Agregada la optimización del tamaño de micropocillos para basada en suspensión cardiaca diferenciación de células madre pluripotentes
25 de septiembre de 2016
Los métodos convencionales para iniciar la diferenciación cardiaca basada agregada suspensión de pluripotente humana se deriva células (hPSCs) están plagados de heterogeneidad de cultivo con respecto al tamaño y la forma agregada. A continuación, describimos un método robusto para la diferenciación cardiaca empleando pocillos para generar HPSC tamaño controlado agregados cultivan en condiciones cardíacas promotoras.
Primero, centrifuga una célula madre pluripotente humana de una sola célula, o suspensión de HPSC, a 200 veces g durante cinco minutos. Después de la centrifugación, aspire el medio de lavado y vuelva a suspender las células en el medio de agregación, a una densidad de 1,2 veces 10 a la sexta célula por mililitro. A continuación, siembre un mililitro de la suspensión celular en cada pocillo de la placa de micropocillos preparada y distribuya uniformemente las células.
Para sembrar una gran cantidad de pozos, vórtice periódicamente la suspensión celular para evitar que se asiente. Después de sembrar, centrifugar la placa a 200 veces g durante cinco minutos. Después del centrifugado, observe la placa bajo el microscopio para confirmar que las células han girado hasta el fondo de cada micropocillo.
Luego, incube la placa durante 24 horas a 37 grados centígrados en una incubadora hipóxica de 5%C-O dos, 5%O dos. Un día después de la agregación, inspeccione los agregados bajo el microscopio. En comparación con la agregación inmediata posterior a la centrífuga, deben aparecer intactos con bordes lisos.
Retire el sobrenadante sosteniendo la placa de micropocillo horizontalmente y colocando la punta de una micropipeta P-1000 en la superficie del medio de cultivo y contra el borde del pocillo. Luego, retire lentamente el medio, teniendo cuidado de no alterar los agregados en el fondo de los micropocillos. Después de reducir el nivel del medio a aproximadamente uno o dos milímetros de la superficie del micropocillo texturizado, incline lentamente la placa y aspire lentamente el medio restante del pocillo.
Añada un milímetro de medio de inducción de la primera etapa precalentado recién preparado sosteniendo la punta de la pipeta contra el borde interior del pocillo y dispensando muy lentamente el medio contra la pared interior del pocillo. Regrese la placa a la incubadora en condiciones hipóxicas durante tres días. En el cuarto día, use una pipeta serológica de cinco mililitros para recolectar los agregados de cada pocillo de la placa de micropocillos.
Recoja hasta 10 pocillos de suspensión de agregados en un tubo cónico de 15 mililitros. Deje que los agregados se asienten durante 15 minutos en una incubadora hipóxica. Después de que los agregados se hayan asentado, aspire cuidadosamente el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados en diez mililitros de medio de lavado precalentado, para eliminar las citocinas inductivas residuales.
Centrifugar los agregados a 50 veces g durante dos minutos. Después de la centrifugación, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados peletizados en un medio de inducción precalentado de la etapa dos. Transfiera la suspensión de agregados a una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos a un mililitro por pocillo.
Observe los agregados bajo el microscopio como grupos uniformes de células apretadas. Incubar en condiciones hipóxicas hasta el sexto día. En el sexto día, agrupe hasta 10 mililitros de agregados por tubo cónico de 15 mililitros como antes.
Después de que los agregados se hayan asentado, aspire el sobrenadante y vuelva a suspender los agregados en el medio de inducción precalentado de la etapa tres. Con una pipeta serológica de cinco mililitros, redistribuya los agregados en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos, a razón de un mililitro por pocillo. Realiza un cambio completo de medio en el día 10 de cultivo.
El día 12, transfiera las células a condiciones de cultivo normóxico de 20% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono durante el resto del período de cultivo. Después de 12 días de diferenciación, que corresponde a seis días en la etapa tres de inducción cardíaca, se observaron contracciones contundentes de todo el agregado. A los 17 días, el 74,8% de las células son positivas para troponina T cardíaca, por citometría de flujo, como lo indica la porción llena del histograma.
También se muestran las células teñidas con el anticuerpo secundario solo, que se muestra en la sección sin relleno del histograma. Al intentar este procedimiento, es importante lavar bien los agregados el cuarto día, para eliminar los niveles de trazas de citocinas, específicamente la activina-A, que promueve la diferenciación del endodermo, a expensas de la inducción cardíaca. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como el cultivo en frío de tipos de células inductivas dentro del agregado, para responder a otras preguntas, como cómo la señalización paracrina de los tejidos embrionarios vecinos influye en la diferenciación de las células madre pluripotentes humanas en el linaje cardíaco.
Descripción general
Este artículo presenta un método robusto para la diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes humanas (hPSCs) utilizando micropocillos para generar agregados con tamaño controlado. El método aborda los problemas de heterogeneidad del cultivo asociados con las técnicas convencionales.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Biología de Células Madre
- Diferenciación Cardíaca
- Ingeniería de Tejidos
Antecedentes
- Las células madre pluripotentes humanas (hPSCs) pueden diferenciarse en diversos tipos celulares, incluyendo células cardíacas.
- Los métodos convencionales a menudo generan agregados de tamaños y formas variables, lo que afecta los resultados de la diferenciación.
- La tecnología de micropocillos ofrece una solución para generar agregados uniformes.
- Las condiciones que favorecen la diferenciación cardíaca son esenciales para una diferenciación eficaz.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método para generar agregados de CEPH con tamaño controlado.
- Mejorar la consistencia de los resultados de diferenciación cardíaca.
- Facilitar investigaciones futuras en ingeniería de tejidos cardíacos.
Métodos Utilizados
- Centrifugación de la suspensión de CEP para formar agregados.
- Uso de placas de microhendiduras para controlar el tamaño de los agregados.
- Incubación en condiciones hipóxicas para promover la diferenciación cardíaca.
- Cambios secuenciales del medio para inducir las etapas de diferenciación.
Resultados principales
- Se formaron agregados uniformes y se mantuvieron durante todo el proceso de diferenciación.
- Se observó una expresión significativa de troponina T cardíaca en las células diferenciadas.
- La mejora en la eliminación de citocinas inductoras potenció el compromiso hacia la línea cardíaca.
- Se registraron contracciones en todo el agregado después de 12 días de diferenciación.
Conclusiones
- El método de micropozos proporciona un enfoque confiable para la diferenciación cardíaca de células madre pluripotentes humanas (hPSCs).
- Los agregados controlados en tamaño conducen a resultados de diferenciación más consistentes.
- Esta técnica puede aplicarse para investigar más a fondo el desarrollo cardíaco y la modelización de enfermedades.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
El control del tamaño de los agregados en la diferenciación cardíaca en suspensión aborda un cuello de botella clave en la producción de cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes humanas: la heterogeneidad del cultivo que conduce a rendimientos variables. Al imponer la formación uniforme de agregados mediante tecnología de micropocillos, este método mejora la confianza predictiva en los resultados de diferenciación, favoreciendo la generación escalable y reproducible de modelos preclínicos. Esto posiciona al enfoque como una herramienta estratégica para reducir los riesgos en el compromiso de la línea cardíaca en fases tempranas del descubrimiento y en flujos de trabajo traslacionales.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar las vías de señalización dependientes del tamaño en la inducción cardíaca, aclarando los factores mecanicistas de la especificación de linajes.
- Valor operativo: Reduce la variabilidad en la formación de agregados, mejorando la reproducibilidad entre experimentos y equipos.
- Valor predictivo: Facilita la modelización de respuesta a dosis de exposición a morfógenos mediante la estandarización de la geometría de los agregados como una variable controlada.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Listo para ensayos: Produce microtejidos uniformes adecuados para imágenes de alto contenido y cuantificación de cardiomiocitos basada en citometría de flujo.
- Escalabilidad: El formato de placa con micropocillos permite el procesamiento paralelo de múltiples condiciones o fondos genéticos para cribados comparativos.
- Resultado cuantitativo: Permite la medición consistente de células positivas para troponina T cardíaca como lectura funcional en estudios de perturbaciones por compuestos o genéticas.
Investigación Traductacional y Preclínica
- Sistema relevante para la enfermedad: Genera agregados cardíacos homogéneos y escalables para modelar cardiomiopatías hereditarias o cardiotoxicidad inducida por fármacos.
- Continuidad traslacional: Conecta la diferenciación en fase de descubrimiento con la validación preclínica al proporcionar material celular consistente entre lotes.
- Reducción mecanicista de riesgos: Minimiza las variables de confusión derivadas de la heterogeneidad en el tamaño de los agregados, aumentando la confianza en las asociaciones entre fenotipo y genotipo.
Integración de la canalización y flujo de trabajo
Este método se integra en la continuidad desde el descubrimiento hasta la etapa preclínica al permitir la diferenciación estandarizada de CEPH, lo que alimenta aplicaciones posteriores como la modelización de enfermedades, la farmacología de seguridad y la evaluación de candidatos para la medicina regenerativa.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la verificación de hipótesis sobre señales biofísicas en la determinación de la línea cardíaca mediante un control preciso del tamaño y la forma de los agregados.
- Selección: Proporciona matrices reproducibles de microtejidos para la selección de bibliotecas de compuestos con menor ruido derivado de la variabilidad en la agregación.
- Análisis: Facilita lecturas cuantitativas mediante citometría de flujo e imágenes (por ejemplo, troponina T cardíaca) con una mejor relación señal-ruido gracias a la homogeneidad de la población.
- Investigación Traducional: Ofrece una fuente escalable de cardiomiocitos para ensayos funcionales preclínicos, incluyendo contractilidad y electrofisiología.
- Reutilización Empresarial: Las placas de micropozos pueden reutilizarse en distintos proyectos y líneas celulares, favoreciendo la estandarización a nivel de plataforma en los protocolos de diferenciación de células madre.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Aumenta la confianza predictiva en los resultados de diferenciación al minimizar el ruido biológico derivado de la variación en el tamaño de los agregados.
- Valor operativo: Mejora la reproducibilidad y el rendimiento mediante la formación estandarizada y escalable de agregados.
- Valor estratégico: Mejora la confianza en las decisiones de avance o interrupción (go/no-go) en programas cardíacos tempranos al reducir los falsos negativos provocados por una diferenciación ineficiente.
- Impacto en la cartera: Permite la asignación de recursos ajustada al riesgo basada en métricas fiables de rendimiento de cardiomiocitos.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en el cultivo de CEPH, manipulación de agregados y sistemas de incubación hipóxica.
- Depende del acceso a placas de microhendiduras con dimensiones de pocillo definidas y superficies de baja adhesión.
- Necesita protocolos estandarizados de cambio de medio para evitar la alteración de los agregados durante los pasos de lavado.
- Requiere validación en diferentes líneas de CEPH para asegurar que las relaciones entre tamaño y eficiencia de diferenciación sean consistentes.
- Limitado por la necesidad de equipo especializado (incubadores hipóxicos, placas de baja adhesión) y pasos de lavado de citoquinas optimizados para prevenir la diferenciación fuera del blanco.
