Cuentas de la separación y las células en varios canales de dispositivos de microfluidos Con dielectroforesis y de flujo laminar

El objetivo general de este procedimiento es manipular células y microesferas dentro de dispositivos microfluídicos utilizando electroforesis dieléctrica o DEP con placas de circuito impreso o PCB. Esto se logra primero diseñando y preparando los electrodos de PCB y los canales microfluídicos. El segundo paso del procedimiento consiste en preparar el ensamblaje microfluídico de PCB y las soluciones de microesferas y células.

El tercer paso del procedimiento consiste en llenar los canales con un medio de baja conductividad, luego cargar las perlas y las células. El paso final del procedimiento es conectar el ensamblaje de PCB con el amplificador de potencia y el generador de funciones, y luego iniciar la DEP. Finalmente, se pueden obtener resultados que muestran la separación y manipulación de células y perlas en dispositivos microfluídicos mediante el uso de DEP.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque el usuario debe comprender los principios de la DEP para desarrollar un electrodo eficaz que funcione con un dispositivo microfluídico para la manipulación de células o microesferas deseadas. Por otro lado, el uso de PCBs como electrodos hace que la actuación de células y microesferas en dispositivos microfluídicos sea accesible para una amplia gama de disciplinas científicas. El primer paso de este procedimiento consiste en diseñar los electrodos de circuito impreso, o PCB, con la geometría deseada para generar un campo eléctrico no uniforme.

Cuando el diseño esté completo, solicite los chips de electrodos de PCB personalizados a través de una instalación comercial de fabricación. Después de que llegue el PCB personalizado, ábralo e inspecciónelo para esta demostración. El PCB mide 8,4 centímetros de largo y 2,1 centímetros de ancho.

Los electrodos metálicos tienen un ancho de cinco milímetros. En este ejemplo, los electrodos presentan dos tiras metálicas largas y dos regiones transversales de 4,5 milímetros de longitud donde los electrodos están interdigitados. Estas regiones interdigitadas generan un campo eléctrico no uniforme intenso para crear una conexión desde el estimulador hasta el electrodo del PCB.

Coloque un alambre de calibre 16 en el extremo del electrodo. Utilice un soldador caliente para mantener el alambre en su lugar sobre la zona metálica del PCB. Esto calienta el alambre.

Sostenga el estaño en el alambre calentado y permita que una pequeña cantidad de estaño fluya hacia el alambre. Una vez que el alambre esté lleno de estaño, retire el soldador sosteniendo el alambre en su lugar mientras el estaño se enfría. Repita el proceso de soldadura para la otra conexión eléctrica en la PCB.

El siguiente paso consiste en preparar canales microfluídicos con el patrón de ramificación deseado. Mediante técnicas estándar de microfabricación, cree un molde maestro para definir los canales utilizando una oblea de silicio y el fotopolímero SU eight. Este molde maestro tiene un canal de entrada y tres canales objetivo.

El ancho de los canales es de 100 micrómetros y la altura de los canales es de 27 micrómetros. Una vez creado el molde maestro, mezcle el elastómero de polimetil LAANE o PDMS con un agente de curado en una proporción de 10 a 1 en peso durante cinco minutos. Vierta el PDMS líquido sobre el molde maestro SU-8 prefabricado y elimine las burbujas de aire exponiendo el PDMS líquido al vacío durante tres minutos.

Repita el proceso de vacío si es necesario para eliminar completamente todas las burbujas. Se puede utilizar una corriente de gas nitrógeno para eliminar burbujas adicionales si es necesario. Cure el PDMS en un horno a 70 grados Celsius durante dos horas.

Utilice una cuchilla de afeitar para retirar el laboratorio P-D-M-S-S con los canales microfluídicos del oblea. Tenga cuidado de no romper el oblea con el espacio del canal hacia arriba. Utilice un punzón de biopsia para hacer orificios destinados a la introducción de fluidos y células en el dispositivo microfluídico. Recorte.

Cualquier exceso de PDMS. Inspeccione el dispositivo microfluídico para asegurarse de que esté libre de polvo y residuos. Utilice cinta adhesiva 3M Scotch Magic para limpiar el PDMS.

Someta los canales de PDMS y una cubreobjetos limpia número cero con un grosor de 80 a 130 micrómetros a gas de plasma durante 1,5 minutos. Retire el laboratorio de PDMS y la cubreobjetos del limpiador de plasma en una placa de Petri; una mediante enlace de plasma los canales microfluídicos de PDMS con la cara hacia abajo sobre la cubreobjetos. Caliente el ensamblaje microfluídico de cubreobjetos en una placa calefactora ajustada a 100 grados Celsius durante un mínimo de 15 minutos. El paso final en la preparación del dispositivo microfluídico consiste en colocar los canales de PDMS y la cubreobjetos sobre los electrodos del PCB.

Comience colocando aproximadamente 10 microlitros de aceite mineral sobre el PCB. Para garantizar un contacto estrecho entre el PCB y la cubreobjetos, coloque el ensamblaje del canal microfluídico con la cubreobjetos sobre el PCB aceitado, con la cubreobjetos hacia abajo. Al entrar en contacto con el aceite, presione suavemente hacia abajo el ensamblaje microfluídico con la cubreobjetos para asegurar un buen contacto y minimizar las burbujas de aire, que pueden dificultar la visualización de células y perlas.

Otro paso importante es preparar la mezcla de medio de baja conductividad, 8,5 % de sacarosa y 0,3 % de glucosa peso por volumen en agua desionizada. El dispositivo microfluídico ya está listo para su uso; con una pipeta, llene cada canal microfluídico con 15 a 20 microlitros del medio de baja conductividad, si es necesario. Utilice aspiración al vacío para eliminar cualquier burbuja en los canales.

El siguiente paso consiste en introducir las partículas de prueba en el dispositivo microfluídico. Esta demostración utiliza una suspensión de 550 microesferas de poliestireno por microlitro de medio de baja conductividad, ya que con el tiempo las microesferas pueden sedimentar; suspenda las microesferas agitando. Luego, mediante una pipeta, introduzca 200 microlitros de la suspensión de microesferas de poliestireno en el canal.

El siguiente paso consiste en preparar los electrodos, conectar la salida de un generador de funciones a la entrada de un amplificador de corriente alterna. Luego, conectar la salida del amplificador a los cables de los electrodos. Cubrir todos los cables eléctricos y las superficies expuestas del montaje con cinta aislante para proteger a los usuarios de posibles descargas eléctricas.

Configure el generador de funciones para producir una salida de onda sinusoidal de uno a 1,5 megahercios. Inicie la DEP para comenzar a separar las células y perlas en este montaje. El canal de entrada está a la derecha y los tres canales objetivo se separan en la unión trifurcada.

Los electrodos de PCB corresponden a las franjas negras sin flujo laminar y sin DEP. Las perlas son esencialmente estacionarias al iniciarse la DEP, pero sin flujo. Las perlas migran hacia los electrodos de PCB y lejos del espacio entre los electrodos cuando el flujo laminar está activado.

Pero cuando el DEP está desactivado, las perlas que fluyen a través de los canales de entrada se dividen entre los tres canales objetivo. Cuando se inicia el DEP y el flujo laminar está activado, las perlas se manipulan para que fluyan únicamente por el canal central. En los siguientes videos, el dispositivo microfluídico fue rotado por encima de los electrodos del PCB, lo que provocó un cambio en la orientación de los canales.

Con respecto a los electrodos de PCB. El canal de entrada, que anteriormente era perpendicular a los electrodos de PCB, ahora es casi paralelo a los electrodos con el flujo laminar activado. Pero con el DEP desactivado, las perlas ingresan por igual a los tres canales objetivo.

Cuando se inicia la DEP, las perlas se acercan al punto de trifurcación y la fuerza de DEP atrae a las perlas hacia el canal lateral situado sobre el electrodo. Este siguiente conjunto de figuras en el video muestra una mezcla de células de adenocarcinoma de colon humano o células HT 29 y perlas fluorescentes en el dispositivo microfluídico. En esta imagen de DIC, la flecha abierta indica la dirección del flujo laminar, y los canales están delineados con líneas discontinuas.

Los electrodos metálicos reflectantes pueden observarse como una franja de fondo claro; se utiliza microscopía DIC para imaginar las perlas mientras emiten luz. Intensidad de escala. Las imágenes se utilizan para hacer que las células sean más visibles.

Esta figura es la misma imagen que la otra figura, excepto que se muestra como una imagen de intensidad en escala de brillo, por lo que permite visualizar tanto las células como las microesferas. Los electrodos metálicos reflectantes aparecen como franjas amarillas y verdes en esta figura. Con DEP, las microesferas salen por el canal derecho, tal como se muestra en la imagen DIC, mientras que las células HT 29 salen por los canales central e izquierdo, tal como se observa en la imagen de escala de brillo antes de iniciar el DEP. Una solución mixta de células y microesferas fluye desde un canal de entrada hacia tres canales objetivo separados.

Después de inducir el DEP, las perlas y las células se actúan selectivamente hacia canales separados. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo comenzar a implementar la electroforesis diferencial para la manipulación de células y perlas dentro de dispositivos microfluídicos.