La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

El objetivo general de este procedimiento es reconstruir estructuras similares al huso mitótico dentro del confinamiento geométrico de gotas de emulsión de agua en aceite. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ensamblaje del huso mitótico, como cómo se posicionan y ensamblan los husos, y cuál es la contribución específica de los componentes individuales a estos procesos. La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos un enfoque de abajo hacia arriba para reconstruir estructuras similares al huso dentro de un confinamiento geométrico que imita la forma de una célula mitótica.

Este método también puede utilizarse para estudiar otros procesos que dependen del confinamiento celular. Mezcle 10 partes de prepolímero de PDMS con una parte de agente de curado en una masa total de aproximadamente 40 gramos. Luego, coloque la mezcla en una cámara de vacío durante unos 30 minutos para eliminar las burbujas de aire.

Mientras tanto, envuelva el molde con papel de aluminio para crear una copa de un centímetro de profundidad y cuatro pulgadas de diámetro. Cuando esté listo, vierta aproximadamente 3/4 de la mezcla de PDMS en el molde. Luego, devuelva el PDMS a una cámara de vacío durante otros 30 minutos.

Después del desgasificado, cure el PDMS durante una hora a 100 grados Celsius. Mientras tanto, prepare algunos portaobjetos de vidrio para el recubrimiento por centrifugación eliminando el polvo con aire comprimido. A continuación, aplique por centrifugación la mezcla restante de PDMS sobre los portaobjetos.

Cure estos portaobjetos durante una hora a 100 grados Celsius para endurecer el PDMS. A continuación, retire suavemente el PDMS utilizando una cuchilla de afeitar y haga los orificios necesarios en las tiras de PDMS para fabricar los chips microfluídicos. Ahora, trate con corona el chip microfluídico y un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS durante unos segundos.

Finalmente, coloque un chip microfluídico sobre cada portaobjetos con los canales hacia abajo y hornee los chips durante toda la noche a 100 grados Celsius. Primero, utilizando material de vidrio lavado con cloroformo, prepare aproximadamente 250 microgramos de lípidos disueltos en cloroformo. Seque cuidadosamente la mezcla lipídica con gas inerte.

Luego, colóquelo en una cámara de vacío durante una hora. A continuación, disuelva los lípidos en aceite mineral y 2.5% surfactante hasta 0.5 miligramos por mililitro, lo que equivale a aproximadamente 500 microlitros. Para disolver completamente los lípidos, someta la mezcla a sonicación durante 30 minutos a 40 kilohercios.

A continuación, aplique recubrimiento de PDMS por centrifugado sobre cubreobjetos con un espesor que coincida con el objetivo del microscopio. Luego, aplique recubrimiento de PDMS por centrifugado sobre portaobjetos de vidrio. Ahora, cure los cubreobjetos y portaobjetos recubiertos con PDMS durante una hora a 100 grados Celsius.

Luego, prepare las celdas de flujo colocando en estrecha proximidad finas tiras de película selladora de laboratorio sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con PDMS. Coloque tiras de tres milímetros separadas aproximadamente dos milímetros entre sí. A continuación, cubra las celdas de flujo con una cubierta recubierta de PDMS y selle el conjunto derritiendo la película a 100 grados Celsius durante un minuto breve.

Una vez calentado, presione suavemente la laminilla y séllela con Valap. A continuación, prepare una taza de PDMS para imágenes a largo plazo. Haga un orificio de cuatro milímetros de diámetro en una rebanada de PDMS de tres milímetros de espesor.

Luego, trate con corona la rebanada de PDMS y un cubreobjetos recubierto de PDMS. Una vez tratados, colóquelos uno encima del otro y hornee el conjunto durante la noche a 100 grados Celsius. Observe la formación de gotas en un microscopio invertido de campo brillante.

Conecte la fase oleosa de lípidos al controlador de presión y aumente la presión hasta que una gota de aceite salga del tubo capilar. Conecte el tubo capilar a la entrada dos del chip de microfluidos. Luego, llene completamente los chips de microfluidos con la fase oleosa de lípidos a través de la entrada dos.

A continuación, introduzca la fase acuosa basada en MRB-80 desde la entrada uno. Controle el tamaño de las gotas ajustando las presiones de la fase oleosa lipídica y la fase acuosa para generar gotas con un diámetro de aproximadamente 15 micrones. Un buen punto de partida es alrededor de 800 milibares para la fase oleosa lipídica y 200 milibares para la fase acuosa.

Después de obtener el tamaño de gota deseado, llene completamente la celda de flujo con gotas. Estas gotas se forman utilizando pequeños volúmenes de la fase acuosa. Esto significa que el sistema microfluídico debe funcionar rápidamente para no perder toda la fase acuosa antes de que se hayan formado gotas del tamaño correcto.

Una vez llenado, cierre cuidadosamente los extremos de la celda de flujo utilizando Valap. Si las gotas no dejan de moverse, es posible que el sellado no esté completo o que se hayan introducido burbujas de aire. Para imágenes a largo plazo, transfiera las gotas a una copa de PDMS y cúbralas con una capa de mezcla de aceite y lípidos.

Deshiele los centrosomas a temperatura ambiente y colóquelos a 37 grados Celsius durante 20 minutos para asegurar una adecuada nucleación de microtúbulos. Mientras tanto, prepare la mezcla de ensayo sobre hielo. Esta debe contener tubulina, GTP, un sistema eliminador de oxígeno, generadores de fuerza molecular como entrecruzadores de microtúbulos, ATP y un sistema regenerador de ATP.

Una vez mezclado, centrifugar la muestra en el rotor enfriado del Airfuge a 30 psi durante tres minutos. Luego, añadir los centrosomas precalentados a la mezcla. Optimizar la cantidad de centrosomas añadida para obtener uno o dos centrosomas por gota.

Luego, utilice esta mezcla para producir gotas de emulsión como se describió anteriormente. Con el fin de reclutar dineína a lípidos biotinilados en la corteza de las gotas, incluya GFP-dineína TMR y estreptavidina en la fase acuosa. En un microscopio confocal de disco giratorio, visualice el crecimiento de microtúbulos tras 30 minutos a 26 grados Celsius.

Durante la adquisición de imágenes, el crecimiento de los microtúbulos puede promoverse aumentando la temperatura a 28 o incluso 30 grados Celsius. Para las proyecciones en Z, adquiera series con intervalos de un micrómetro, lo que debería requerir aproximadamente 20 imágenes por gota. Vaya al panel principal de la cámara, haga clic en Editar Z y establezca el paso Z en 1,0.

Haga clic en Siguiente para guardar la configuración. A continuación, establezca la ganancia EM lineal máxima haciendo clic en la pestaña Cámara en el panel de Adquisición y deslizando la barra de Ganancia EM hasta 300. Luego, establezca el Tiempo de Exposición en 200 milisegundos en la misma pestaña.

Haga clic en Grabar para almacenar la configuración. Para experimentos de imagen en vivo, realice proyecciones en Z cada dos minutos durante dos horas, reduciendo los tiempos de exposición a aproximadamente 100 milisegundos y aumentando los intervalos en Z a dos micrones. Para experimentos de imagen en vivo, utilice una copa de PDMS en lugar de una celda de flujo convencional para lograr la inmovilización máxima de la muestra.

Utilizando los protocolos descritos, se estudió la formación de astros en gotas de emulsión de agua y aceite que contienen centrosomas. Inicialmente, los centrosomas difunden libremente dentro de los volúmenes confinados. Después de aproximadamente 20 a 30 minutos, se vuelven visibles los primeros microtúbulos, y la difusión de los centrosomas se vuelve restringida a medida que los microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones.

Cuando los microtúbulos crecen más de la mitad del diámetro de la gota, los centrosomas son empujados hacia bordes opuestos, con microtúbulos creciendo a lo largo de la corteza de la gota. Sin estreptavidina, la dineína se encuentra difusa dentro de la gota. Sin embargo, con estreptavidina, aproximadamente 10 minutos después de la formación de la gota, la dineína se une a los lípidos biotinilados.

Al observar la tubulina fluorescente en presencia de dineína cortical, es evidente que los centrosomas están posicionados centralmente. En cambio, en ausencia de dineína, los centrosomas son empujados hacia lados opuestos de la gota. Esto probablemente se debe a que la dineína promueve las catástrofes de microtúbulos y las fuerzas de tracción cortical, lo que resulta en el centrado de las estrellas de microtúbulos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar tecnologías de microfluídica para crear estructuras similares a husos en gotas esféricas de emulsión. Una vez dominadas, la formación de gotas y la obtención de imágenes pueden completarse en dos o tres horas si se realizan adecuadamente. Mediante este procedimiento, se pueden encapsular otros factores de ensamblaje del huso para estudiar su efecto sobre la morfología y la posición del huso.

Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al manipular cloroformo o PDMS.