Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una tecnología de purificación microfluídica conveniente, eficiente y de alto rendimiento, para separar nanopartículas libres de células, tras la ingeniería celular con las nanopartículas. La principal ventaja de esta tecnología es permitir la eliminación rápida y eficiente de nanopartículas no unidas tras el procedimiento de manipulación celular. Después de este procedimiento, recopilamos toda nuestra ses-fa-tion. Esta tecnología de purificación celular microfluídica logra una separación eficiente basada en el tamaño gracias a los efectos diferenciales de enfoque inercial de las células y las nanopartículas en un dispositivo microfluídico espiral.

Puede procesar hasta 10 millones de células por concentración mil, lo cual es muy útil para la medicina regenerativa, así como para el procesamiento de células de volumen de bloqueo. Esta tecnología es muy deseada en el campo de la ingeniería celular, que a menudo utiliza nanopartículas para marcar células, con fines de imagen o control funcional. La realización del procedimiento estará a cargo de Hui Min Tay, una asistente de investigación de mi laboratorio, así como del Doctor David Yeo, investigador postdoctoral del laboratorio del Profesor Xi.

Cultive células madre mesenquimales hasta alcanzar una confluencia mayor al 80% en una placa de seis pocillos antes de marcar las células con las nanopartículas. De manera similar, cultive las células THP-1 hasta una densidad de un millón de células por mililitro. A continuación, disuelva un miligramo de nanopartículas de sílice en un mililitro de solución de colorante de calcio de doscientos micromolares.

Y agite las partículas durante la noche. Además, elabore nanopartículas de PLGA con calcio AM utilizando los métodos descritos en la referencia que se muestra aquí. Mezcle un miligramo de las nanopartículas de PLGA con calcio AM o 150 microgramos de las nanopartículas de calcio y sílice en una solución al 0,1 % de poli-L-lisina en agua, pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo durante un minuto.

Luego, incubar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. A continuación, centrifugar las nanopartículas. Eliminar el sobrenadante excedente de poli-l-lisina y re-suspender las nanopartículas en un mililitro del medio de cultivo apropiado para el tipo celular que se va a marcar.

Añada 1 miligramo de nanopartículas marcadas a un mililitro de medio por cada millón de células en cultivo. Pipetee la mezcla de células, nanopartículas y medio durante un minuto. A continuación, incube la mezcla durante aproximadamente 24 horas.

Una vez marcadas, disocie y recupere las células madre, y resuspenda en una concentración entre 100.000 y 1.000.000 de células por mililitro para el procesamiento microfluídico. Utilice células THP-1 marcadas a la misma concentración. Para fabricar el dispositivo microfluídico en espiral, primero prepare un molde maestro de oblea de silicona utilizando técnicas estándar de microfabricación.

Luego, mezcle 30 gramos del prepolímero de PDMS base y tres gramos de un agente de curado de forma exhaustiva en un recipiente de pesaje. Desgasifique la mezcla bajo vacío durante 60 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire. Vierta cuidadosamente la mezcla de PDMS sobre el molde maestro, patroneado con el diseño del canal espiral, hasta una altura de cinco a 10 milímetros.

Luego desgasifique la mezcla durante 60 minutos para eliminar cualquier burbuja de aire. Repita este proceso hasta que se eliminen todas las burbujas. A continuación, coloque la oblea en un horno y asegúrese de que la oblea no esté inclinada durante el curado, para garantizar una altura constante del dispositivo.

Polimerice el PDMS a 80 grados Celsius durante dos horas. Una vez enfriado, corte el dispositivo en espiral de PDMS utilizando un escalpelo y desprenda cuidadosamente la lámina de PDMS del molde maestro. Luego, utilice un escalpelo para recortar los bordes del dispositivo y asegurar una superficie lisa para la unión.

A continuación, utilice un punzón de biopsia de 1,5 milímetros para crear dos orificios para las entradas y dos orificios para las salidas. Lave el dispositivo con isopropanol para eliminar cualquier residuo y séquelo en un horno a 80 grados Celsius durante cinco minutos.

Luego, utilice cinta adhesiva para limpiar la superficie inferior del dispositivo de PDMS y un lado de una portaobjetos de vidrio. Coloque cuidadosamente la portaobjetos y el dispositivo de PDMS en una cámara de plasma con las superficies limpias expuestas. Encienda la potencia de plasma al máximo, reduzca la presión de la cámara hasta que adquiera un color rosa y exponga los componentes durante 60 segundos.

Luego, retire la lámina y el dispositivo de PDMS de la cámara. Y únalos presionando firmemente las superficies expuestas al plasma una contra la otra. Asegúrese de que no queden burbujas atrapadas entre las dos superficies.

Caliente el dispositivo unido en una placa calefactora ajustada a 80 grados celsius durante dos horas para reforzar la unión. Corte dos trozos de tubo de 15 a 20 centímetros de longitud para las entradas, y coloque una aguja de calibre 23 en un extremo de cada tubo. Luego, corte dos trozos del mismo tubo de cinco a 10 centímetros de longitud para las salidas, y conéctelos a los orificios de salida del dispositivo.

Antes de analizar la muestra, prepare manualmente el dispositivo con una jeringa que contenga etanol al 70 % hasta que fluya por el tubo de salida. Deje que el etanol permanezca en el dispositivo durante al menos 30 segundos para esterilizarlo. Luego, cargue 30 mililitros de PBS filtrado con BSA al 1 % en una jeringa de 60 mililitros.

Además, cargue tres mililitros de células marcadas en una jeringa de tres mililitros y verifique que no queden burbujas de aire atrapadas en ninguna de las jeringas. Elimine cualquier burbuja de aire expulsando suavemente unas gotas de líquido por la boquilla. Conecte las puntas de entrada y los tubos a las jeringas y asegure las jeringas a las bombas de jeringa.

Inserte los tubos en sus entradas respectivas del dispositivo y asegúrese de que no haya burbujas a lo largo del tubo. Con la fluidica ya configurada, monte el dispositivo en un microscopio invertido de contraste de fases para obtener imágenes en tiempo real durante el proceso de clasificación celular. Coloque un pequeño vaso de desecho y dos tubos de 15 mililitros cerca del dispositivo sobre la platina del microscopio.

Coloque los tubos de salida de ambas salidas del dispositivo en el vaso de desecho. A continuación, establezca la relación de flujo entre tampón de muestra y tampón de envolvente en una proporción de uno a diez, ajustando la velocidad de flujo de la jeringa de muestra a 120 microlitros por minuto y la de la jeringa de envolvente a 1.200 microlitros por minuto. Haga funcionar el dispositivo durante un minuto y medio para permitir que la velocidad de flujo se estabilice.

Utilice una cámara de alta velocidad para confirmar la presencia de células enfocadas inercialmente cerca de la pared interna del canal en campo claro con contraste de fase. Una vez alcanzado el flujo en estado estacionario y el dispositivo esté funcionando correctamente, coloque los tubos de salida en diferentes viales para recoger eluyentes separados de la salida de células y la salida de desecho. Este dispositivo es capaz de separar correctamente una suspensión marcada de células monocíticas THP-1 de nanopartículas de sílice fluorescentes.

Se obtuvieron altas eficiencias de separación, tal como lo confirmaron el análisis mediante imágenes de alta velocidad y citometría de flujo. La estrategia de purificación en un solo paso permite la recuperación continua de una suspensión marcada y células adherentes que se suspenden en una solución fresca de tampón, sin necesidad de centrifugación. El dispositivo es capaz de separar con alta eficiencia tanto nanopartículas de sílice como de PLGA, y puede separar hasta 10 millones de células por mililitro con la misma alta eficiencia.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células con nanopartículas y de cómo purificar las células etiquetadas eliminando las partículas no unidas en exceso mediante nuestro dispositivo microfluídico especializado.