Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

El objetivo general de este protocolo experimental es proporcionar un procedimiento no invasivo y técnicamente no intensivo para inducir neumonía bacteriana en ratones y la posterior cuantificación de la respuesta de defensa del huésped in vivo en los pulmones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de las enfermedades infecciosas y la inmunología, sobre los genes y las vías moleculares que controlan la respuesta del huésped a la infección. La principal ventaja de este método de infección pulmonar es su simplicidad técnica.

Lo que permite que incluso los laboratorios con poca experiencia en procedimientos pulmonares estudien la respuesta inmunitaria innata pulmonar. En una instalación de nivel dos de bioseguridad, descongele una reserva de glicerol de K. pneumoniae y transfiera un mililitro de la bacteria a un matraz de cultivo de 500 mililitros que contenga 50 mililitros de caldo de soja tríptico. Incubar el cultivo en suspensión durante la noche a 37 grados centígrados y de 200 a 225 RPM.

A la mañana siguiente, diluya de uno a cinco mililitros del cultivo bacteriano en un matraz nuevo que contenga 50 mililitros de caldo de soja tríptico e incube el cultivo, en el agitador, a 37 grados centígrados durante 2,5 horas adicionales para alcanzar la fase logarítmica. Al final de la segunda incubación, transfiera un mililitro de bacterias del segundo cultivo a un tubo de 1,5 mililitros para la centrifugación. Retire el sobrenadante sin alterar la paleta y vuelva a suspender suavemente las bacterias en un mililitro de solución salina estéril durante tres lavados separados.

Después del tercer lavado, vuelva a suspender las bacterias en otro mililitro de solución salina estéril y establezca diluciones en serie logarítmicas del inóculo. Mida un mililitro de las diluciones de uno a 10 y de uno a 100 en cubetas desechables, por duplicado, para determinar el OD600 de la K. pneumoniae lavada. Un OD600 de 1,0 equivale aproximadamente a cuatro a siete veces 10 por la octava UFC por mililitro.

Después de calcular la concentración de las bacterias en cada dilución, resuspender la dosis deseada de UFC de inóculo en 50 a 60 microlitros de solución salina estéril por animal receptor de ocho a 12 semanas de edad. Para administrar las bacterias a los animales, extraiga el inóculo dosificador en una punta de pipeta P200 y coloque el ratón anestesiado en posición supina semi-reclinada, suspendido por los incisivos maxilares, de una banda elástica estirada entre las clavijas de una tabla de plexiglás inclinada. Con un par de pinzas romas y no estriadas, tire suavemente de la lengua hacia un lado y deposite la dosis en la cavidad bucal del animal, teniendo cuidado de evitar inducir un traumatismo en la lengua o la faringe oral.

Manteniendo la lengua retraída, ocluya suavemente la nariz con un dedo enguantado, hasta que la casa inhale dos o tres veces. Cuando no haya líquido visible en la cavidad oral, transfiera al ratón de la placa de inoculación a su jaula, en posición supina, para evitar la obstrucción de las fosas nasales mientras el ratón se recupera. Haz un corte longitudinal justo debajo del esternón.

Luego, levantando el esternón con fórceps, corte el diafragma, permitiendo que el pulmón vuelva a caer en la cavidad torácica. Continúe la incisión hacia arriba a través de la cavidad torácica a cada lado de la vasculatura y hacia arriba a través del cuello. Cuando la tráquea sea visible, corte con cuidado la mitad del cuello y empuje el tejido hacia los lados para evitar dañar la vasculitura circundante.

Ahora corte la tráquea aproximadamente un cuarto del camino hacia abajo desde la cabeza, e inserte caudalmente una cánula conectada a una jeringa de un mililitro precargada con un mililitro de PBS en la tráquea. Empuje el volumen hacia los pulmones, lentamente, permitiendo que todos los lóbulos se inflen. A continuación, retira el volumen con la jeringa y agrupa los lavados recogidos en un tubo de 15 mililitros, con hielo.

En el punto final experimental apropiado, recoja la sangre del ventrículo izquierdo y transfiérala a un tubo heparinizado para evitar la coagulación. Luego, coseche todos los lóbulos pulmonares en un tubo de 15 mililitros que contiene cinco mililitros de PBS, y el bazo en un tubo de 15 mililitros que contiene dos mililitros de PBS. A continuación, utilice homogeneizadores individuales y desechables por muestra, para macerar los tejidos en hielo, seguido de una dilución en serie de los lodos de tejido.

Coloque las diluciones, por duplicado, en lados separados de una sola placa TSA y deje que las muestras se sequen brevemente. A continuación, invierta las placas y cultive las muestras en una incubadora estática a 37 grados centígrados durante la noche, promediando las colonias bacterianas de ambos lados de la placa y de cada dilución a la mañana siguiente. A las 2000 UFC de K. pneumoniae, los ratones, típicamente, comienzan a mostrar síntomas clínicos de 12 a 24 horas después de la infección.

Dentro de las 48 a 72 horas, muchos de los animales exhiben síntomas de enfermedad y morbilidad que generalmente son precedidos por un promedio de pérdida de peso del 20 por ciento. Sin embargo, una dosis de DL50 permite detectar tanto el aumento como la disminución de la supervivencia en el grupo experimental, y puede ser preferible para estudios a más largo plazo. La infección del tracto respiratorio inferior por K. pneumoniae se caracteriza por una fuerte afluencia de leucocitos a las vías respiratorias dentro de las seis horas posteriores a la infección, que alcanza su punto máximo a las 24 horas y está representada principalmente por neutrófilos.

Las citocinas son detectables en el líquido de lavado broncoalveolar tanto 24 como 48 horas después de la infección por K. pneumoniae, y proporcionan información sobre el microambiente pulmonar y su autoreclutamiento inmunitario en respuesta a la invasión bacteriana. La carga bacteriana en el pulmón, la sangre y el bazo también aumenta drásticamente entre las 24 y las 48 horas de la infección. Una vez dominado, el método de aspiración orofaríngea de la infección pulmonar se puede realizar en solo uno o dos minutos por ratón si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no debe utilizar un volumen de aspiración excesivo. Un volumen de 50 a 60 microlitros suele funcionar bien para un ratón de ocho a 12 semanas. Después de este procedimiento, se pueden realizar una variedad de métodos en el pulmón y los tejidos periféricos para permitir la cuantificación de la respuesta inmune en la eliminación del patógeno.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir neumonía bacteriana experimental a través de la administración de patógenos orofaríngeos y determinar la carga de patógenos en ratones. No olvide que trabajar con microbios puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones y prácticas básicas de BSL-2 mientras se realiza este procedimiento.