Agregada la optimización del tamaño de micropocillos para basada en suspensión cardiaca diferenciación de células madre pluripotentes

Primero, centrifuga una célula madre pluripotente humana de una sola célula, o suspensión de HPSC, a 200 veces g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, aspire el medio de lavado y vuelva a suspender las células en el medio de agregación, a una densidad de 1,2 veces 10 a la sexta célula por mililitro. A continuación, siembre un mililitro de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de micropocillos preparada y distribuya uniformemente las células.

Para sembrar una gran cantidad de pozos, vórtice periódicamente la suspensión celular para evitar que se asiente. Después de sembrar, centrifugar la placa a 200 veces g durante cinco minutos. Después del centrifugado, observe la placa bajo el microscopio para confirmar que las células han girado hasta el fondo de cada micropocillo.

Luego, incube la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora hipóxica de 5%C-O dos, 5%O dos. Un día después de la agregación, inspeccione los agregados bajo el microscopio. En comparación con la agregación inmediata posterior a la centrífuga, deben aparecer intactos con bordes lisos.

Retire el sobrenadante sosteniendo la placa de micropocillo horizontalmente y colocando la punta de una micropipeta P-1000 en la superficie del medio de cultivo y contra el borde del pocillo. Luego, retire lentamente el medio, teniendo cuidado de no alterar los agregados en el fondo de los micropocillos. Después de reducir el nivel del medio a aproximadamente uno o dos milímetros de la superficie del micropocillo texturizado, incline lentamente la placa y aspire lentamente el medio restante del pocillo.

Añada un milímetro de medio de inducción de la primera etapa precalentado recién preparado sosteniendo la punta de la pipeta contra el borde interior del pocillo y dispensando muy lentamente el medio contra la pared interior del pocillo. Regrese la placa a la incubadora en condiciones hipóxicas durante tres días. En el cuarto día, use una pipeta serológica de cinco mililitros para recolectar los agregados de cada pocillo de la placa de micropocillos.

Recoja hasta 10 pocillos de suspensión de agregados en un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los agregados se asienten durante 15 minutos en una incubadora hipóxica. Después de que los agregados se hayan asentado, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados en diez mililitros de medio de lavado precalentado, para eliminar las citocinas inductivas residuales.

Centrifugar los agregados a 50 veces g durante dos minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados peletizados en un medio de inducción precalentado de la etapa dos. Transfiera la suspensión de agregados a una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos a un mililitro por pocillo.

Observe los agregados bajo el microscopio como grupos uniformes de células apretadas. Incubar en condiciones hipóxicas hasta el sexto día. En el sexto día, agrupe hasta 10 mililitros de agregados por tubo cónico de 15 mililitros como antes.

Después de que los agregados se hayan asentado, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados en el medio de inducción precalentado de la etapa tres. Con una pipeta serológica de cinco mililitros, redistribuya los agregados en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos, a razón de un mililitro por pocillo. Realiza un cambio completo de medio en el día 10 de cultivo.

El día 12, transfiera las células a condiciones de cultivo normóxico de 20% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante el resto del período de cultivo. Después de 12 días de diferenciación, que corresponde a seis días en la etapa tres de inducción cardíaca, se observaron contracciones contundentes de todo el agregado. A los 17 días, el 74,8% de las células son positivas para troponina T cardíaca, por citometría de flujo, como lo indica la porción llena del histograma.

También se muestran las células teñidas con el anticuerpo secundario solo, que se muestra en la sección sin relleno del histograma. Al intentar este procedimiento, es importante lavar bien los agregados el cuarto día, para eliminar los niveles de trazas de citocinas, específicamente la activina-A, que promueve la diferenciación del endodermo, a expensas de la inducción cardíaca. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo en frío de tipos de células inductivas dentro del agregado, para responder a otras preguntas, como cómo la señalización paracrina de los tejidos embrionarios vecinos influye en la diferenciación de las células madre pluripotentes humanas en el linaje cardíaco.