Aislamiento y purificación de células B de sangre periférica humana

Para realizar la separación inmunomagnética negativa de las células B, recolecte sangre periférica humana en un tubo que contenga anticoagulante para evitar la coagulación de la sangre. Agregue glóbulos rojos, glóbulos rojos, tampón de lisis para lisar los glóbulos rojos sin afectar a otras células sanguíneas.

Centrifugar para sedimentar las células sanguíneas intactas y más densas de los glóbulos rojos lisados menos densos, que permanecen en el sobrenadante. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el gránulo en medio fresco.

Transfiera las células a una placa de cultivo. Incubar para permitir que los macrófagos y monocitos se adhieran a la placa mientras las células no adherentes, incluidas las células B, permanecen en suspensión.

Recoja las células en suspensión en un tubo nuevo. Centrifugar para granular las células y volver a suspenderlas en un tampón.

Agregue una solución de cóctel que contenga anticuerpos biotinilados específicos para células sanguíneas que no sean células B. Los anticuerpos se unen a los antígenos en la superficie de las células no B, dejando las células B sin marcar.

centrífuga. Deseche el sobrenadante que contiene anticuerpos no unidos.

Agregue una solución de perlas magnéticas conjugadas con estreptavidina. Durante la incubación, la estreptavidina de las microperlas se une fuertemente a los anticuerpos biotinilados unidos a las células no B, formando complejos.

Coloque el tubo en un campo magnético para adherir las células no B unidas a perlas magnéticas a las paredes del tubo, dejando las células B en suspensión. Transfiera el sobrenadante que contiene células B puras a un tubo.

Centrifugar y volver a suspender las células B en medio para un análisis posterior posterior.

Inmediatamente después de obtener una muestra de sangre de 10 mililitros de la vena cubital mediana en un tubo de 15 mililitros que contiene EDTA suplementado con potasio, invierta el tubo varias veces para evitar la formación de coágulos. Luego, agregue 35 mililitros de tampón de lisis de glóbulos rojos esterilizado en autoclave a las células para una incubación de 5 minutos a temperatura ambiente.

Cuando se pueda observar luz a través del tubo, centrifugar la sangre y confirmar la presencia de un gránulo blanco. Retire el tampón de lisis residual con 10 mililitros de autoclave a PBS y vuelva a suspender el sedimento en 10 mililitros de medio RPMI 1640.

Coloque las células en una placa de cultivo de 10 centímetros para una incubación de 30 minutos a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5%. Luego, agite suavemente la placa de cultivo varias veces y transfiera las células flotantes a un tubo cónico de plástico de 15 mililitros.

Después de dos lavados por centrifugación, vuelva a suspender el gránulo a una concentración de 5 a 10 x 10⁶ células por mililitro en 200 microlitros de tampón PBS frío y agregue 5 microlitros de cóctel de anticuerpos antihumanos biotinilados específico para células sanguíneas por 1 x 10⁶ células.

Después de una incubación de 30 minutos en hielo, lave las células en un volumen de exceso de 10 veces de PBS estéril y vuelva a suspender el gránulo en 5 microlitros de microperlas conjugadas con estreptavidina por 1 x 10⁶ células para una incubación de 30 minutos en hielo. Al final de la incubación, agregue 2 mililitros de tampón PBS a las células y coloque el tubo en un soporte magnético durante 8 minutos a temperatura ambiente.

Cuando las microperlas se hayan adherido a la pared del tubo, transfiera con cuidado el sobrenadante a un nuevo tubo cónico y agregue 2 mililitros más de tampón PBS a las células. Después de la segunda recolección de sobrenadante, recolecte las células agrupadas por centrifugación y transfiera las células a un tubo de poliestireno de 5 mililitros en tampón PBS fresco a una concentración de 1 x 10 7 células por mililitro.