto de fusión en el estándar de PEG. Suspenda el capilar recubierto entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas.

Seleccione el botón Detener para finalizar el análisis. Presione Iniciar análisis en el software de control del espectrómetro de masas para analizar la hoja de kratom seca. Suspenda una pequeña cantidad de material de hoja seca entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta obtener un espectro.

Repita la adquisición cinco veces, analizando nuevo material vegetal cada vez. Calibre el espectro con PEG como antes y luego seleccione el botón Detener para finalizar el análisis. Para analizar el polvo de kratom, presione Iniciar análisis en el software de control del espectrómetro de masas.

Sumerja el extremo cerrado de un capilar de punto de fusión en el polvo de kratom. Suspenda el capilar recubierto entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas hasta obtener un espectro. Repita el análisis cinco veces utilizando un capilar nuevo cada vez, seguido de la calibración con PEG.

Para analizar el extracto de kratom, sumerja el extremo de un tubo capilar en el extracto. Suspenda el tubo capilar en el portamuestras 12 sobre el riel lineal del espectrómetro de masas. Repita cinco veces con un extracto diferente cada vez.

Pulse Iniciar ejecución en el software de control del espectrómetro de masas. Utilizando el panel de control, seleccione el botón de avance para mover el riel lineal a través de la corriente iónica a una velocidad de un milímetro por segundo para recopilar los espectros. Calibre el espectro con PEG como antes y pulse Detener para finalizar el análisis.

Para analizar las semillas de datura, pulse Iniciar ejecución en el software de control del espectrómetro de masas. Sujete la mitad de la semilla de datura entre la fuente de iones y la entrada del espectrómetro de masas con pinzas hasta que se obtenga un espectro. Asegúrese de que el lado cortado esté orientado hacia la fuente de iones.

Repita este procedimiento cinco veces, analizando una nueva mitad de semilla cada vez. Complete el análisis con la calibración de PEG y presione Detener para finalizar la corrida analítica. Después de realizar el procesamiento de datos según se describe en el protocolo escrito, realice el análisis de componentes principales navegando hasta la sección Clasificar del software de análisis espectral, dentro de la pestaña Configuración, y cree clases para el procesamiento de datos seleccionando Agregar clase.

Importe los archivos de texto de los datos seleccionando Agregar archivos. Asigne los archivos de datos a la clase correspondiente de planta seleccionando Archivos de texto y Establecer clase para archivos seleccionados. Seleccione las masas características para la discriminación a partir de MS del conjunto de entrenamiento y establezca el umbral porcentual en 1 %. A continuación, establezca una tolerancia de masa en 10 y seleccione Crear vectores a partir de archivos de datos.

En la sección Cálculo, realice un análisis de componentes principales marcando la casilla para el gráfico PCA 3D y seleccione Calcular. Realice una validación dejando uno fuera (leave-one-out) seleccionando Validar. Luego, genere el mapa de calor de los datos yendo a la pestaña Gráfico de frecuencia del software de análisis espectral y seleccionando Mapa de calor.

Seleccione los datos guardados de umbral para establecer el umbral de abundancia en 1 %. Exporte el mapa de calor a una hoja de cálculo seleccionando Guardar mapa de calor en Excel. En el programa de hojas de cálculo, guarde el mapa de calor exportado como un archivo de texto. Luego, para realizar el análisis de agrupamiento jerárquico, importe el mapa de calor como un archivo de texto en el software Cluster 3.0.

En la pestaña Jerárquica de Cluster 3.0, bajo Genes y Matrices, marque las casillas Agrupar y Calcular pesos. Establezca el valor de corte en 0,1 y el exponente en uno. Seleccione el agrupamiento por enlace simple para realizar el análisis.

Finalmente, visualice el archivo de datos cdt generado en la vista de árbol de Java. Aquí se muestran espectros representativos en modo de ionización suave con iones positivos de productos de kratom. Se identificaron compuestos previamente aislados de M. speciosa.

Incluyendo biomarcadores psicoactivos como la mitraginina y la 7-hidroximitraginina. Aquí se muestran espectros representativos en modo de ionización suave con iones positivos de semillas de datura. Se identificaron compuestos previamente aislados de datura, incluyendo los biomarcadores psicoactivos atropina y escopolamina.

Se ilustran aquí representaciones de mapas de calor de los datos espectrométricos de masas. Se muestra un gráfico de análisis de componentes principales o PCA de los datos de kratom y datura. El gráfico PCA muestra claramente que los datos de kratom y los datos de datura están bien resueltos entre sí.

El análisis de PCA también reveló que las variedades individuales de kratom y las diferentes especies de datura pueden identificarse y distinguirse entre sí. Se muestran los resultados del análisis de agrupamiento jerárquico o HCA de los datos espectrales de masas de kratom y datura. Los resultados del HCA revelaron diferenciación a nivel de clase, especie y variedad únicamente con base en datos derivados de análisis directo mediante espectrometría de masas de alta resolución en tiempo real, y confirmaron los resultados del análisis de PCA.

Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en menos de una hora, dependiendo del número de muestras que tenga, siempre que se realice correctamente. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar el análisis directo y la espectrometría de masas en tiempo real para analizar muestras complejas y cómo aplicar el procesamiento estadístico de los datos para obtener información sobre las especies. Al intentar este procedimiento, es importante mantener la muestra en el haz de iones durante un tiempo adecuado para adquirir un espectro de masas completo de la muestra.

Esta técnica ha permitido a investigadores de múltiples campos, incluidos el de la Omica Vegetal, la Genética Forense, la Química Orgánica y la Química Analítica, explorar el análisis de volátiles emitidos por las plantas, identificar alternativas legales para provocar drogas y monitorear productos de reacción en tiempo real.