Name: Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 43 s
Description: Aprende a preparar vesículas gigantes encapsulando microesferas mediante centrifugación de emulsión agua-en-aceite. Este método eficaz utiliza DOPC y Texas Red DHPE para crear modelos celulares artificiales en biología sintética.

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Agradecemos a Tomoko Yamaguchi para dibujar la imagen esquemática en la figura 1. Este estudio fue apoyado por el Proyecto ORION Okazaki del Instituto Okazaki Integral de Biociencia de theNational Institutos de Ciencias Naturales (NINS); por el Centro de proyectos de Astrobiología (sin AB281010.) de NIÑS; por una subvención-en-Ayudas a la Investigación Científica en áreas innovadoras (ordenamiento dinámico de sistemas biomoleculares para la creación de funciones integradas) de la Sociedad Japonesa para la Promoción de la Ciencia (JSP) (sin 25.102.008.); por una subvención-en-Ayudas para jóvenes científicos (B) (a KK, sin 15K17850.) de JSP; andby una subvención-en-Ayudas a la Investigación Actividad de puesta en marcha (a YN,. sin 15H06653) de JSP. El apoyo adicional fue proporcionada por una subvención del Instituto Noguchi, una beca de la Fundación Kao de las Artes y las Ciencias, y una beca de la Fundación Agua y Medio Ambiente Kurita.

1. Preparación de GVs por la emulsión W / O La centrifugación Método <ol><li> Preparar una solución madre de 1,2-dioleoyl- sn -glicero-3-fosfocolina (DOPC, 25 mM) y una solución madre de Rojo Texas 1,2-dihexadecanoyl- sn -glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamonio (Texas Red DHPE, 0,20 mM) en cloroformo y almacenar las soluciones madre a -20 ° C. </li><li> Preparar una solución de aceite. <ol><li> Formar una película de lípidos en la superficie interior de un vial de vidrio de 5 ml por evaporación de una mezcla de la solución de stock DOPC (51,0 l y la solución madre de Rojo Texas DHPE (19,2 l) bajo un flujo de gas nitrógeno. </li><li> Incubar la película bajo presión reducida durante la noche y a continuación, añadir 1,0 ml de parafina líquida (0,86-0,89 g / cm 3) al vial. Envolver el vial en papel de aluminio y se incuba a 80 ° es CO / N en reposo. Las concentraciones finales de DOPC y Texas Red DHPE son 1,3 y 3,8 x 10-3 mM, Respectivamente, y la DOPC: relación molar Texas Red DHPE es 100: 0,3. </li></ol></li><li> Preparar la dispersión acuosa interna. <ol><li> En un microtubo con tapa 1,5 ml, mezclar 237,5 l de una dispersión de 1,0 micras microesferas no fluorescentes (2,5 vol%) y 12,5 l de una dispersión de 1,0 micras microesferas fluorescentes (2,5 vol%); esto corresponde a una relación 95: (v / v) 5 de no fluorescente a microesferas fluorescentes. </li><li> Añadir 64 mg de sacarosa, seguido de 125 l de solución tamponada con Tris (TBS, 1 M) y 875 l de agua desionizada. La fracción de volumen final de microesferas es de 0,5% en volumen, y las concentraciones finales de Tris-HCl (pH 7,5) y la sacarosa son 0,1 y 0,15 M, respectivamente. </li><li> Vortex microtubo durante 30 segundos, y después sonicar durante 10 min. </li></ol></li><li> Preparar la solución acuosa externa. <ol><li> Después de la preparación de 10 ml de una solución tamponada con Tris (M Tris-HCl 0,1 [pH 7,5], 0,15 M glucOSE) en el mismo procedimiento que los medios de comunicación acuosa interna, colocar 1 ml de la solución en un microtubo de 1,5 ml con tapa. Vortex microtubo durante 30 segundos, y después sonicar durante 10 min. </li></ol></li><li> Preparar emulsión agua / aceite que contiene microesferas. <ol><li> Mezclar 1 ml de la solución de aceite (aceite de parafina que contiene DOPC y Texas Red DHPE) con 300 l de la solución acuosa interna en un microtubo de 1,5 ml. </li><li> Emulsionar los dos componentes en el microtubo mediante el uso de un homogeneizador mecánico (un agitador con paletas que giran a alta velocidad) operado a 10.000 rpm durante 2 min a TA. </li></ol></li><li> Precipitar los Planos generales. <ol><li> capa suavemente 300 l de la emulsión w / o en la superficie superior de 1 ml de la solución acuosa externa a 4 ° C en un microtubo de 1,5 ml con tapa. Enfriar el microtubo durante 10 min a 4 ° C. </li></ol></li><li> Recoge los Planos generales. <ol><li> Inmediatamente después de la refrigeración del microtubo,Centrifugar a 18.000 x g durante 30 min. Obtener las GVs precipitados por la perforación de la parte inferior del microtubo con un marcador y la recolección de una gotita en una esterilizada 1,5 ml microtubo. </li><li> Diluir la GV precipitado gotita de 10 a 100 veces en volumen con la solución acuosa externa si se obtienen los GVs obtenidos en cantidades lo suficientemente grandes como para hacer la observación difícil. </li></ol></li></ol> 2. Microscopía Observación de GVs <ol><li> Preparar la muestra de microscopía. <ol><li> Colocar una cámara de incubación adhesivo para reacción en cadena de la polimerasa in situ y la hibridación (tamaño de la cámara 9 mm x 9 mm x 0,3 mm de espesor) en la parte superior de una cubierta de vidrio de microscopio. </li><li> Usando una micropipeta, depósito de 25 l de la diluido precipitaron Planos generales sobre la superficie de la muestra e inmediatamente colocar otra tapa de vidrio (aproximadamente 0,15 mm de grosor) en la parte superior de la cámara de incubación. </li></ol></li><li> Record contras de interferencia diferencialt imágenes de microscopía de los Planos generales. <ol><li> Imágenes de microscopía registro de las vesículas con un microscopio (10X, 20X, 40X y objetivos) equipado con una lámpara halógena 12V100WHAL-L. </li></ol></li><li> Llevar a cabo observaciones con el microscopio de fluorescencia. <ol><li> Insertar unidades de espejo de fluorescencia T-FBNA y U-FMCHE en el microscopio. Montar las unidades con filtros de 470-495 nm y 565-585 nm de excitación, respectivamente, y con filtros de emisión que transmiten 510-550 nm y 600-690 nm de luz, respectivamente. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

<html> Los pesos específicos del medio de dispersión acuosa interna y la solución acuosa externa deben ser elegidos cuidadosamente. Para la emulsión w / o para precipitar en la solución acuosa externa durante la centrifugación, la gravedad específica del medio de dispersión acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa. Tratamos de preparar Planos generales que utilizan soluciones de interior y exterior, sin azúcares, pero que no ha obtenido Planos generales en estas condiciones, ya que la solución acuosa interna no tiene suficiente masa para cruzar la interferencia entre las dos fases. Si hay una gran diferencia de presión osmótica entre las dos soluciones, GVs que precipitan en la solución acuosa externa puede encogerse o ruptura. Por lo tanto, la presión osmótica dentro y fuera de los Planos generales deben ser iguales. Para lograr esto, se utilizó sacarosa como un soluto en la dispersión acuosa interna y la glucosa como un soluto en la solución acuosa externa; ambos azúcares estaban en la misma concentración. tanto la salss = &quot;xref&quot;&gt; 22 y el azúcar 23, 35, 38 se han utilizado para estos fines, pero el azúcar se emplea generalmente porque es menos tóxico y más soluble que la sal. Sin embargo, si se añade un exceso de azúcar, los GVs pueden entrar en contacto con la parte inferior de la cubierta de vidrio y el colapso. Hay varias estrategias para evitar esto. Una estrategia es reducir la diferencia de gravedad específica entre las soluciones acuosas interna y externa de modo que las GVs precipitan en condiciones suaves; En concreto, el sobrenadante de la dispersión GV precipitado puede ser intercambiada con una solución que es idéntica a la solución acuosa interna para reducir la posibilidad de ruptura vesicular por adhesión a la cubierta de vidrio, como resultado de la flotabilidad. Otra estrategia consiste en pre-recubrimiento tanto de cubiertas de vidrio con una película delgada de lípidos 29. La preparación adecuada y la incubación de la emulsión seimportante. Se utilizó parafina líquida para preparar la solución de aceite. De aceite 26, 31, dodecano 21, 33, 33 y escualeno mineral, 39 también se utilizan a menudo como aceites disolventes. Debido a que estos materiales varían en gravedad específica, la viscosidad y la tensión superficial, diferentes números de vesículas se forman incluso cuando se utilizan las mismas condiciones de centrifugación 33. Para obtener las vesículas con las propiedades del objetivo, es esencial para optimizar las gravedades y viscosidades de las soluciones acuosas interna y externa específicos, así como la preparación acceleration.For centrífuga de la fase de aceite, la incubación debe ocurrir a alta temperatura y en un lugar seco medio ambiente, como una incubadora o un deshidratador. En este estudio, hemos calentado el aceite de parafina a 80 ° C para disolver completamente el lípido molecules.In Además, la emulsión debeestar preparado sólo cuando sea necesario y debe ser sometido inmediatamente a centrifugación, ya que es inestable justo después de que se prepara y la w / o gotas se funden fácilmente entre sí. La emulsión se puede preparar en grandes cantidades por sonicación, agitación en vórtex, o tapping. Sin embargo, usando un homogeneizador permite la rápida preparación de grandes cantidades de emulsión y más fácil emulsificación en aceite con una alta viscosidad. También es importante que la emulsión se capas en la solución acuosa externa suavemente y rápidamente y después se enfrió a 4 ° C. Para acortar el tiempo entre la emulsificación y la centrifugación, el sistema de solución acuosa de aceite exterior se puede preenfriar antes de la emulsión se acoda en él, y todo el sistema puede entonces centrifugarse immediately.If la turbidez blanca aparece más rápido o más lento de lo normal, el mecánico homogeneizador debe enjuagarse a fondo para eliminar los detergentes de limpieza. Además, antes de la emulsificación, la solución de aceite, solución acuosa interna, y el emulsionante debe ser returned a temperatura ambiente. aceleración centrífuga adecuada también es importante. Por centrifugación a 18.000 x g, hemos sido capaces de preparar Planos generales con un único material interior encapsulado en una alta concentración. Cuando se requiere la encapsulación de múltiples materiales, es mejor reducir la aceleración centrífuga. Por ejemplo, se consiguió un sistema de montaje de actina encapsular siete compuestos con centrifugación a menos de 350 x g 35. En los casos en los que la centrifugación no es deseable, GVs se puede obtener mediante el ajuste de la concentración de azúcar o por precipitación de la emulsión bajo la influencia de su propia masa 38, 40, 41. El método descrito en este documento tiene dos limitaciones importantes. Una de ellas es que las moléculas de aceite de parafina, (en este caso) pueden ser solubilizados en la membrana GV, como ha sido señalado por la Weitgrupo Z 21. Cuando se desea la inserción de una proteína de membrana en la membrana GV, se deben considerar los efectos de las moléculas de aceite co-existentes en la proteína. La otra limitación es la variación de la fracción de volumen. En este estudio, se estimó que las fracciones en volumen de microesferas en los Planos generales oscilaron entre 4-30% en volumen; las fracciones en volumen no fueron idénticas a la fracción de volumen de la solución acuosa interna utilizada para la preparación GV. Aunque hemos sido capaces de encapsular microesferas en las GVs en una fracción de volumen lo suficientemente alto como para la observación de microscopía, este método no es adecuado para la preparación de GVs con una distribución uniforme fracción de volumen. Se ha informado de que la distribución de fracciones de volumen de microesferas cambia durante la centrifugación 34. El método de centrifugación emulsión w / o se utiliza comúnmente para la formación de GVs que contienen materiales encapsulados. Sin embargo, algunos informes han descrito la preparación de los Planos generales que encapsulan materiales microescala 34, 42. Recientemente, robots moleculares que contienen un dispositivo de ADN encapsulado o un dispositivo molecular se han construido 43, 44. Planos generales con compartimentos son la primera opción para este tipo de aplicaciones; por lo tanto, las técnicas, tales como el nuestro, que podrían utilizarse para encapsular microesferas magnéticas y microesferas con diversa funcionalización de la superficie se puede esperar que sea útil 44.

<html> El enfoque de la biología constructiva, o sintético es una avenida fascinante para explorar la frontera entre la vida y la materia no viva. Debido a que la célula es la unidad mínima requerida para la vida tal como la entendemos en la actualidad que, varios investigadores han intentado construir células artificiales de productos químicos simples, bien entendidas de modo que los fenómenos que se producen dentro de tales células artificiales pueden ser estudiadas, con el objetivo final de la aclaración los orígenes de la vida y el estudio de las funciones fundamentales de las células vivas 1, 2, 3. En particular, las vesículas 4, que son microcompartments esféricas hechas de moléculas anfifílicas y pueden encapsular moléculas biológicas tales como proteínas 5, 6 y 7 de ADN, 8, 9,lass = &quot;xref&quot;&gt; 10, a menudo se han utilizado como modelos de las membranas biológicas. Las vesículas se pueden clasificar como pequeño (definida como que tiene un diámetro de &lt;100 nm), grandes (diámetro de &lt;1 m), o gigante (diámetro&gt; 1 m). vesículas gigantes (GVS) se han estudiado ampliamente, ya que son similares a las células que viven en el tamaño, la forma y la estructura. Debido al tamaño de GVs, cambios morfológicos en las membranas GV fácilmente se pueden observar en tiempo real en un microscopio óptico. Varios métodos para la preparación de GVs se ha informado de 11, incluyendo el método de hidratación 12, 13, el método de congelación-descongelación 14, el método electroformation 15, 16, y el método de dispositivo fluídico 17, 18. proteínas Sin embargo, encapsulación y otros macromolecules de GVS en altas concentraciones por medio de estos métodos es difícil. En particular, es extremadamente difícil para encapsular materiales biológicos en cantidad suficiente (20 a 30% en volumen) para imitar el entorno lleno de gente dentro de las células 19, 20. Planos generales para formar instantáneamente, Weitz y compañeros de trabajo estableció una emulsión agua-en-aceite método de centrifugación emulsión 21, 22 (W / O). Este método tiene cinco características importantes. En primer lugar, porque GVs preparados por este método tienen una baja lamelaridad 23, 24, sus membranas son tan delgadas que se pueden deformar fácilmente. GV deformación de la membrana inducida por FtsZ (una proteína de división celular bacteriana), tubulina, y otras macromoléculas se ha estudiado 25, 26, 27, 28, y se observó polyhe<html> Dron-como la deformación de las membranas GV inducidos por la encapsulación de microesferas 29, 30. En segundo lugar, las proteínas de membrana se pueden insertar en la membrana vesicular con este método, aunque con dificultad 31. Por ejemplo, el grupo Yomo utiliza este método para estudiar la síntesis in vitro y la actividad de formación de poros de la proteína de membrana α-hemolisina 32. En tercer lugar, es posible generar GVs asimétricos en la que los componentes lipídicos de los velos interior y exterior son diferentes 22. Por ejemplo, Whittenton et al. Planos generales asimétricas con lípidos catiónicos en la cara interna de encapsular polinucleótidos cargados negativamente, y con los lípidos neutros sobre la cara externa para disminuir la toxicidad y la captación celular no específica 33. En cuarto lugar, la fracción de la concentración y el volumen de las sustancias dentro de las GVs puede ser relativamente altos = &quot;xref&quot;&gt; 28, 34. En quinto lugar, múltiples tipos de materiales se pueden encapsular 35. Por ejemplo, Nishimura et al. encapsulado un sistema de transcripción-traducción in vitro en GVs y utilizado el sistema para expresar la proteína verde fluorescente (GFP) dentro de la GVs 36. Estas cinco características hacen w / o centrifugación emulsión de un método indispensable para la generación de Planos generales que imitan celulares. En trabajos anteriores, GVs generados por centrifugación se recogieron por medio de una jeringa equipada con una larga 16 G aguja de acero inoxidable que contiene algo de la solución acuosa final 22. En las manos de los técnicos sin experiencia, este método de recogida podría fácilmente dar lugar a la contaminación de la GV con un poco de aceite. En este estudio, hemos utilizado el protocolo de centrifugación emulsión w / o desarrollado por el grupo de Yomo 23, 37,en el que GVs precipitados se recogen a través de un orificio abierto en la parte inferior del tubo de centrífuga en la que se preparan. Preparamos GVs encapsulantes 1.0 micras microesferas, que son similares en tamaño a orgánulos intracelulares. El uso de microesferas nos permitió estimar su concentración mediante el cálculo de la fracción de volumen. Establecimiento de un método para la preparación de Planos generales en las que los materiales con una gran densidad es un paso importante para la creación de células artificiales. Para confirmar la utilidad de nuestro protocolo de varios tipos de materiales de interiores, también hemos demostrado que la GFP y una soluble en agua pequeña molécula fluorescente (uranina) podrían ser encapsulados en los GVs.

<table><tbody><tr><td><REACTIVOS > FUERTES:</fuerte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td>Molécula de membrana vesicular</td></tr><tr><td>Texas Red 1,2-dihexadecanoyl-sn-glicero-3-fosfoetanolamina, sal de trietilamonio (Texas Red DHPE)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T1395MP</td><td></td></tr><tr><td>1 M Tris-HCl (pH 7.5)</td><td>Nippon Gene Co.</td><td>318-90225</td><td>Solución tampón</td></tr><tr><td>D(+)-Glucosa</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>049-31165</td><td>Para solución de agua exterior</td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>196-00015</td><td>Para solución de agua interior</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato de poliperlas 1.0 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>08226-15</td><td>No fluorescente, 2R = 1.0 &micro; m</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato Fluoresbrite YG 1.0 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>15702-10</td><td>Fluorescente, 2R = 1.0 y micro; m</td></tr><tr><td>Microesferas de carboxilato YG de fluoresbrite 0,10 y micro; m</td><td>Polysciences</td><td>16662-10</td><td>Fluorescente, 2R = 0,10 &micro; m</td></tr><tr><td>Sal sódica fluoresceína (uranina)</td><td>Sigma Aldrich Japón</td><td>F6377-100G</td><td></td></tr><tr><td>GFP estándar (recombinante)</td><td>Vector Laboratories</td><td>MB-0752</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>EQUIPO:</fuerte> </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga 5427R</td><td>Eppendorf&nbsp;</td><td>5409000233</td><td>Rotor de centrífuga: FA-45-48-11</td></tr><tr><td>Physcotron</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-310EIII</td><td>Microhomogeneizador práctico</td></tr><tr><td>Eje del generador</td><td>Microtec Co.</td><td>NS-4 Accesorio de</td><td>homogeneizador</td></tr><tr><td>Cámaras de incubación Frame-Seal para in situ PCR e hibridación</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0201</td><td>Volumen de la cámara de hibridación: 25 &micro; L Tamaño de la cámara: 9 y veces; 9 y veces; </td></tr><tr><td>Cámaras de incubación Frame-Seal de 0,3 mm para PCR in situ PCR e hibridación</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>SLF0601</td><td>Volumen de la cámara de hibridación: 65 &micro; L&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; Tamaño de la cámara: 15 y veces; 15 y veces; </td></tr><tr><td>Pipeta Microman E</td><td>Gilson</td><td>FD10006</td> de 0,3 mm <td>para líquido viscoso. Medimos la parafina líquida usando esto.</td></tr><tr><td>Microscopio invertido</td><td>Olympus Co.</td><td>IX73</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de espejo</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FBNA Filtro de</td><td>excitación: 470 - 495 nm Filtro de emisión: 510 - 550 nm</td></tr><tr><td>Unidad de espejo</td><td>Olympus Co.</td><td>U-FMCHE Filtro de</td><td>excitación: 565 - 585 nm Filtro de emisión: 600 - 690 nm</td></tr></tbody></table>

preparación de vesículas gigantes encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

Preparation of Giant Vesicles Encapsulating Microspheres by Centrifugation of a Water-in-oil Emulsion

La biología constructiva y el enfoque de la biología sintética para crear vida artificial implican el montaje de abajo hacia arriba de los materiales biológicos o no biológicos. Tales enfoques han recibido considerable atención en la investigación en el límite entre la vida y la materia no viviente y se han utilizado para construir células artificiales durante las últimas dos décadas. En particular, Giant vesículas (GVs) a menudo se han utilizado como membranas de las células artificiales. En este trabajo se describe la preparación de microesferas que encapsulan Planos generales altamente empaquetadas como modelo de células que contienen biomoléculas altamente condensadas. Los GVs se prepararon por medio de un simple método de centrifugación emulsión de agua-en-aceite. Específicamente, un homogeneizador se utilizó para emulsionar una solución acuosa que contiene los materiales a encapsular y un aceite que contiene fosfolípidos disueltos, y la emulsión resultante se dispuso en capas cuidadosamente sobre la superficie de otra solución acuosa. A continuación, el sistema de capas se centrifugó to generar los Planos generales. Esta potente método fue utilizado para encapsular materiales que van desde moléculas pequeñas a microesferas.

El método de centrifugación emulsión w / o se ilustra fotográficamente y esquemáticamente en la Figura 1. La imagen esquemática en la figura 1 sugiere que el determinante más importante del éxito de este método es que la gravedad específica de la solución acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa, de modo que los GVs precipitarán durante la centrifugación. Además, la formación de una monocapa de lípido en la interfase W / O requiere que el sistema se enfrió durante 10 min después de la emulsión se coloca sobre la solución acuosa externa. Debido a que la forma GVs por transferencia de gotitas de la emulsión a través de la interfaz de w / o, las presiones osmóticas en las capas acuosas interna y externa deben ser los mismos. Como un experimento de control, se GVs también preparados que no contienen microesferas por medio del proceso que se muestra en la Figura 1 y el paso 1.3, excepto que la solución acuosa interna erapreparado sin microesferas. Colección de las GVs precipitados después de la centrifugación se muestra en la Figura 2. Además de la fase semitransparente en la parte inferior del microtubo, también se observó una fase intermedia blanco, turbio en el exterior solución acuosa (Figura 2a). Esta fase intermedia era rico en agregados de microesferas y el aceite, mientras que la fase inferior contenía los Planos generales. Por lo tanto, después de perforar el fondo del microtubo con un marcador (Figura 2b), se tomaron muestras de la primera gota (Figura 2c), que contenía grandes cantidades de Planos generales. Es importante asegurarse de que no más de dos gotas se recogen; las gotas adicionales pueden contener agregados de microesferas y lípidos, que se traducirá en una menor densidad de GVs. La dispersión vesicular obtenido menudo contenía materiales encapsulados fuera de los Planos generales porque los Planos generales often ruptura durante la centrifugación. Para obtener sólo GVs, un método de clasificación, tales como diálisis, filtración en gel, o fluorescencia de células activadas por la clasificación debe ser elegido, debido a los tamaños de los materiales de encapsulación. Si es necesario para la finalidad para la que los GVs precipitados se van a utilizar, se pueden diluir con la solución acuosa externa. En algunos casos, la fase intermedia extenderse a la parte inferior del tubo, lo que sugiere que cualquier vesículas que se formaron se mantienen unidas por el aceite. Se obtuvieron imágenes de microscopía de interferencia y de microscopía de fluorescencia diferenciales de las GVs sin microesferas (Figura 3a, 3b) y con microesferas (Figura 3c -3 f). De acuerdo con informes anteriores 23, 37, Planos generales con baja lamelaridad fueron formados por nuestro protocolo. Los lípidos conjugados con rojo Texas DHPE, que emite LUZ FLUORESCENTE rojoscencia, se utilizaron de manera que la formación de vesículas podría ser una confirmación directa con la visualización de la membrana delgada. De los 160 Planos generales que obtuvimos, 55 microesferas encapsuladas y 105 estaban vacías, dando una relación de encapsulación del 34%. Se determinó la fracción de volumen (φ, vol%) de microesferas en los GVs mediante el siguiente método. Debido a que cada GV contiene varios cientos de microesferas docenas, contando todas las microesferas con un microscopio óptico es un reto. Por lo tanto, mezclamos los no fluorescentes 1.0 micras microesferas con una pequeña cantidad de microesferas fluorescentes, que se contaron manualmente bajo el microscopio de fluorescencia. El número total (N) de microesferas encapsuladas se calculó multiplicando el número (n) de microesferas fluorescentes contadas manualmente por 20 (basado en el original 95: 5 [v / v] proporción de no fluorescente a microesferas fluorescentes). El valor de66; a continuación, se estimó como Nv 100 / V, donde V es el volumen de las microesferas y V es el volumen de la GV individual. Tenga en cuenta que la estimación de N a partir de n da lugar a errores de conteo, y estos errores se deben tomar en cuenta al calcular φ. El valor de φ se estimó a partir de N, que se calcula directamente como 20 n, y esto a su vez dio como resultado la probabilidad de que varphi representa con precisión el verdadero valor es &lt;50%. De hecho, N fluctúa en cierta medida, en torno a 20 n, por lo que debemos considerar como 20 (n ± i), donde i es el error n. Estimamos que con el fin de que una probabilidad de n ± i podría ser más del 50% obtenido sobre la base de una distribución de Poisson. Estimamos que, a su vez, nos permitió calcular 20 (n ± i) y los valores de66; que incluía contar errores para GVs con diámetros de 10 y 15 micras (Tabla 1). De acuerdo con este procedimiento, se estimó que la fracción de volumen de microesferas en el GV mostrados en la Figura 3c a ser 11 ± 3% en volumen. La precisión de la fracción de volumen calculado fue de 10 a 30%. Nuestros resultados indican que encapsulados con éxito 1 micras microesferas de GVS en una fracción de alto volumen. También hemos sido capaces de encapsular otros materiales en 100% en moles de DOPC Planos generales utilizando la misma solución acuosa exterior y el mismo protocolo (Figura 4). Específicamente, se prepararon GVs contengan 0,1 micras microesferas a partir de una solución tamponada con Tris que contiene 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 0,15 M de sacarosa, y 0,5% en volumen de microesferas fluorescentes mediante el protocolo descrito para GVs que contienen microesferas de 1,0 mm ( la Figura 4a). Siguiendo el protocolo descrito above, DOPC GVs que contiene GFP (0,1 M Tris-HCl [pH 7,5], 0,15 M de sacarosa, y 100 mg / ml GFP; Figura 4b) y GVs contienen uranina (M Tris-HCl 0,1 [pH 7,5], 0,15 M de sacarosa, y 30 mM uranina; también se prepararon Figura 4c). <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> norte </td><td> norte </td><td> φ (10-m de diámetro) </td><td> φ (15-m de diámetro) </td></tr><tr><td> 3 </td><td> 60 ± 20 </td><td> 6.0 ± 2.0 </td><td> 1,8 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 4 </td><td> 80 ± 20 </td><td> 8,0 ± 2,0 </td><td> 2,4 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 5 </td><td> 100 ± 20 </td><td> 10 ± 2 </td><td> 3,0 ± 0,6 </td></tr><tr><td> 6 </td><td> 120 ± 30 </td><td> 12 ± 4 </td><td> 3.6 ± 1.2 </td></tr><tr><td> 10 </td><td> 200 ± 32 </td><td> 20 ± 3 </td><td> 5.9 ± 0,9 </td></tr><tr><td> 20 </td><td> 400 ± 45 </td><td> 40 ± 5 </td><td> 12 ± 2 </td></tr><tr><td> 30 </td><td> 600 ± 55 </td><td> - </td><td> 18 ± 2 </td></tr><tr><td colspan="4"> unos errores se determinaron como se describe en el texto; n = número de microesferas contadas manualmente; N = número total de microesferas encapsuladas. </td></tr></tbody></table> Tabla 1: el número y volumen fracciones (φ, vol%) de microesferas a. unos errores se determinaron como se describe en el texto; n = número de microesferas contadas manualmente; N = número total de microesferas encapsuladas. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig1.jpg" /> Figura 1: Flujo de Ch<html> Esquema arte y pintura de emulsión W / O centrifugación Método. (A) Solución de Petróleo de hasta DOPC y Texas Red DHPE (proporción de 100: 0,3 molar) en parafina líquida. (B) dispersión acuosa interna que consiste en sacarosa y microesferas en un tampón de Tris-HCl. (C) la solución acuosa externa que consiste en glucosa en tampón Tris-HCl. (D) mezcla de 1 ml de solución de aceite y 300 l de dispersión acuosa interna. (E) La emulsificación con un homogeneizador (10.000 rpm, 2 min). (F) La emulsión w / o. (G) de estratificación de 300 l de la emulsión en 1 ml de la solución acuosa externa. (H) Planos generales precipitado justo después de la centrifugación. (I) Representación esquemática del principio del método de centrifugación emulsión w / o. La flecha negro indica la dirección de la aceleración centrífuga..jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" /> Figura 2: Perforación del microtubo. (A) precipitada GVs justo después de la centrifugación (también representado en la Figura 1H). La elipse roja indica que la gota de la dispersión GV precipitado. (B) Perforación del microtubo con un marcador. El sedimento que contiene el GVs se obtuvo mediante la perforación de la microtubo cerca de la parte inferior con un marcador y la recolección de las gotas del agujero. (C) las gotitas de la GVs precipitados (indicados por la flecha amarilla) dispersión diluida con la solución acuosa externa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 3: Imágenes de microscopía de Planos generales. (A) imagen de interferencia diferencial microscopía de contraste de un GV sin microesferas. El diámetro de la VG fue de aproximadamente 10 micras. Barra de escala = 10 micras. Imagen de microscopía (b) de la fluorescencia de un GV sin microesferas. La fluorescencia roja fue emitida por Texas Red DHPE. (C) Imagen diferencial microscopía de contraste de interferencia de un GV que contiene microesferas. (D) la microscopía de fluorescencia de imagen de 1,0 micras microesferas (microesferas YG carboxilato) dentro de un VG. El número de microesferas fluorescentes contados (n) fue de 6. Se estimaron los errores (i = 2) en base a la distribución de Poisson. A continuación, calcula el número total de microesferas interiores (N = 20 (n ± i)) fue de 120 ± 40. Se calculó que laGV contenía 1.0 micras microesferas a una fracción de volumen (φ = Nv 100 / V) de aproximadamente 11 ± 3% en volumen, donde V es el volumen de las microesferas y V es el volumen de los GVs. (E) Microscopía de fluorescencia imagen de una membrana GV. La fluorescencia roja fue emitida por Texas Red DHPE. (F) la imagen de las imágenes en los paneles D y E fusionada. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55282/55282fig4.jpg" /> Figura 4: contraste de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia Imágenes de Planos generales con diferentes materiales encapsulados. microscopía de contraste de interferencia diferencial (parte superior) y microscopía de fluorescencia (parte inferior) de imágenesGVs que contiene (a) de 0,1 micras microesferas, (b) GFP, y (c) uranina. Barras de escala = 10 m. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55282/55282fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

The constructive biology and the synthetic biology approach to creating artificial life involve the bottom-up assembly of biological or nonbiological ...

El objetivo general de este método de centrifugación de emulsión agua-en-aceite es preparar fácilmente una capa delgada de vesículas gigantes. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología sintética, como la creación de una célula artificial basada en una vesícula gigante. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución stock de 25 milimolar de DOPC y una solución stock de dos micromolar de Texas Red DHPE en cloroformo.A continuación, forme una película lipídica en la superficie interna de un vial de vidrio de cinco mililitros evaporando una mezcla de las soluciones stock de DOPC y Texas Red DHPE bajo un flujo de gas nitrógeno. Después de incubar la película bajo presión reducida durante la noche, agregue un mililitro de parafina líquida al vial. Envuelva el vial con papel de aluminio e incube la mezcla a 80 grados Celsius durante la noche.En un microtubo de 1,5 mL con tapa, mezcle 237,5 µL de microesferas no fluorescentes de 1 µm y 12,5 µL de microesferas fluorescentes de 1 µm. A continuación, agregue 64 mg de sacarosa, seguido de 125 µL de solución tampón Tris 1 M y 875 µL de agua desionizada al microtubo. Agite la mezcla en vórtex durante 30 segundos y luego sométala a ultrasonido durante 10 minutos.Después de preparar 10 mililitros de una solución tampón Tris, coloque un mililitro en un microtubo con tapa de un punto cinco mililitros. Una vez que la solución haya sido vortexeada y sonicada, mezcle un mililitro de la solución oleosa con 300 microlitros de la solución acuosa interna en un microtubo de un punto cinco mililitros. Emulsifique los dos componentes en el microtubo utilizando un homogenizador mecánico operado a 10.000 rpm durante dos minutos a temperatura ambiente.A continuación, coloque cuidadosamente 300 microlitros de la emulsión de agua en aceite sobre la superficie superior de un mililitro de la solución acuosa externa a cuatro grados Celsius en un microtubo con tapa de un punto cinco mililitros. Inmediatamente después de enfriar el microtubo durante 10 minutos, centrifugue la mezcla a 18.000 veces G durante 30 minutos. Al finalizar, obtenga las vesículas gigantes o GVs perforando la parte inferior del microtubo con un alfiler y recogiendo una gota en un microtubo esterilizado de un punto cinco mililitros.Coloque una cámara de incubación adhesiva para la reacción en cadena de la polimerasa de dos polimerasas y hibridación sobre un portaobjetos de microscopio. Mediante una micropipeta, agregue 25 microlitros de los GV precipitados y diluidos en el área del espécimen y coloque inmediatamente un cubreobjetos de 0,15 milímetros de espesor encima de la cámara de incubación. Después de registrar las imágenes microscópicas de las vesículas, realice microscopía de fluorescencia insertando primero las unidades de espejo de fluorescencia UFBNA y UFMCHE en el microscopio.Luego, configure las unidades con filtros de excitación y filtros de emisión para el análisis. El factor más importante para el éxito del método de agua-en-aceite es que la densidad relativa de la solución acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa, de modo que las GV se precipiten durante la centrifugación. La microscopía de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia de las GV sin microesferas y con microesferas confirmaron que se formaron GV con baja lamelaridad.De las 160 GV obtenidas, 55 microesferas encapsuladas y 105 estaban vacías, lo que da una proporción de encapsulación del 34%. Se estimó que la fracción de volumen de microesferas en las GV era de aproximadamente 11 ± 3 por ciento en volumen, y la precisión de la fracción de volumen calculada fue del 10 al 30%. El encapsulamiento de otros materiales en GV de DOPC al 100% molar utilizando la misma solución acuosa externa y el mismo protocolo fue exitoso, como se muestra mediante microscopía de interferencia diferencial y microscopía de fluorescencia. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar otros métodos como la citometría de flujo con el fin de responder preguntas adicionales, como la elucidación de la célula modelada.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar vesículas gigantes con materiales encapsulados.

preparation-giant-vesicles-encapsulating-microspheres-centrifugation

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

La combinación de generación monodispersas gota con ordenamiento inercial de células y partículas, se describe un método para encapsular un número deseado de células o partículas en una sola gota a tasas kHz. Se demuestra la eficiencia de dos veces superiores a las de la encapsulación no ordenada de las gotas de una y dos partículas.

De alto rendimiento de una sola célula y múltiple las células de micro-encapsulación

Este protocolo describe un método de extrusión para preparar vesículas lipídicas de tamaños sub-micra con un alto grado de homogeneidad. Este método utiliza un sistema de presión controlada con tasas controladas de nitrógeno de flujo para la preparación de liposomas. La preparación de...

Presión constante controlada por extrusión Método para la preparación de vesículas de lípidos de tamaño nano-

Aquí presentamos dos protocolos ultrarrápidos para la reconstitución de proteínas de membrana en proteoliposomes fusogénicas y fusión de tales proteoliposomes con bicapas de lípidos de destino para la entrega de detergente libre de estas proteínas de membrana a la bicapa postfusion. La combinación de estos enfoques permite a Asamblea rápida y fácilmente controlado de los sistemas de membranas de varios componentes complejos.

Libre de detergente ultra rápida reconstitución de proteínas de membrana en bicapas lipídicas soportadas utilizando fusogénicas complementarios cargados de Proteoliposomes.

Presentamos una técnica de micromanipulación sin contacto de vesículas, con gradientes del ion de calcio localizada. Microinyección de una solución de iones de calcio, en las cercanías de una vesícula lipídica gigante, se utiliza para remodelar la membrana lipídica, dando como resultado la producción de protuberancias tubulares de membrana.

Remodelación de membrana de vesículas gigantes en respuesta a gradientes del Ion de calcio localizada

Este estudio describe la hidratación clásica utilizando el método de película lipídica delgada para la preparación de nanoliposomas seguido de caracterización de nanopartículas. Una proteína hidrofílica y globular de 47 kDa, la alcina, se encapsula con éxito como una estrategia para mejorar la estabilidad, evitar el aclaramiento rápido y promover la liberación controlada. El método se puede adaptar a la encapsulación de moléculas hidrofóbicas.

Preparación y caracterización de nanoliposomas para el atrapamiento de proteínas globulares hidrofílicas bioactivas

El objetivo del protocolo es medir de forma fiable las propiedades mecánicas de membrana de las vesículas gigantes por aspiración de micropipetas.

Obtención de vesículas híbridas unilamelares gigantes por electroformación y medición de sus propiedades mecánicas por aspiración de micropipeta

Este artículo presenta un método simple para la producción expedita de vesículas unilamelares gigantes con proteínas citoesqueléticas encapsuladas. El método demuestra ser útil para la reconstitución ascendente de estructuras citoesqueléticas en confinamiento e interacciones citoesqueleto-membrana.

Encapsulación rápida del citoesqueleto reconstituido dentro de vesículas unilamelares gigantes

En este manuscrito, demostramos las técnicas experimentales para encapsular el citoesqueleto de actina F en vesículas lipídicas unilamelares gigantes (también llamadas liposomas), y el método para formar una capa de actina F que imita la corteza en la valva interna de la membrana liposómica.

In vitro Reconstitución del citoesqueleto de actina dentro de vesículas unilamelares gigantes

Presentamos un protocolo para la reconstitución de proteínas de membrana y encapsulación de enzimas y otros componentes solubles en agua en vesículas lipídicas de tamaño submicrométrico y micrométrico.

Construcción de redes metabólicas fuera de equilibrio en vesículas de tamaño nanométrico y micrométrico

Esta guía para principiantes presenta un protocolo general para la preparación de vesículas unilamelares gigantes (GUV) mediante el método de transferencia de gotas, discutiendo los pasos críticos y proporcionando información para ayudar a los posibles ajustes necesarios para diferentes aplicaciones, incluida la biología sintética y la microrobótica.

Uso del método de transferencia de gotas para preparar de forma fiable vesículas unilamelares gigantes

Este artículo presenta una reconstitución simple de redes de citoesqueletos dentro de vesículas gigantes separadas en fase. El método puede generalizarse y aplicarse a la encapsulación o confinamiento de una amplia gama de biomoléculas.

In vitro Reconstitución de redes citoesqueléticas dentro de vesículas unilamelares gigantes (GUV) separadas en fase

Aprende a preparar vesículas gigantes encapsulando microesferas mediante centrifugación de emulsión agua-en-aceite. Este método eficaz utiliza DOPC y Texas Red DHPE para crear modelos celulares artificiales en biología sintética.

Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

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