La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

El objetivo general de este procedimiento es reconstituir estructuras mitóticas en forma de huso dentro del confinamiento geométrico de agua en gotas de emulsión de aceite. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ensamblaje de husillos mitóticos, como por ejemplo, ¿cómo se colocan y ensamblan los husillos, y cuál es la contribución específica de los componentes individuales a estos procesos? La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos un enfoque de abajo hacia arriba para reconstituir estructuras en forma de huso dentro del confinamiento geométrico que imita la forma de una célula mitótica.

Este método también se puede utilizar para estudiar otros procesos que dependen del confinamiento celular. Mezcle 10 partes de prepolímero PDMS con una parte de agente de curado en una masa total de aproximadamente 40 gramos. Luego, coloque la mezcla en una cámara de vacío durante unos 30 minutos para eliminar las burbujas de aire.

Mientras tanto, envuelva papel de aluminio alrededor del molde para crear una taza de un centímetro de profundidad con un diámetro de cuatro pulgadas. Cuando esté listo, vierta aproximadamente 3/4 de la mezcla de PDMS en el molde. Luego, regrese el PDMS a una cámara de vacío durante otros 30 minutos.

Después de la desgasificación, cure el PDMS durante una hora a 100 grados centígrados. Mientras tanto, prepare algunos portaobjetos de vidrio para el recubrimiento giratorio desempolvándolos con aire comprimido. A continuación, aplica una capa de la mezcla PDMS restante sobre los portaobjetos.

Cura estos portaobjetos durante una hora a 100 grados centígrados para endurecer el PDMS. A continuación, retire suavemente el PDMS con una cuchilla de afeitar y perfore los agujeros necesarios de las tiras de PDMS para hacer chips microfluídicos. Ahora, trate con corona el chip microfluídico y un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS durante unos segundos.

Finalmente, coloque un chip microfluídico en cada portaobjetos de vidrio con los canales hacia abajo y hornee los chips durante la noche a 100 grados centígrados. Primero, usando cristalería lavada con cloroformo, prepare unos 250 microgramos de lípidos disueltos en cloroformo. Seque cuidadosamente la mezcla de lípidos con gas inerte.

Y luego colóquelo en una cámara de vacío durante una hora. Luego, disuelva los lípidos en aceite mineral y surfactante al 2,5% a 0,5 miligramos por mililitro, que son aproximadamente 500 microlitros. Para disolver completamente los lípidos, sonique la mezcla durante 30 minutos a 40 kilohercios.

A continuación, centrifuga la capa de PDMS sobre cubreobjetos con un grosor que coincida con el objetivo del microscopio. A continuación, centrifuga la capa de PDMS sobre portaobjetos de vidrio. Ahora, cure los cubreobjetos recubiertos de PDMS y los portaobjetos de vidrio durante una hora a 100 grados centígrados.

A continuación, haga las celdas de flujo espaciando estrechamente las rodajas finas de la película de sellado de laboratorio en los portaobjetos de vidrio recubiertos de PDMS. Coloque las tiras de tres milímetros a unos dos milímetros de distancia. Luego, cubra las celdas de flujo con un cubreobjetos recubierto de PDMS y selle el conjunto derritiendo la película a 100 grados Celsius durante un minuto rápido.

Una vez calentado, presione suavemente la tapa hacia abajo y séllela con Valap. A continuación, prepare una taza de PDMS para la obtención de imágenes a largo plazo. Perfore un orificio de cuatro milímetros de diámetro en una rebanada de PDMS de tres milímetros de grosor.

A continuación, trate con corona la rebanada de PDMS y un cubreobjetos recubierto de PDMS. Una vez tratados, colóquelos uno encima del otro y hornee el ensamblaje durante la noche a 100 grados centígrados. Monitoree la formación de gotas en un microscopio de campo claro invertido.

Conecte la fase de aceite lipídico al controlador de presión y aumente la presión hasta que una gota de aceite salga del tubo máximo. Conecte el tubo de pico a la entrada dos del chip de microfluídica. A continuación, llene completamente los chips microfluídicos con la fase de aceite lipídico de la entrada dos.

A continuación, introduzca la fase de agua basada en MRB-80 desde la entrada uno. Controle el tamaño de las gotas cambiando las presiones de la fase de aceite lipídico y la fase de agua para crear gotas con un diámetro de aproximadamente 15 micras. Alrededor de 800 milibares para la fase de aceite lipídico y 200 milibares para la fase de agua, es un buen punto de partida.

Después de obtener el tamaño de gota deseado, llene completamente la celda de flujo con gotas. Estas gotas se forman a partir de pequeños volúmenes de la fase acuosa. Esto significa que la configuración microfluídica debe funcionar rápidamente para no perder toda la fase acuosa antes de que se formen gotas del tamaño correcto.

Una vez lleno, cierre con cuidado los extremos de la celda de flujo con Valap. Si las gotas no dejan de moverse, entonces el sello no está completo o es posible que se hayan introducido burbujas de aire. Para obtener imágenes a largo plazo, transfiera las gotas a un vaso de PDMS y cúbralas con una capa de mezcla de lípidos de aceite.

Descongele los centrosomas a temperatura ambiente y póngalos a 37 grados centígrados durante 20 minutos para garantizar una nucleación adecuada de los microtúbulos. Mientras espera, prepare la mezcla de ensayo con hielo. Esto debe contener tubulina, GTP, un sistema eliminador de oxígeno, generadores de fuerza molecular como reticulantes de microtúbulos, ATP y sistema de regeneración de ATP.

Una vez mezclado, gire la muestra en el rotor Airfuge enfriado a 30 psi durante tres minutos. A continuación, añade los centrosomas precalentados a la mezcla. Optimice la cantidad de centrosomas añadidos para obtener uno o dos centrosomas por gota.

Luego, use esta mezcla para producir gotas de emulsión como se describió anteriormente. Con el fin de reclutar dineína a los lípidos biotinilados en la corteza de las gotas, incluya GFP-dineína TMR y estreptavidina, a la fase acuosa. En un microscopio confocal de disco giratorio, visualice el crecimiento de los microtúbulos después de 30 minutos a 26 grados centígrados.

Durante la toma de imágenes, el crecimiento de los microtúbulos se puede promover aumentando la temperatura a 28 o incluso 30 grados centígrados. Para las proyecciones Z, tome pilas con intervalos de una micra, lo que debería requerir alrededor de 20 imágenes por gota. Ve al panel principal de la cámara, haz clic en Editar Z y establece el Paso Z en 1.0.

Haga clic en Siguiente para almacenar la configuración. A continuación, establezca la ganancia EM lineal máxima haciendo clic en la pestaña Cámara en el panel Adquisición y deslizando la barra de ganancia EM a 300. A continuación, establece el Tiempo de exposición en 200 milisegundos en la misma pestaña.

Haga clic en Grabar para almacenar la configuración. Para los experimentos de imágenes en vivo, haga proyecciones Z cada dos minutos durante dos horas reduciendo los tiempos de exposición a unos 100 milisegundos y aumentando los intervalos Z a dos micras. Para experimentos de imágenes en vivo, use una copa de PDMS en lugar de una celda de flujo regular para obtener la máxima inmovilización de la muestra.

Utilizando los protocolos descritos, se estudió la formación de aster en gotas de emulsión de agua y aceite que contenían centrosomas. Inicialmente, los centrosomas se difunden libremente dentro de los volúmenes confinados. Después de unos 20 a 30 minutos, los primeros microtúbulos se vuelven visibles y la difusión del centrosoma se restringe a medida que los microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones.

Cuando los microtúbulos crecen más de la mitad del diámetro de la gota, los centrosomas son empujados a límites opuestos, con microtúbulos creciendo a lo largo de la corteza de la gota. Sin estreptavidina, la dimeína se difunde dentro de la gota. Sin embargo, con la estreptavidina, a los 10 minutos de la formación de las gotas, la dineína se une a los lípidos biotinilados.

Al observar la tubulina fluorescente en presencia de dineína cortical, está claro que los centrosomas están colocados en el centro. Mientras que en ausencia de dineína, los centrosomas son empujados a lados opuestos de la gota. Esto se debe probablemente a que la dineína promueve las catástrofes de los microtúbulos y las fuerzas de tracción corticales, lo que resulta en el centrado de los ásteres.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo usar las tecnologías microfluídicas para crear estructuras similares a husos en gotas de emulsión esférica. Una vez dominado, la formación de gotas y la obtención de imágenes se pueden realizar en dos o tres horas cuando se realizan correctamente. Con este procedimiento, se pueden encapsular otros factores de ensamblaje del husillo para estudiar su efecto sobre la morfología y el posicionamiento del husillo.

Siempre se deben tomar precauciones como el uso de guantes mientras se usa cloroformo o PDMS.