Name: La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-08-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Aprende a reconstituir haces mitóticos en gotitas de emulsión agua-aceite usando microfluidos y microscopía confocal. Este método bottom-up permite estudiar la dinámica de microtúbulos y el posicionamiento de centrómeros en confinamiento geométrico.

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Nos gustaría agradecer a los miembros del laboratorio de Dogterom por sus valiosas discusiones. Agradecemos a Stefan Diez y Marcel Janson por sus reactivos, y a Samara Reck-Peterson por su ayuda en la purificación de la dineína. Este trabajo ha contado con el apoyo financiero del Consejo Europeo de Investigación (ERC Synergy grant: MODEL-CELL).

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Los métodos descritos aquí presentes los recientes esfuerzos para reconstituir husos mitóticos básicos en gotas de la emulsión de agua-en-aceite. El estudio de conjunto del eje dentro de los límites geométricos ofrece numerosas ventajas. Existen mecanismos importantes de retroalimentación entre los microtúbulos del huso mitótico y las limitaciones geométricas en el que están montados. Los microtúbulos pueden generar fuerzas de empuje cuando crecen en los límites geométricos, que puede resultar en el desplazamiento del huso mitótico. Además, la creciente en una barrera física puede inducir catástrofes microtúbulos. Además, conjunto del eje dentro de una geometría confinada puede conducir a un agotamiento progresivo de los componentes individuales, como la tubulina, que a su vez afecta directamente a la tasa de crecimiento de microtúbulos 36. Estos son todos los factores determinantes esenciales del conjunto del husillo, que se pueden estudiar usando los ensayos descritos aquí. Los ensayos descritos son muy sensibles a differe concentración pequeñaNCES de los componentes de las gotitas. Este es el caso de la tubulina, donde las diferencias de concentración menores pueden resultar en el crecimiento de los microtúbulos demasiado lento o demasiado rápido. En este caso, las tasas de crecimiento de los microtúbulos a menudo pueden todavía ser corregidos mediante el ajuste de la temperatura durante la primera ~ 30 min del experimento. ensamblaje del huso mitótico y la colocación es también muy sensible a las variaciones en la concentración de generadores (cortical) de fuerza. Es probable que esto dependerá de la concentración, pureza y actividad de los componentes purificados y necesita ser valorada cuidadosamente para cada nueva proteína purificada. Además, ciertas soluciones de compromiso tiene que ser realizado en la configuración de imagen, dependiendo de la naturaleza del ensayo. Inicialmente, los altos niveles de dímeros de tubulina fluorescentes solubles hacen que sea difícil de imagen microtúbulos individuales. Como microtúbulos crecen más y tubulina soluble se agota lentamente, la relación señal a ruido se vuelve gradualmente más altas y permite la obtención de imágenes de IndividuAL microtúbulos. En contraste con las configuraciones con sistemas abiertos, el confinamiento geométrico impide el intercambio de moléculas fluorescentes y componentes del sistema eliminador de oxígeno dentro de un depósito a granel, lo que resulta en el blanqueo significativo. Especialmente para el control de ensamblaje del huso y el posicionamiento en el tiempo, se requiere a la imagen con bajas intensidades de luz, incluso en presencia de un sistema eliminador de oxígeno potente. Estos métodos permiten la reconstitución de abajo hacia arriba de las estructuras de huso como simplificados in vitro. Además de los componentes introducidos aquí, muchos otros factores se han descrito para influir en la formación bipolar husillo, el posicionamiento, orientación, configuración, etc. 3. Este sistema se puede ampliar para estudiar los efectos individuales y combinados de generadores de fuerza adicionales. importantes contribuyentes a la formación del huso que actualmente están ausentes de este sistema son los cromosomas mitóticos. cromatina mitótica Se ha demostrado quela formación del huso de particular (1) chromokinesins que puede generar la llamada, (2) la formación de un gradiente de RanGTP por la cromatina determinada RanGEF RCC1 38, (3) cinetocoros que puede interactuar &#39;fuerzas polar de eyección&#39; 3 con (despolimerizar ) microtúbulos 39 y (4) la cromatina en sí, que puede funcionar como un resorte mecánico en el medio microtúbulos opuestas 40. Por último, el sistema descrito actualmente proporciona un control temporal y espacial limitado sobre la actividad y la localización de la fuerza-generadores introducidas. En las células, muchos factores de ensamblaje del huso se localizan en compartimentos específicos o están activos dentro de una ventana de tiempo restringido. Un ejemplo notable es la actividad de la dineína, que está enriquecido específicamente en el lado posterior de la C. elegans de una sola célula de embrión en su fase asimétrica para promover el posicionamiento del cabezal y la división celular. En este sistema, actualmente estamos explorando la posibilidad de imitar tales tactividad utilizando métodos emporal y asimétricas prestadas de las técnicas opto-genéticos. Además, como es el caso de la C. elegans embriones y células con una pared celular rígida, muchas células no se completan en la mitosis. La forma geométrica del confinamiento tendrá un impacto fundamental sobre las fuerzas que actúan sobre el eje 41. Por tanto, será importante para reconstituir conjunto de husillo y posicionamiento en gotas no esféricas, así, potencialmente el uso de sistemas de microfluidos más complejos que permiten que dan forma y el almacenamiento de la emulsión de gotitas de 42,43. Por último, en los tejidos, célula-célula y célula-sustrato de señalización y el apego proporcionan señales externas que se pueden traducir en la orientación del cabezal dirigida, como se observa a menudo en las células epiteliales y las células madre. Todos estos aspectos especializados no han sido tenidas en cuenta en este estudio actual y podría proporcionar los retos del futuro para construir más hacia in vivo -como reconstituciones de assemb huso mitóticoLy y posicionamiento.

Durante la mitosis, los cromosomas del genoma replicado se organizan en el ecuador celular para asegurar la distribución equitativa de las cromátidas hermanas sobre las células hijas recién formadas. posicionamiento y la segregación cromosómica está mediada por su unión a los microtúbulos del huso se originan a partir de dos centrosomas opuestos. Además de garantizar la distribución cromosómica fieles, la orientación del huso mitótico también dicta el plano de división celular 1. Coordinado orientación de la división celular es esencial durante muchas etapas de desarrollo y para la homeostasis del tejido 2. Específicamente, regulado mitótico husillo de posicionamiento puede resultar en la distribución asimétrica de contenidos celulares, o incluso producir células hijas de diferentes tamaños 2. Ensamblaje del huso mitótico y la orientación comienza en la profase y está orquestada por una compleja interacción entre cooperar y antagonizar fuerza generadores 3,4. Las fuerzas generadas consisten en btirar y empujar fuerzas OTH. Estas fuerzas se originan tanto desde los contactos de huso con la corteza celular, así como desde el interior del husillo, y pueden ser generados por la dinámica de microtúbulos, así como por motores moleculares y reticulantes (Figura 1). fuerzas de empuje se pueden generar cuando microtúbulos crecen contra estructuras rígidas tales como la corteza celular. Dependiendo de la fuerza de resistencia total generado dentro del sistema, esto puede resultar en el reposicionamiento del huso mitótico (fuerzas bajas) o desencadenar el pandeo de los microtúbulos o catástrofe (altas fuerzas) 5-8. La cantidad de fuerza que se puede generar empujando depende de la longitud de los microtúbulos, ya que la longitud es un fuerte determinante de microtúbulos pandeo 9. Además, los microtúbulos que se originan de un centrosoma pueden empujar contra el otro centrosoma, un mecanismo que se ha sugerido para impulsar la separación del centrosoma a principios de la profase 3,10. En anunciocondición para empujar las fuerzas generadas por los microtúbulos en crecimiento, los microtúbulos termina en contacto con la corteza celular también puede mediar fuerzas de tracción 11. Estudios de varios laboratorios han demostrado que se requiere la actividad controlada de generadores de fuerza corticales para el posicionamiento asimétrico de husos mitóticos in vivo 1. Esencial para estas fuerzas de tracción es Cortex-localizada dineína citoplasmática (en lo sucesivo, &quot;dineína &#39;), una menos de fin de microtúbulos dirigida proteína motora 8,12,13. Por ejemplo, en la levadura en ciernes, interacciones laterales de dineína cortical con el resultado de celosía de los microtúbulos en los microtúbulos motor dependiente de deslizamiento a lo largo de la corteza 14. Sin embargo, fuerzas de tracción corticales también se pueden generar por la capacidad de dineína para formar accesorios de extremo-a despolimerización de microtúbulos 8. La energía generada por la contracción de los microtúbulos puede dar lugar a fuerzas que son generalmente de un orden de magnitud mayor (~ 50 pN (referencia 15 </sarriba&gt;)) que las fuerzas generadas por proteínas motoras individuales (~ 7-8 pN (ref. 16)). Final en la unión de la dineína cortical a los microtúbulos depolymerizing promueve el posicionamiento del cabezal en la levadura en ciernes 17 y C. elegans 13. Ya sea tanto dependiente del motor, deslizamiento y microtúbulos despolimerización expulsado a las fuerzas de tracción corticales pueden cooperar o se excluyen mutuamente en vivo es desconocida en la actualidad. Además de fuerzas de empuje de los microtúbulos y fuerzas de tracción corticales de dineína mediada por, el posicionamiento centrosoma se controla desde el interior del huso mitótico por numerosas otras proteínas. Kinesin-5 motores, por ejemplo, existen como tetrámeros que pueden cruzar de enlace de microtúbulos antiparalelos interpolares, lo que resulta en la generación de las fuerzas de deslizamiento hacia afuera 18-20. Se requiere que los miembros de la familia de motor kinesin-5 para la separación del centrosoma y montaje de huso bipolar en todos los eucariotas estudiados, con la excepción de C. elegans<html> (revisado en referencia 21). Además, también se conocen difusibles reticulantes de la familia / PRC1 ASE1 para localizar a la superposición de las regiones de los microtúbulos de microtúbulos interpolares in vivo e in vitro 22-27. Las fuerzas generadas por la expansión impulsada por ASE1 de la zona de solapamiento microtúbulos son lo suficientemente grandes para contrarrestar la quinesina-14 fuerzas de deslizamiento mediadas in vitro 28,29. En las células, se requiere ASE1 / PRC1 para la formación estable de la superposición de las regiones de los microtúbulos en el huso midzone 25-27,30, lo que sugiere que las fuerzas generadas por difusibles reticulantes pueden contribuir significativamente a la organización del husillo. Por último, las fuerzas de la cromatina mitótico y cinetocoros influyen ensamblaje del huso mitótico y posicionamiento a través de diversas vías 3. Dado que estos componentes no son parte de los ensayos de reconstitución que se describen aquí, no se discutirán en detalle. jove_content &quot;&gt; Existen diferentes teorías sobre cómo los diferentes componentes moleculares y las fuerzas descritas anteriormente cooperan en conjunto del husillo y el posicionamiento, pero aún están lejos de una comprensión cuantitativa. Además de los experimentos en células vivas, los experimentos in vitro con componentes purificados proporcionan una poderosa ruta para ayudar a alcanzar este objetivo. Aquí presentamos una guía visual para una versión adaptada y extendida de los métodos publicados recientemente (Roth et al. 31), en el que los husillos básicos se reconstituyen en gotitas de emulsión de agua-en-aceite, comenzando con una número mínimo de componentes. Usando técnicas de microfluídica, gotas esféricas se generan con tamaños que son comparables a las células mitóticas. Dentro de estas gotas, centrosomas purificadas y tubulina se pueden combinar con el fin de estudiar la dinámica de aster microtúbulos, generación de fuerzas y aster-aster interacciones. Por introducir corticales (como dineína) e inter-polares (tales como kinesin-5 / ASE1) de fuerza generadores, nosreconstituir estructuras de huso como cada vez más complejos que comienzan a parecerse a la situación in vivo.

<table><tbody><tr><td><fuerte>1. Preparación de chips microfluídicos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Photomask (Fotomáscara sobre sustrato de película)</td><td>Selba S.A. Suiza</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 3025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oblea de silicio (oblea de silicio de 4 pulgadas p/Boro < 1-0-0>10-20 &Omega;-cm, 500-550 &mu; m, SSP, con 2 planos)</td><td>WRS Materials</td><td>4P0SSP-005</td><td></td></tr><tr><td>Recubrimiento giratorio&nbsp;</td><td>Polos</td><td>SPIN150I</td><td></td></tr><tr><td>PDMS prepolímero RVT615 A+B</td><td>Lubribond</td><td>9481</td><td></td></tr><tr><td>Tratamiento de corona</td><td>Productos electrotécnicos</td><td>BD-20ACV</td><td></td></tr><tr><td>2. Configuración microfluídica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</strong</td><td>>Comments</td></tr><tr><td>DOPS (1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840035</td><td></td></tr><tr><td>Biotinyl PE (1,2-Dipalmitoil-sn-glicero-3-fosfoetanolamina-N-( biotinil))Avanti</td> <td>Lípidos polares</td><td>870285</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>650498</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>de vidrio Tubos de vidrio Bomba de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vacío</td><td>Laboport</td><td>KNF</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de vacío</td><td>Kartell</td><td>Polipropileno Desecador</td><td></td>de vacío</tr><tr><td>Aceite mineral</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904</td><td></td></tr><tr><td>Surfactante (Span80)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85548</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Branson</td><td>M2800H</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td></td><td></td><td>24 mm x 60 mm, espesor 1,5</td></tr><tr><td>Portaobjetos</td><td></td><td></td> de vidrio <td>26 mm x 76 mm</td></tr><tr><td>Punzonadora</td><td>Harris Uni-Core</td><td>135840/135841/135843</td><td></td></tr><tr><td>Sellado de laboratorio película</td><td>Parafilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Valap (vaselina, lanolina, cera de parafina derretida a concentraciones iguales)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de campo claro</td><td>casero Leica</td><td>PMIRB&nbsp;</td><td>Cualquier campo claro invertido sería suficiente</td></tr><tr><td>Controlador de presión</td><td>Fluigent</td><td>MFCS-FLEX-4C-1000</td><td></td></tr><tr><td>PEEK Tubing</td><td>Cluzeau Info. Labo, Francia</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viales de microfluidics (Tubos Micrew 0,5 ml y 1 ml)</td><td>VWR, Países Bajos</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3. Formación y posicionamiento del husillo reconstituyente</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td>Dextran-647 nm (Dextran, Alexa Fluor 647, 10,000 MW, Aniónico, Reparable)</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA - Albúmina sérica bovina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosa (D-(+)-Glucosa)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Glucosa-oxidasa (Glucosa oxidasa de Aspergillus niger)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6125</td><td></td></tr><tr><td>DTT (DL-ditioletol)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>646563</td><td></td></tr><tr><td>Catalasa (Forma catalasa hígado bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9322</td><td></td></tr><tr><td>Tubulina (Tubulina del cerebro bovino)</td><td>Citoesqueleto Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubulina-488/561 (HiLyte-488/Tubulina marcada con rodamina del cerebro porcino)</td><td>Cytoskeleton Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GTP (Guanosina-'5-trifosfato, hidrato de sal de sodio)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>51120</td><td></td></tr><tr><td>&kappa;-caseína (&kappa;-caseína de leche de suero bovino)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C0406</td><td></td></tr><tr><td>Airfuge (ultracentrífuga accionada por aire)</td><td>Beckman-Coulter</td><td>CLS</td><td></td></tr><<tr><td>strong>4. Introducción a los factores de ensamblaje del husillo</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><fuerte>Nombre</fuerte></td><td><fuerte>Empresa</fuerte></td><td><fuerte>Número de catálogo</fuerte></td><td><fuerte>Comentarios</fuerte></td></tr><tr><td>Neutravidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2666</td><td></td></tr><tr><td>ATP (Adenosina-'5-trifosfato, hidrato de sal disódica)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td></td></tr><tr><td>PEP (Ácido fosfo(enol)pirúvico, sal monosódica, hidrato &ge; 97% (enzimático))</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0564</td><td></td></tr><tr><td>PK/LDH -(Piruvato quinasa/enzimas lácticas deshidrogenasa del músculo de conejo)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0294</td><td></td></tr></tbody></table>

la reconstitución de básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Reconstitution of Basic Mitotic Spindles in Spherical Emulsion Droplets

El ensamblaje, posicionamiento y orientación del huso mitótico dependen de las fuerzas combinadas generadas por la dinámica de los microtúbulos, las proteínas motoras de los microtúbulos y los reticulantes. Los microtúbulos en crecimiento pueden generar fuerzas de empuje, mientras que los microtúbulos de despolimerización pueden convertir la energía de la contracción de los microtúbulos en fuerzas de tracción, cuando se unen, por ejemplo, a la dineína cortical o a los cromosomas. Además, las proteínas motoras y los reticulantes difusibles dentro del huso contribuyen a la arquitectura del huso conectando y deslizando microtúbulos antiparalelos. In vivo, ha resultado difícil desentrañar la contribución relativa de los actores individuales al equilibrio general de fuerzas. Aquí presentamos los métodos que hemos desarrollado recientemente en nuestros esfuerzos por reconstituir los husos mitóticos básicos de abajo hacia arriba in vitro. Mediante técnicas microfluídicas, los centrosomas y la tubulina se encapsulan en gotas de emulsión de agua en aceite, lo que da lugar a la formación de ásteres de microtúbulos confinados geométricamente (dobles). Mediante la introducción adicional de dineína anclada corticalmente, motores de microtúbulos dirigidos en el extremo positivo y reticulantes difusibles, este sistema se utiliza para reconstituir estructuras similares a husos. Los métodos presentados aquí proporcionan un punto de partida para la reconstitución de husos mitóticos más completos, lo que permite un estudio detallado de la contribución de cada componente individual y obtener una visión cuantitativa integrada del equilibrio de fuerzas dentro del huso mitótico.

Los métodos presentados en las secciones anteriores permiten la reconstitución de las estructuras de huso como con el aumento de la complejidad mediante el confinamiento geométrico de gotitas de la emulsión de agua-en-aceite. Esta sección describe los resultados representativos que muestran cualitativamente la capacidad de estos ensayos. Durante la mitosis, cuando el huso bipolar está montado, las células completan para formar esferas con un diámetro de aproximadamente 15 micras, medido para las células humanas. Esta forma de la célula mitótica característica proporciona un límite geométrico que tanto restringe y dirige tamaño husillo y orientación 35,36. Técnicas de microfluídica, proporcionan un nivel de confinamiento geométrica que se asemeja con precisión la situación observada en las células vivas y por lo tanto permite la reconstrucción de abajo hacia arriba de husos mitóticos in vitro. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; ásteres de microtúbulos son por sí mismos ya capaces de comportamientos complejos cuando el crecimiento de los microtúbulos está restringido por los límites geométricos. A medida que crecen los microtúbulos, fuerzas de empuje generadas por la incorporación de nuevos dímeros de tubulina en coche los dos centrosomas a los lados de las gotitas de emulsión opuestas. Al principio, los centrosomas se difunden libremente en el volumen confinado (Figura 4A, panel izquierdo). Después de aproximadamente 20 a 30 min, los primeros microtúbulos se convierten difusión visible y centrosoma se restringe como microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones. Ásteres con los microtúbulos de longitud intermedia (aproximadamente el 50% del diámetro de gota) puede (estéricamente) se repelen entre sí, con los microtúbulos que empujan uno contra el otro, los otros centrosomas y la corteza. Esto se traduce en un típico &#39;bipolar&#39; disposición de tipo huso con los dos centrosomas opuestos entre sí (Figura 4a, panel central). Cuando microtúbulos crecen más de ~ 50% de la gotita-diametro, los centrosomas conseguir empujado más a los límites opuestos de la gota, con los microtúbulos crecen a lo largo de la corteza de gotas (Figura 4A, panel derecho). Es importante señalar que las tasas de crecimiento de los microtúbulos en estos ensayos son muy sensibles a la temperatura y la tubulina concentraciones. Por consiguiente, estos parámetros afectarán fuerte en el momento en el que se observa primero la nucleación y cuando se alcanzan posiciones aster de estado estable. En las células, fuerzas de tracción corticales se generan a través de la formación de los accesorios de carga entre los microtúbulos más los fines de dineína y la corteza asociada. En las células animales, esta asociación depende del complejo Gαi / LGN / NuMA, que se dirige a la membrana plasmática a través de miristoilación N-terminal de Gαi 1. En estos ensayos de reconstitución, el requisito del complejo Gαi / LGN / NuMA se omite acoplando directamente dineína a los lípidos biotinilados a través de laformación de complejos de biotina-estreptavidina-biotina. Estos enlaces son relativamente estables (K D ~ 10 -14 M) 37 y forman rápidamente (generalmente dentro de 10 min después de la formación de gotitas de emulsión, antes de la nucleación de los microtúbulos se hace evidente) (Figura 4b). En presencia de dineína cortical, centrosomas típicamente retienen una posición más central, mientras que en ausencia de dineína, centrosomas son empujados a los lados opuestos de la corteza de gotas (Figura 4c). Estamos razón de esto es el resultado de dos efectos, que prevenir y contrarrestar las fuerzas de empuje de los microtúbulos. (1) La dineína promueve directamente catástrofes microtúbulos, restringiendo así la longitud de los microtúbulos y prevenir el pandeo de los microtúbulos excesiva, y (2) fuerzas de tracción corticales conducir a las fuerzas de centrado netas en los ásteres individuales 8, que contrarrestan las fuerzas de repulsión-aster aster. El difusible reticulante ASE1 induce fOrcés que tienden a aumentar la zona de solapamiento de los microtúbulos antiparalelos 29. Consistente con esto, en presencia de ASE1 (y ausencia de dineína) centrosomas se encuentran muy juntos con ASE1 localizar a los microtúbulos incluido interpolares (Figura 4D). Los miembros de la familia kinesin-5 coche la separación del centrosoma, proporcionando fuerzas de empuje desde dentro del husillo (véase la introducción). En presencia de Cut7 (el S. pombe kinesin-5 ortholog), centrosomas son empujados a lados opuestos de las gotitas de la emulsión, incluso en presencia de ASE1 (Figura 4e). Mediante la combinación de generadores corticales e inter-polares de fuerza, el nivel de complejidad puede incrementarse aún más en estos experimentos, llevando eventualmente a una comprensión global del conjunto de huso mitótico bipolar. Una descripción cuantitativa detallada de estos resultados estarán disponibles en el futuro (Roth et al., Manuscrito en preparación). <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; Además de observar la posición de los centrosomas en momentos fijos en el tiempo, y su comportamiento en relación a las longitudes observadas de los microtúbulos, valiosa información puede obtenerse siguiendo el proceso de posicionamiento sobre hora. Mediante la reducción de los tiempos de exposición y la intensidad de láser, ahora es posible seguir posicionamiento aster a intervalos de 2 min durante al menos 1 h con blanqueo solamente ~ 30%. Esto permite la monitorización de reunión aster y el posicionamiento de los centrosomas se difunden libremente (0 min.) A través centralizado (12 min.) Para áster descentralizados (36 min y aún más) (Figura 5c). Esto facilita el estudio de la conducta, tanto en estado estacionario y la cinética de ensamblaje del huso. Mediante la combinación de gotas con diferentes contenidos en la misma muestra, es, por ejemplo, posible comparar directamente de posicionamiento y montaje del husillo cinética centrosoma en gotitas con y sin generadores de fuerza corticales (Figura 5b). Figura 1: fuerzas que actúan sobre el huso mitótico Varias moléculas de generación de fuerza actúan sobre los microtúbulos del huso mitótico para promover la formación del huso y posicionamiento.. Los microtúbulos que crecen en la corteza de células generan una fuerza de empuje sobre el centrosoma. dineína cortical (púrpura) captura los microtúbulos depolymerizing y genera una fuerza de tracción sobre los centrosomas. Dentro del husillo, Kinesin-5 proteínas motoras / Cut7 proporcionan una fuerza de deslizamiento hacia el exterior sobre los microtúbulos antiparalelos, mientras que agentes de reticulación de la familia PRC1 / ASE1 generan un opuestas hacia afuera fuerza de deslizamiento. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig1large.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura .</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig2.jpg" /> Figura 2:. Microfluidos de diseño de chips (A) Diseño de fotomáscara 4 pulgadas que contiene 4 chips de microfluidos. (B) la representación detallada de un solo chip. Fichas contienen un solo canal de salida y tres canales de entrada, seguido de un polvo de filtro. canal de entrada 1 contiene la fase acuosa, el canal 2 del lípido / aceite de fase y el canal 3 puede ser usado para diluir las gotitas formadas con / aceite-fase lipídica adicional. (C) Representación detallada de la unión donde el / la fase de aceite de lípidos (que viene de la parte superior e inferior) se reúne con la fase acuosa (que viene de la izquierda). En el cruce, las gotas se forman y fluyen hacia el canal de salida a la derecha. (D) la representación detallada de un polvo de filtro con 2 micras canales. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig3.jpg" /> Figura 3:. Metodología para la Formación de agua-en-aceite de emulsión de gotas (A) chip microfluídico y el tubo de la microfluídica en un microscopio de campo brillante. Tanto los tubos el agua y de la fase de aceite de lípidos / están conectados a las entradas de chip 1 y 2 respectivamente. (B) Restricción de chip de microfluidos en el que el agua y los lípidos / aceite-fases se encuentran. Al cambiar las presiones, las gotas de tamaño puede ser controlada. (C) Diseño de las células de flujo recubiertas con PDMS. Después de cargar las gotas en la celda de flujo, los extremos abiertos se cierran con valap adicional. (D) Esquema de la formación de gotas. Las gotitas se utilizan para encapsular los centrosomas, tubulina y componentes adicionales requeridos para la formación del huso mitótico. (E) Esquema de la focalización cortical-dineína. Biotina (Bio) dineína está dirigido a los lípidos a través de biotina estreptavidina (GECT). <ahref = &quot;https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig3large.jpg&quot; target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig4.jpg" /> Figura 4:. Los resultados representativos de huso Reconstituciones con complejidad creciente (A) proyecciones de máxima intensidad de gotitas que contienen dos centrosomas que muestran ejemplos de los microtúbulos cortos, intermedios y largos. Centrosomas y los microtúbulos se visualizaron mediante la adición de 10% HiLyte-488 marcado con la tubulina. Barras de escala = 10 m. (B) La localización de GFP-biotina-dineína-TMR en ausencia (-, izquierda) y presencia (+, derecha) de estreptavidina (GECT). Posicionamiento (C) de microtúbulos aster en ausencia (-, izquierda) o presencia (+, derecha) de cortical GFP-biotina-dineína-TMR. (D) aster microtúbulos (panel izquierdo, green) posicionamiento en presencia de ASE1 (panel central, de color rojo). (E) de microtúbulos aster (panel izquierdo, verde) de posicionamiento en presencia de ASE1 y Cut7 (kinesin-5) (panel central, de color rojo). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54278/54278fig5.jpg" /> Figura 5: Imaging Aster de Posicionamiento Dinámico in vitro (A) Diseño de una taza de PDMS que permite obtener imágenes de gotitas de hasta varias horas.. (B) Generación, almacenamiento y obtención de imágenes de gotitas (transmitida) que contiene diferentes contenidos, ilustrados por la ausencia (izquierda) inclusión (derecha) de dextrano fluorescente (Alexa 647). (C) imágenes planas individuales de una 60 minutos de lapso de tiempo (intervalos de 2 min) tomada de una pila Z (2 micras distancias) del anuncioroplet que contiene un solo centrosoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54278/54278fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

El ensamblaje y posicionamiento del huso mitótico dependen de las fuerzas combinadas generadas por la dinámica de los microtúbulos, las proteínas motoras y los reticulantes. Aquí presentamos nuestros métodos recientemente desarrollados en los que el confinamiento geométrico de gotas de emulsión esférica se utiliza para la reconstitución ascendente de husos mitóticos básicos.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

Mitotic spindle assembly, positioning and orientation depend on the combined forces generated by microtubule dynamics, microtubule motor proteins and ...

El objetivo general de este procedimiento es reconstruir estructuras similares al huso mitótico dentro del confinamiento geométrico de gotas de emulsión de agua en aceite. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del ensamblaje del huso mitótico, como cómo se posicionan y ensamblan los husos, y cuál es la contribución específica de los componentes individuales a estos procesos. La principal ventaja de esta técnica es que utilizamos un enfoque de abajo hacia arriba para reconstruir estructuras similares al huso dentro de un confinamiento geométrico que imita la forma de una célula mitótica.Este método también puede utilizarse para estudiar otros procesos que dependen del confinamiento celular. Mezcle 10 partes de prepolímero de PDMS con una parte de agente de curado en una masa total de aproximadamente 40 gramos. Luego, coloque la mezcla en una cámara de vacío durante unos 30 minutos para eliminar las burbujas de aire.Mientras tanto, envuelva el molde con papel de aluminio para crear una copa de un centímetro de profundidad y cuatro pulgadas de diámetro. Cuando esté listo, vierta aproximadamente 3/4 de la mezcla de PDMS en el molde. Luego, devuelva el PDMS a una cámara de vacío durante otros 30 minutos.Después del desgasificado, cure el PDMS durante una hora a 100 grados Celsius. Mientras tanto, prepare algunos portaobjetos de vidrio para el recubrimiento por centrifugación eliminando el polvo con aire comprimido. A continuación, aplique por centrifugación la mezcla restante de PDMS sobre los portaobjetos.Cure estos portaobjetos durante una hora a 100 grados Celsius para endurecer el PDMS. A continuación, retire suavemente el PDMS utilizando una cuchilla de afeitar y haga los orificios necesarios en las tiras de PDMS para fabricar los chips microfluídicos. Ahora, trate con corona el chip microfluídico y un portaobjetos de vidrio recubierto de PDMS durante unos segundos.Finalmente, coloque un chip microfluídico sobre cada portaobjetos con los canales hacia abajo y hornee los chips durante toda la noche a 100 grados Celsius. Primero, utilizando material de vidrio lavado con cloroformo, prepare aproximadamente 250 microgramos de lípidos disueltos en cloroformo. Seque cuidadosamente la mezcla lipídica con gas inerte.Luego, colóquelo en una cámara de vacío durante una hora. A continuación, disuelva los lípidos en aceite mineral y 2.5% surfactante hasta 0.5 miligramos por mililitro, lo que equivale a aproximadamente 500 microlitros. Para disolver completamente los lípidos, someta la mezcla a sonicación durante 30 minutos a 40 kilohercios.A continuación, aplique recubrimiento de PDMS por centrifugado sobre cubreobjetos con un espesor que coincida con el objetivo del microscopio. Luego, aplique recubrimiento de PDMS por centrifugado sobre portaobjetos de vidrio. Ahora, cure los cubreobjetos y portaobjetos recubiertos con PDMS durante una hora a 100 grados Celsius.Luego, prepare las celdas de flujo colocando en estrecha proximidad finas tiras de película selladora de laboratorio sobre portaobjetos de vidrio recubiertos con PDMS. Coloque tiras de tres milímetros separadas aproximadamente dos milímetros entre sí. A continuación, cubra las celdas de flujo con una cubierta recubierta de PDMS y selle el conjunto derritiendo la película a 100 grados Celsius durante un minuto breve.Una vez calentado, presione suavemente la laminilla y séllela con Valap. A continuación, prepare una taza de PDMS para imágenes a largo plazo. Haga un orificio de cuatro milímetros de diámetro en una rebanada de PDMS de tres milímetros de espesor.Luego, trate con corona la rebanada de PDMS y un cubreobjetos recubierto de PDMS. Una vez tratados, colóquelos uno encima del otro y hornee el conjunto durante la noche a 100 grados Celsius. Observe la formación de gotas en un microscopio invertido de campo brillante.Conecte la fase oleosa de lípidos al controlador de presión y aumente la presión hasta que una gota de aceite salga del tubo capilar. Conecte el tubo capilar a la entrada dos del chip de microfluidos. Luego, llene completamente los chips de microfluidos con la fase oleosa de lípidos a través de la entrada dos.A continuación, introduzca la fase acuosa basada en MRB-80 desde la entrada uno. Controle el tamaño de las gotas ajustando las presiones de la fase oleosa lipídica y la fase acuosa para generar gotas con un diámetro de aproximadamente 15 micrones. Un buen punto de partida es alrededor de 800 milibares para la fase oleosa lipídica y 200 milibares para la fase acuosa.Después de obtener el tamaño de gota deseado, llene completamente la celda de flujo con gotas. Estas gotas se forman utilizando pequeños volúmenes de la fase acuosa. Esto significa que el sistema microfluídico debe funcionar rápidamente para no perder toda la fase acuosa antes de que se hayan formado gotas del tamaño correcto.Una vez llenado, cierre cuidadosamente los extremos de la celda de flujo utilizando Valap. Si las gotas no dejan de moverse, es posible que el sellado no esté completo o que se hayan introducido burbujas de aire. Para imágenes a largo plazo, transfiera las gotas a una copa de PDMS y cúbralas con una capa de mezcla de aceite y lípidos.Deshiele los centrosomas a temperatura ambiente y colóquelos a 37 grados Celsius durante 20 minutos para asegurar una adecuada nucleación de microtúbulos. Mientras tanto, prepare la mezcla de ensayo sobre hielo. Esta debe contener tubulina, GTP, un sistema eliminador de oxígeno, generadores de fuerza molecular como entrecruzadores de microtúbulos, ATP y un sistema regenerador de ATP.Una vez mezclado, centrifugar la muestra en el rotor enfriado del Airfuge a 30 psi durante tres minutos. Luego, añadir los centrosomas precalentados a la mezcla. Optimizar la cantidad de centrosomas añadida para obtener uno o dos centrosomas por gota.Luego, utilice esta mezcla para producir gotas de emulsión como se describió anteriormente. Con el fin de reclutar dineína a lípidos biotinilados en la corteza de las gotas, incluya GFP-dineína TMR y estreptavidina en la fase acuosa. En un microscopio confocal de disco giratorio, visualice el crecimiento de microtúbulos tras 30 minutos a 26 grados Celsius.Durante la adquisición de imágenes, el crecimiento de los microtúbulos puede promoverse aumentando la temperatura a 28 o incluso 30 grados Celsius. Para las proyecciones en Z, adquiera series con intervalos de un micrómetro, lo que debería requerir aproximadamente 20 imágenes por gota. Vaya al panel principal de la cámara, haga clic en Editar Z y establezca el paso Z en 1,0.Haga clic en Siguiente para guardar la configuración. A continuación, establezca la ganancia EM lineal máxima haciendo clic en la pestaña Cámara en el panel de Adquisición y deslizando la barra de Ganancia EM hasta 300. Luego, establezca el Tiempo de Exposición en 200 milisegundos en la misma pestaña.Haga clic en Grabar para almacenar la configuración. Para experimentos de imagen en vivo, realice proyecciones en Z cada dos minutos durante dos horas, reduciendo los tiempos de exposición a aproximadamente 100 milisegundos y aumentando los intervalos en Z a dos micrones. Para experimentos de imagen en vivo, utilice una copa de PDMS en lugar de una celda de flujo convencional para lograr la inmovilización máxima de la muestra.Utilizando los protocolos descritos, se estudió la formación de astros en gotas de emulsión de agua y aceite que contienen centrosomas. Inicialmente, los centrosomas difunden libremente dentro de los volúmenes confinados. Después de aproximadamente 20 a 30 minutos, se vuelven visibles los primeros microtúbulos, y la difusión de los centrosomas se vuelve restringida a medida que los microtúbulos crecen contra la corteza en todas las direcciones.Cuando los microtúbulos crecen más de la mitad del diámetro de la gota, los centrosomas son empujados hacia bordes opuestos, con microtúbulos creciendo a lo largo de la corteza de la gota. Sin estreptavidina, la dineína se encuentra difusa dentro de la gota. Sin embargo, con estreptavidina, aproximadamente 10 minutos después de la formación de la gota, la dineína se une a los lípidos biotinilados.Al observar la tubulina fluorescente en presencia de dineína cortical, es evidente que los centrosomas están posicionados centralmente. En cambio, en ausencia de dineína, los centrosomas son empujados hacia lados opuestos de la gota. Esto probablemente se debe a que la dineína promueve las catástrofes de microtúbulos y las fuerzas de tracción cortical, lo que resulta en el centrado de las estrellas de microtúbulos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo utilizar tecnologías de microfluídica para crear estructuras similares a husos en gotas esféricas de emulsión. Una vez dominadas, la formación de gotas y la obtención de imágenes pueden completarse en dos o tres horas si se realizan adecuadamente. Mediante este procedimiento, se pueden encapsular otros factores de ensamblaje del huso para estudiar su efecto sobre la morfología y la posición del huso.Siempre se deben tomar precauciones, como el uso de guantes, al manipular cloroformo o PDMS.

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Investigación

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Biology

Biología

Este video describe la técnica de estudio del ensamblaje de la proteína septina en microesferas recubiertas con bicapas lipídicas. Esta técnica ayuda a comprender los ensamblajes dependientes de la curvatura de las proteínas en superficies curvas.

Ensayo de bicapa lipídica soportada esférica: una técnica para observar el ensamblaje de septinas en microesferas

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

El presente trabajo describe un método para fabricar nanocristales micelar, una clase emergente importante de nanobiomaterials. Este método combina electrospray de arriba hacia abajo, de abajo hacia arriba uno mismo-Asamblea y el control de la estructura de base de solvente. El método de fabricación es en gran medida continuo, puede producir productos de alta calidad y posee un medio barato de control de la estructura.

Fabricación de nanocristales micelar esférica y en forma de gusano combinando Electrospray, uno mismo-Asamblea y Control de la estructura de base solvente

Se presenta un método para la generación de en vitro autosostenido mitotic las oscilaciones en el nivel unicelular encapsulando extractos de huevos de Xenopus laevis en microemulsiones agua en aceite.

Reconstitución de las oscilaciones del ciclo celular en microemulsiones de extractos de huevo libre de Xenopus

Los ensayos de gotas de agua en aceite son útiles para la química analítica, la evolución enzimática y el análisis de células individuales, pero generalmente requieren microfluídica para formar las gotas. Aquí, describimos la emulsificación con plantilla de partículas, un enfoque libre de microfluídica para realizar ensayos de gotas.

La emulsificación con plantilla de partículas permite ensayos de gotas sin microfluídica

Aquí, presentamos un protocolo detallado para la reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados en proteoliposomas definidos.

Reconstitución de la actividad de extracción de Msp1 con componentes totalmente purificados

Aquí, se presenta un ensayo de reconstitución in vitro basado en microscopía TIRF para cuantificar y comparar simultáneamente la dinámica de dos poblaciones de microtúbulos. Se describe un método para ver simultáneamente la actividad colectiva de múltiples proteínas asociadas a microtúbulos en haces de microtúbulos reticulados y microtúbulos individuales.

Visualización simultánea de la dinámica de microtúbulos reticulados y únicos in vitro mediante microscopía TIRF

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

La reconstitución libre de células ha sido una herramienta clave para comprender el ensamblaje del citoesqueleto, y el trabajo en la última década ha establecido enfoques para estudiar la dinámica de la septina en sistemas mínimos. Aquí se presentan tres métodos complementarios para observar el ensamblaje de la septina en diferentes contextos de membrana: bicapas planas, soportes esféricos y soportes de varilla.

Reconstitución del ensamblaje de septina en membranas para estudiar propiedades y funciones biofísicas

Este protocolo proporciona un marco experimental para documentar el impacto físico del citoesqueleto en la forma nuclear y los orgánulos internos sin membrana en el sistema de ovocitos de ratón. El marco se puede adaptar para su uso en otros tipos de células y contextos.

Captura de la agitación basada en el citoesqueleto del núcleo del ovocito de ratón a través de escalas espaciales

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Aprende a reconstituir haces mitóticos en gotitas de emulsión agua-aceite usando microfluidos y microscopía confocal. Este método bottom-up permite estudiar la dinámica de microtúbulos y el posicionamiento de centrómeros en confinamiento geométrico.

La reconstitución de Básica mitótico husos esféricos en emulsión de las gotitas

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