Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite
24 de enero de 2017
Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.
El objetivo general de este método de centrifugación de emulsión de agua en aceite es preparar fácilmente una vesícula gigante de capa fina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología sintética, como la creación de una célula artificial basada en una vesícula gigante. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución madre de 25 milimolares de DOPC y una solución madre de dos milimolares de DHPE rojo de Texas en cloroformo.
A continuación, forme una película lipídica en la superficie interior de un vial de vidrio de cinco mililitros evaporando una mezcla de soluciones madre de DOPC y DHPE rojo de Texas bajo gas nitrógeno que fluye. Después de incubar la película a presión reducida durante la noche, agregue un mililitro de parafina líquida al vial. Envuelva el vial en papel de aluminio e incube la mezcla a 80 grados centígrados durante la noche.
En un microtubo con tapa de un coma cinco mililitros, mezcle 237 coma cinco microlitros de microesferas no fluorescentes de un micrómetro y microesferas fluorescentes de 12 coma cinco microlitros. Ahora agregue 64 miligramos de sacarosa seguidos de 125 microlitros de una solución tamponada Tris molar y 875 microlitros de agua desionizada al microtubo. Agita la mezcla durante 30 segundos y luego sonicate durante 10 minutos.
Después de preparar 10 mililitros de una solución tamponada Tris, coloque un mililitro en un microtubo con tapa de un punto cinco mililitros. Una vez que la solución haya sido vertiginosa y sonicada, mezcle un mililitro de la solución oleosa con 300 microlitros de la solución acuosa interna en un microtubo de un punto cinco mililitros. Emulsibilizar los dos componentes en el microtubo utilizando un homoginizador mecánico operado a 10.000 rpm durante dos minutos a temperatura ambiente.
A continuación, coloque suavemente 300 microlitros de la emulsión de agua en aceite en la superficie superior de un mililitro de la solución acuosa exterior a cuatro grados centígrados en un microtubo con tapa de cinco mililitros. Inmediatamente después de enfriar el microtubo durante 10 minutos, centrifugue la mezcla a 18.000 veces G durante 30 minutos. Cuando termine, obtenga las vesículas gigantes precipitadas o GV perforando la parte inferior del microtubo con un alfiler de empuje y recogiendo una gota en un microtubo esterilizado de un punto cinco mililitros.
Coloque una cámara de incubación adhesiva para la reacción en cadena y la hibridación de la polimerasa NC dos encima de un cubreobjetos de microscopio. Con una micropipeta, deposite 25 microlitros de los GV precipados diluidos en el área de la muestra e inmediatamente coloque un cubreobjetos de punto cero de cinco milímetros de espesor en la parte superior de la cámara de incubación. Después de registrar las imágenes de microscopía de las vesículas, realice la microscopía de fluorescencia insertando primero las unidades de espejo de fluorescencia UFBNA y UFMCHE en el microscopio.
A continuación, equipe las unidades con filtros de excitación y filtros de emisión para el análisis. El determinante más importante del éxito del método de agua en aceite es que la gravedad específica de la solución acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa para que los GV precipiten durante la centrifugación. La microscopía de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia de los GVs sin microesferas y con microesferas confirmaron que se formaron GVs con baja laminaridad.
De los 160 GV obtenidos, 55 microesferas encapsuladas y 105 estaban vacías, lo que da una proporción de encapsulación del 34%. Se estimó que la fracción de volumen de las microesferas en los GV era de aproximadamente 11 más o menos tres por ciento de volumen y la precisión de la fracción de volumen calculada fue de 10 a 30%. La encapsulación de otros materiales en GV DOPC al 100 por ciento molar utilizando la misma solución acuosa externa y el mismo protocolo fue exitoso, como lo demuestran la microscopía de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo, para responder a preguntas adicionales, como la elucidación de la célula modelada.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar vesículas gigantes con materiales encapsulados.
Descripción general
Este artículo describe la preparación de vesículas gigantes utilizando un método de centrifugación de emulsión agua-en-aceite. Estas vesículas sirven como modelos útiles para la investigación en biología sintética, particularmente en la creación de células artificiales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología Sintética
- Preparación de Vesículas
- Modelos Celulares
Antecedentes
- Las vesículas gigantes pueden encapsular materiales, lo que las hace valiosas para la investigación.
- El método de emulsión agua-en-aceite simplifica el proceso de preparación.
- Comprender la formación de vesículas es crucial para el avance de la biología sintética.
- La eficiencia de encapsulación es una métrica clave para evaluar el método.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método sencillo para la preparación de vesículas gigantes.
- Explorar el potencial de estas vesículas en aplicaciones de biología sintética.
- Evaluar la encapsulación de diversos materiales dentro de las vesículas.
Métodos Utilizados
- Preparación de películas lipídicas a partir de DOPC y Texas Red DHPE.
- Formación de emulsiones agua-en-aceite mediante homogenización mecánica.
- Centrifugación para aislar vesículas gigantes.
- Técnicas de microscopía para analizar las propiedades de las vesículas.
Resultados principales
- Formación exitosa de vesículas gigantes con tasas de encapsulación variables.
- El 34 % de las vesículas encapsuló microesferas.
- La fracción de volumen de microesferas se estimó en aproximadamente el 11 %.
- Otros materiales fueron encapsulados exitosamente utilizando el mismo protocolo.
Conclusiones
- El método de agua en aceite es eficaz para la preparación de vesículas gigantes.
- La eficiencia de encapsulación puede optimizarse para diversas aplicaciones.
- Esta técnica abre nuevas vías para investigaciones futuras en biología sintética.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La encapsulación eficiente de microesferas dentro de vesículas gigantes (GVs) permite la construcción de modelos de células artificiales, apoyando el descubrimiento en biología sintética y biofármacos en etapas iniciales. Este método proporciona una plataforma reproducible para investigar la compartimentalización, el hacinamiento molecular y la eficiencia de encapsulación, factores críticos para la confianza predictiva en sistemas que imitan la célula. El enfoque es directamente relevante para las líneas de validación de dianas y desarrollo de ensayos, donde los modelos de células artificiales aportan información para la reducción de riesgos mecanicistas y la continuidad traslacional.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biofármacos
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Facilita la construcción ascendente de modelos de células artificiales para la comprobación de hipótesis.
- Permite la encapsulación de diversas biomoléculas o partículas para imitar entornos celulares.
- Apoya la reducción mecanicista de riesgos mediante la modelización del empaquetamiento molecular y la compartimentalización.
- Proporciona una plataforma para la validación funcional de objetivos en sistemas sintéticos.
Desarrollo de pruebas y cribado
- Prepara sistemas estandarizados basados en vesículas para flujos de trabajo de cribado posteriores.
- Proporciona métricas cuantitativas de encapsulación para evaluar la reproducibilidad del ensayo.
- Posibilita la producción escalable de vesículas para aplicaciones de cribado de alto contenido.
- Permite la evaluación confiable de interacciones de compuestos o biomoléculas dentro de compartimentos definidos.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Modela características celulares relevantes para la enfermedad, como el hacinamiento molecular y la compartimentalización.
- Alinea los sistemas celulares artificiales con estudios traslacionales de biomarcadores al encapsular moléculas relevantes.
- Proporciona continuidad desde la validación de modelos sintéticos hasta el desarrollo de ensayos preclínicos.
- Reduce el riesgo de hallazgos en etapas iniciales mediante la manipulación controlada y cuantitativa del sistema.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
Este método de centrifugación de emulsión agua-en-aceite se integra en la interfase entre el descubrimiento temprano y el desarrollo de ensayos, permitiendo la generación de modelos celulares artificiales para investigaciones basadas en hipótesis y cribados.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre la compartimentalización y la eficiencia de encapsulación en sistemas sintéticos.
- Selección: Proporciona preparaciones cuantitativas y reproducibles de vesículas para la estandarización de ensayos.
- Análisis: Permite medir las relaciones de encapsulación y las fracciones de volumen para análisis comparativo.
- Investigación Traducional: Conecta los hallazgos de modelos sintéticos con el diseño de ensayos preclínicos al encapsular moléculas relevantes para enfermedades.
- Reutilización Empresarial: Ofrece un protocolo reutilizable adaptable a diversos encapsulantes y composiciones de vesículas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en ensayos basados en células artificiales y en la validación de dianas.
- Valor operativo: Proporciona una preparación estandarizada y escalable de vesículas con resultados cuantificables.
- Valor estratégico: Mejora las decisiones de avance o interrupción al reducir la ambigüedad mecanicista en las fases iniciales del descubrimiento.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo de proyectos de biología sintética y sistemas que imitan a las células.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en química de lípidos, manipulación de emulsiones y análisis por microscopía.
- Necesita acceso a homogeneizadores, centrífugas e infraestructura de microscopía de fluorescencia.
- Exige la estandarización entre equipos de los protocolos de encapsulación y análisis.
- Adaptable a diferentes encapsulantes y tamaños de vesículas mediante la optimización del protocolo.
- La eficiencia de encapsulación y la lamelaridad de las vesículas pueden variar y requieren validación empírica.
