Microfluidos intercambio de tampón para la Micro / célula de nanopartículas Ingeniería sin interferencias

El objetivo general de este procedimiento es demostrar una tecnología de purificación microfluídica conveniente, eficiente y de alto rendimiento, para separar las nanopartículas libres de las células, siguiendo la ingeniería celular con las nanopartículas. El principal objetivo de esta tecnología es permitir la eliminación rápida y eficiente de las nanopartículas no unidas. Después del procedimiento de trabajo de la célula, recogemos todas nuestras ses-fa-ción. Esta tecnología de purificación de células microfluídicas logra una separación eficiente basada en el tamaño debido a los efectos de enfoque inercial diferencial de las células y las nanopartículas en un microdispositivo en espiral.

Puede procesar hasta 10 millones de células por mil, lo que es muy útil para la medicina regenerativa, así como para el procesamiento de células de volumen de bloqueo. Esta tecnología es muy deseada para el campo de la ingeniería celular, que a menudo utiliza nanopartículas para trabajar con células, con fines de imagen o control de funciones. La demostración del procedimiento estará a cargo de Hui Min Tay, asistente de investigación de mi laboratorio, así como del doctor David Yeo, investigador postdoctoral del laboratorio del profesor Xi.

Cultivo de células madre mesenquimales con una confluencia superior al 80% en una placa de seis pocillos antes de etiquetar las células con las nanopartículas. De manera similar, cultive células THP-1 a una densidad de un millón de células por mililitro. A continuación, disuelva un miligramo de nanopartículas de sílice con un mililitro de solución de colorante de calcio de doscientos micromolares.

Y revuelva las partículas durante la noche. Además, fabrique nanopartículas de calcio AM PLGA utilizando los métodos descritos en la referencia que se muestra aquí. Mezcle un miligramo de las nanopartículas de calcio AM PLGA o 150 microgramos de las nanopartículas de sílice cálcica en una solución de poli-l-lisina al 01% en agua pipeteando la solución hacia arriba y hacia abajo durante un minuto.

Y luego déjalo incubar a temperatura ambiente durante 15 a 20 minutos. A continuación, centrifugar las nanopartículas. Eliminar el exceso de sobrenadante de poli-l-lisina y volver a suspender las nanopartículas en un mililitro del medio de cultivo adecuado para el tipo de célula que se va a marcar.

Agregue 1 miligramo de las nanopartículas marcadas a un mililitro de medio por cada millón de células en cultivo. Pipetear bien la mezcla de células, nanopartículas y medio durante un minuto. Y luego incubar la mezcla durante aproximadamente 24 horas.

Una vez marcadas, disociar y recolectar las células madre, y volver a suspenderlas a una concentración de entre 100.000 y 1.000.000 de células por mililitro para el procesamiento microfluídico. Utilice células THP-1 marcadas en la misma concentración. Para fabricar el dispositivo espiral microfluídico, primero prepare un molde maestro de obleas de silicona utilizando técnicas de microfabricación estándar.

A continuación, mezcle bien 30 gramos del prepolímero base PDMS y tres gramos de un agente de curado en un recipiente de pesaje. Desgasifique la mezcla al vacío durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire. Vierta la mezcla de PDMS en el molde maestro, con el patrón con el diseño del canal en espiral, con cuidado hasta una altura de cinco a 10 milímetros.

A continuación, desgasifique la mezcla durante 60 minutos para eliminar las burbujas de aire. Repite este proceso hasta que se eliminen todas las burbujas. A continuación, coloque la oblea en un horno y asegúrese de que la oblea no esté inclinada durante el curado, para garantizar una altura constante del dispositivo.

Cura el PDMS a 80 grados centígrados durante dos horas. Una vez frío, corte el dispositivo en espiral PDMS con un bisturí y retire con cuidado la losa de PDMS del molde maestro. A continuación, utilice un bisturí para recortar los bordes del dispositivo y garantizar una superficie lisa para la unión.

A continuación, utilice un punzón de biopsia de 1,5 milímetros para crear dos agujeros para las entradas y dos agujeros para las salidas. Lave el dispositivo con isopropanol para eliminar cualquier residuo. Y seque el dispositivo en un horno a 80 grados centígrados durante cinco minutos.

Luego, use cinta adhesiva para limpiar la superficie inferior del dispositivo PDMS y un lado de un portaobjetos de vidrio. Coloque con cuidado el portaobjetos de vidrio y el dispositivo PDMS en una cámara de plasma con las superficies limpias expuestas. Encienda la potencia del plasma al máximo, baje la presión de la cámara hasta que la cámara se vuelva de color rosa y exponga los componentes durante 60 segundos.

A continuación, retire el portaobjetos y el dispositivo PDMS de la cámara. Y unirlos presionando firmemente las superficies expuestas al plasma. Asegúrese de que no haya burbujas atrapadas entre las dos superficies.

Caliente el dispositivo adherido en una placa calefactora a 80 grados centígrados durante dos horas para fortalecer la unión. Corta dos pedazos de tubo de 15 a 20 centímetros de largo para las entradas y coloca una aguja de calibre 23 en un extremo de cada tubo. Luego, corte dos piezas del mismo tubo de cinco a 10 centímetros de largo para las salidas y conéctelas a los orificios de salida del dispositivo.

Antes de ejecutar la muestra, cebe manualmente el dispositivo con una jeringa que contenga un 70% de etanol hasta que fluya desde el tubo de salida. Deje que el etanol se asiente en el dispositivo durante al menos 30 segundos para esterilizarlo. Luego, cargue 30 mililitros de PBS filtrado con 1%BSA en una jeringa de 60 mililitros.

Además, cargue tres mililitros de células marcadas en una jeringa de tres mililitros y compruebe que no haya burbujas de aire atrapadas en ninguna de las jeringas. Elimine las burbujas de aire expulsando suavemente unas gotas de líquido de la boquilla. Conecte las puntas de las jeringas de entrada y el tubo a las jeringas y asegure las jeringas a las bombas de jeringa.

Inserte los tubos en sus respectivas entradas del dispositivo y asegúrese de que no haya burbujas a lo largo del tubo. Con los fluidos ya configurados, monte el dispositivo en un microscopio de contraste de fase invertida para obtener imágenes en tiempo real durante el proceso de clasificación de células. Asegure un pequeño vaso de precipitados y dos tubos de 15 mililitros cerca del dispositivo en la platina del microscopio.

Coloque el tubo de salida de ambas salidas del dispositivo en el vaso de precipitados de residuos. Ahora, establezca la relación de flujo entre la muestra y el tampón de la vaina de uno a 10 ajustando el caudal de la jeringa de muestra a 120 microlitros por minuto y la jeringa de la vaina a 1.200 microlitros por minuto. Haga funcionar el dispositivo durante un minuto y medio para que el caudal tenga la oportunidad de estabilizarse.

Utilice una cámara de alta velocidad para confirmar la presencia de células enfocadas inercialmente cerca de la pared interna del canal bajo campo claro con contraste de fase. Una vez que se alcanza el flujo de estado estacionario y el dispositivo funciona correctamente, coloque los tubos de salida en diferentes viales para recolectar eluyentes separados de la salida de la celda y la salida de desechos. Este dispositivo es capaz de separar correctamente una suspensión marcada de células monocíticas THP-1 de nanopartículas de sílice fluorescentes.

Se obtuvieron altas eficiencias de separación, como lo confirmaron tanto las imágenes de alta velocidad como el análisis de citometría de flujo. La estrategia de purificación de un solo paso permite la recuperación continua de una suspensión marcada y células adherentes que están suspendidas en una solución tampón fresca sin necesidad de centrifugación. El dispositivo es capaz de una separación de alta eficiencia con nanopartículas de sílice y PLGA y puede separar hasta 10 millones de células por mililitro con la misma alta eficiencia.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo etiquetar células con nanopartículas. Y cómo purificar las células marcadas eliminando el exceso de partículas no unidas utilizando nuestro dispositivo microfluídico especializado.