Un método no invasivo y técnicamente no intensivos para la inducción y Fenotipificación Experimental de neumonía bacteriana en ratones

El objetivo general de este protocolo experimental es proporcionar un procedimiento no invasivo y técnicamente poco intensivo para inducir neumonía bacteriana en ratones y la posterior cuantificación de la respuesta de defensa del huésped in vivo en los pulmones. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de las enfermedades infecciosas y la inmunología, sobre los genes y las vías moleculares que controlan la respuesta del huésped a la infección. La principal ventaja de este método de infección pulmonar es su simplicidad técnica.

Lo que permite incluso a laboratorios con poca experiencia en procedimientos pulmonares estudiar la respuesta inmune innata pulmonar. En una instalación de nivel de seguridad biológica dos, descongele un stock de glicerol de K. pneumoniae y transfiera un mililitro de las bacterias a un matraz de cultivo de 500 mililitros que contenga 50 mililitros de caldo de soya tripticasa. Incube el cultivo en suspensión durante la noche a 37 grados Celsius y entre 200 y 225 RPM.

Al día siguiente, diluya de uno a cinco mililitros de la cultivo bacteriano en un matraz nuevo que contenga 50 mililitros de caldo de soya triptica, e incube el cultivo, en el agitador, a 37 grados Celsius durante 2,5 horas adicionales para alcanzar la fase logarítmica. Al final de la segunda incubación, transfiera un mililitro de bacterias del segundo cultivo a un tubo de 1,5 mililitros para centrifugación. Retire el sobrenadante sin perturbar el pellet y resuspenda suavemente las bacterias en un mililitro de solución salina estéril para tres lavados separados.

Después del tercer lavado, resuspenda las bacterias en otro mililitro de solución salina estéril y prepare diluciones seriadas logarítmicas del inóculo. Mida un mililitro de las diluciones uno a 10 y uno a 100 en cubetas desechables, por duplicado, para determinar la DO600 de K. pneumoniae lavada. Una DO600 de 1,0 es aproximadamente equivalente a cuatro a siete veces 10 a la octava UFC por mililitro.

Después de calcular la concentración de las bacterias en cada dilución, reconstituya la dosis deseada de UFC del inóculo en 50 a 60 microlitros de solución salina estéril por animal receptor de ocho a doce semanas de edad. Para administrar las bacterias a los animales, aspire el inóculo de dosificación en una punta de pipeta P200 y coloque el ratón anestesiado en posición supina semiflexionada, suspendido por los incisivos maxilares, de una banda de goma estirada entre los pernos de una tabla de Plexiglás inclinada. Utilizando un par de pinzas romas sin estrías, tire suavemente de la lengua hacia un lado y deposite la dosis en la cavidad oral del animal teniendo cuidado de evitar provocar traumatismos en la lengua o en la faringe oral.

Manteniendo la lengua retraída, ocluya suavemente la nariz con un dedo enguantado hasta que el animal inhale dos o tres veces. Cuando no se observe líquido en la cavidad oral, transfiera el ratón desde la tabla de inoculación a su jaula, en posición supina, para evitar el bloqueo de las fosas nasales mientras el ratón se recupera. Realice un corte longitudinal justo por debajo del esternón.

Luego, levantando el esternón con pinzas, haga un corte en el diafragma, permitiendo que el pulmón vuelva a la cavidad torácica. Continúe la incisión hacia arriba por ambos lados de la vasculatura y a través del cuello. Cuando sea visible la tráquea, corte cuidadosamente por la mitad del cuello y desplace los tejidos hacia los lados para evitar dañar la vasculatura circundante.

Ahora haga una pequeña incisión en la tráquea aproximadamente a un cuarto del camino desde la cabeza, e inserte caudalmente una cánula conectada a una jeringa de un mililitro precargada con un mililitro de PBS en la tráquea. Introduzca lentamente el volumen en los pulmones, permitiendo que todos los lóbulos se inflen. Luego, retire el volumen con la jeringa y reúna los lavados recolectados en un tubo de 15 mililitros, sobre hielo.

En el punto final experimental adecuado, recolecte la sangre del ventrículo izquierdo y transfiérala a un tubo heparinizado para evitar la coagulación. Luego, recolecte todos los lóbulos pulmonares en un tubo de 15 mililitros que contenga cinco mililitros de PBS, y el bazo en un tubo de 15 mililitros que contenga dos mililitros de PBS. A continuación, utilice homogenizadores individuales y desechables por muestra para macerar los tejidos sobre hielo, seguido de diluciones seriadas de las suspensiones tisulares.

Siembre las diluciones, en duplicado, en lados separados de una sola placa de TSA y deje que las muestras sequen brevemente. Luego, invierta las placas y cultive las muestras en un incubador estático a 37 grados Celsius durante la noche, promediando al día siguiente por la mañana las colonias bacterianas de ambos lados de la placa y de cada dilución. Con 2000 UFC de K. pneumoniae, los ratones generalmente comienzan a mostrar síntomas clínicos entre 12 y 24 horas posteriores a la infección.

En un período de 48 a 72 horas, muchos de los animales presentan síntomas de enfermedad y morbilidad que generalmente se anteceden por una pérdida de peso promedio del 20 por ciento. Sin embargo, una dosis de LD50 permite detectar tanto el aumento como la disminución relativos de la supervivencia dentro del grupo experimental, y puede ser preferida para estudios a más largo plazo. La infección del tracto respiratorio inferior con K. pneumoniae se caracteriza por una afluencia robusta de leucocitos hacia las vías respiratorias dentro de las seis horas posteriores a la infección, que alcanza su punto máximo a las 24 horas y está representada principalmente por neutrófilos.

Las citocinas son detectables en el líquido de lavado broncoalveolar a las 24 y 48 horas posteriores a la infección con K. pneumoniae, y proporcionan información sobre el microentorno pulmonar y su reclutamiento inmunitario propio en respuesta a la invasión bacteriana. La carga bacteriana en el pulmón, la sangre y el bazo también aumenta drásticamente entre las 24 y 48 horas de infección. Una vez dominado, el método de aspiración orofaríngea para la infección pulmonar puede realizarse en tan solo uno a dos minutos por ratón si se lleva a cabo correctamente.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar no utilizar un volumen de aspiración excesivo. Un volumen de 50 a 60 microlitros suele funcionar bien para un ratón de ocho a doce semanas de edad. Tras este procedimiento, se pueden realizar diversos métodos en el tejido pulmonar y en los tejidos periféricos para permitir la cuantificación de la respuesta inmunitaria en la eliminación del patógeno.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo inducir neumonía bacteriana experimental mediante la administración orofaríngea de patógenos y de cómo determinar la carga de patógenos en ratones. No olvide que trabajar con microorganismos puede ser peligroso y que siempre se deben tomar precauciones y prácticas básicas de BSL-2 al realizar este procedimiento.