Preparación de vesículas gigantes Encapsulating microesferas por centrifugación de una emulsión de agua-en-aceite

Las vesículas gigantes que contienen componentes altamente empaquetados del tamaño de un micrómetro son modelos celulares útiles. El método de centrifugación en emulsión de agua en aceite es una herramienta sencilla y potente para la preparación de vesículas gigantes con materiales encapsulados.

El objetivo general de este método de centrifugación de emulsión de agua en aceite es preparar fácilmente una vesícula gigante de capa fina. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología sintética, como la creación de una célula artificial basada en una vesícula gigante. Para comenzar este procedimiento, prepare una solución madre de 25 milimolares de DOPC y una solución madre de dos milimolares de DHPE rojo de Texas en cloroformo.

A continuación, forme una película lipídica en la superficie interior de un vial de vidrio de cinco mililitros evaporando una mezcla de soluciones madre de DOPC y DHPE rojo de Texas bajo gas nitrógeno que fluye. Después de incubar la película a presión reducida durante la noche, agregue un mililitro de parafina líquida al vial. Envuelva el vial en papel de aluminio e incube la mezcla a 80 grados centígrados durante la noche.

En un microtubo con tapa de un coma cinco mililitros, mezcle 237 coma cinco microlitros de microesferas no fluorescentes de un micrómetro y microesferas fluorescentes de 12 coma cinco microlitros. Ahora agregue 64 miligramos de sacarosa seguidos de 125 microlitros de una solución tamponada Tris molar y 875 microlitros de agua desionizada al microtubo. Agita la mezcla durante 30 segundos y luego sonicate durante 10 minutos.

Después de preparar 10 mililitros de una solución tamponada Tris, coloque un mililitro en un microtubo con tapa de un punto cinco mililitros. Una vez que la solución haya sido vertiginosa y sonicada, mezcle un mililitro de la solución oleosa con 300 microlitros de la solución acuosa interna en un microtubo de un punto cinco mililitros. Emulsibilizar los dos componentes en el microtubo utilizando un homoginizador mecánico operado a 10.000 rpm durante dos minutos a temperatura ambiente.

A continuación, coloque suavemente 300 microlitros de la emulsión de agua en aceite en la superficie superior de un mililitro de la solución acuosa exterior a cuatro grados centígrados en un microtubo con tapa de cinco mililitros. Inmediatamente después de enfriar el microtubo durante 10 minutos, centrifugue la mezcla a 18.000 veces G durante 30 minutos. Cuando termine, obtenga las vesículas gigantes precipitadas o GV perforando la parte inferior del microtubo con un alfiler de empuje y recogiendo una gota en un microtubo esterilizado de un punto cinco mililitros.

Coloque una cámara de incubación adhesiva para la reacción en cadena y la hibridación de la polimerasa NC dos encima de un cubreobjetos de microscopio. Con una micropipeta, deposite 25 microlitros de los GV precipados diluidos en el área de la muestra e inmediatamente coloque un cubreobjetos de punto cero de cinco milímetros de espesor en la parte superior de la cámara de incubación. Después de registrar las imágenes de microscopía de las vesículas, realice la microscopía de fluorescencia insertando primero las unidades de espejo de fluorescencia UFBNA y UFMCHE en el microscopio.

A continuación, equipe las unidades con filtros de excitación y filtros de emisión para el análisis. El determinante más importante del éxito del método de agua en aceite es que la gravedad específica de la solución acuosa interna debe ser mayor que la de la solución acuosa externa para que los GV precipiten durante la centrifugación. La microscopía de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia de los GVs sin microesferas y con microesferas confirmaron que se formaron GVs con baja laminaridad.

De los 160 GV obtenidos, 55 microesferas encapsuladas y 105 estaban vacías, lo que da una proporción de encapsulación del 34%. Se estimó que la fracción de volumen de las microesferas en los GV era de aproximadamente 11 más o menos tres por ciento de volumen y la precisión de la fracción de volumen calculada fue de 10 a 30%. La encapsulación de otros materiales en GV DOPC al 100 por ciento molar utilizando la misma solución acuosa externa y el mismo protocolo fue exitoso, como lo demuestran la microscopía de interferencia diferencial y la microscopía de fluorescencia. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la citometría de flujo, para responder a preguntas adicionales, como la elucidación de la célula modelada.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar vesículas gigantes con materiales encapsulados.