Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo hepático tridimensional para estudiar virus y vectores virales. Este método permite el estudio de los procesos biológicos en un sistema tridimensional vascularizado con células humanas que difieren en su fisiología de las células de roedores en un modelo de ratón o rata. Además, es un paso para mejorar el bienestar animal, ya que evita los experimentos con animales vivos y, a largo plazo, está destinado a reemplazar completamente los componentes animales.

Aunque desarrollamos este método para estudiar vectores virales para la transferencia de genes, también se puede aplicar al estudio de virus vitales infecciosos y otras áreas de investigación, como la investigación del cáncer. La demostradora del procedimiento estará a cargo de Viola Rohrs, una técnica de mi laboratorio. En aras del bienestar animal, para el presente estudio solo se utilizaron animales sobrantes que se sacrificaron para otros experimentos con animales, es decir,

no se necesitaron animales adicionales para obtener los andamios hepáticos. Para empezar, primero hay que ampliar la línea celular hepática Hep G2. Siembre 15 millones de células en frascos T175 en 30 mililitros de medio que contengan 10% de suero fetal de ternera y dos milimoles de gulatmina, penicilina y estreptomicina. Después de cuatro días de cultivo, use cinco minutos de exposición a la solución de tripsina en condiciones de cultivo para aflojar las células y luego recosechálas.

A continuación, gire las celdas a 300 G durante tres minutos. Luego vuelva a suspenderlos en cuatro mililitros de PBS y obtenga un recuento de células. Cada frasco debe producir alrededor de 45 millones de células.

Se necesitan 600 millones de células para recelularizar una MEC de hígado de rata. Para recelularizar el ECM, primero configure el sistema de biorreactor que contiene una cámara de profusión hepática, un sistema de profusión, un depósito de medio y una trampa de burbujas. Hay dos pasos críticos en el procedimiento de recelularización.

Una es evitar atrapar burbujas de aire en el sistema de profusión. La segunda es que todo el sistema debe mantenerse estéril. En primer lugar, esterilizar estos componentes del sistema del biorreactor a 121 grados centígrados durante 15 minutos.

En segundo lugar, llene los tubos y la cámara de profusión esterilizada con medio. A continuación, coloque el andamio hepático de rata descelularizado en la cámara de profusión hepática. El siguiente paso es usar clips de tubo para conectar la vena porta canulada al sistema de profusión.

Ahora coloque el sistema de biorreactor en la incubadora y conéctelo a una bomba peristáltica. A continuación, equilibre el andamio con 150 mililitros de medio suplementado durante cinco días. Ajuste el caudal a 1,25 mililitros por minuto.

Después de cinco días, desconecte el sistema de biorreactor de la bomba y transfiéralo a una campana estéril. Desconecte el andamio hepático del circuito de medios. A continuación, cargue una jeringa con cinco mililitros de medio que contenga 300 millones de células Hep G2 e inyecte las células a través de la vena porta, evitando la formación de burbujas de aire.

A continuación, permita que las células vuelvan a poblar el ECM durante una hora sin hacer funcionar la bomba. Después de una hora, encienda la bomba a 1,25 mililitros por minuto. Después de 10 minutos, aumente la presión a 2,5 mililitros por minuto.

Después de 20 minutos más, ajuste la bomba a la velocidad de funcionamiento de 3,75 mililitros por minuto. Después de 30 minutos a la velocidad máxima de la bomba, apague la bomba, agregue otros 300 millones de celdas y deje que las celdas llenen el ECM durante una hora. Después de una hora, aumente gradualmente la circulación mediante ajustes incrementales de la velocidad de la bomba como antes.

Ahora deje que el cultivo recelularice el hígado durante dos semanas. Cada dos días, reemplace 50 mililitros del medio y mida los parámetros fisiológicos de una muestra del medio usado. La producción de vectores AAV es un procedimiento complicado que implica muchos pasos que se resumen en el protocolo de texto.

En esta sección del video, se muestran algunos de los pasos cruciales. En primer lugar, producir, purificar y cuantificar los vectores AAV. Produzca brevemente los vectores AAV en botellas de rodillo y purifíquelos mediante centrifugación en gradiente de iodixanol.

Elimine el iodixanol residual mediante filtración a través de columnas de filtración de gel PD10. A continuación, determine la concentración del vector AAV mediante QPCR utilizando el ADN genómico de AAV como estándar. Se necesitan un total de 27 billones de vectores AAV por modelo.

Ahora transducimos el modelo del hígado. Primero, cargue 27 billones de vectores en cinco mililitros de PBS en una jeringa. El rojo de fenol se puede agregar a 5 microgramos por mililitro.

A continuación, desconecte el hígado del circuito de medios e inyecte los vectores en el sistema. Una vez inyectado, incubar el sistema durante una hora sin bombeo. A continuación, aumente gradualmente el caudal como se ha descrito anteriormente.

Más tarde, a medida que el hígado transducido se incuba durante seis días, cambie 50 mililitros del medio cada dos días. Con un bisturí, corte muestras de cada lóbulo del hígado que tengan aproximadamente medio centímetro de grosor y de 1,5 a dos centímetros de largo. Incubar las rodajas en 4% de paraformaldehído con 4% de sacarosa durante 90 minutos a cuatro grados centígrados.

A continuación, lave la muestra tres veces con PBS durante un minuto por lavado. Después de los lavados, incube las muestras durante la noche en sacarosa al 8% a cuatro grados centígrados. Al día siguiente, cargue las muestras en criomoldes que contengan algún medio de fijación.

Evite introducir burbujas de aire. Una vez cargadas, cubra completamente las muestras con medio de fijación y colóquelas a menos 80 grados centígrados. Una vez congeladas, prepare criosecciones de 10 micras a partir de las muestras utilizando un criótomo.

Tiñir las muestras según sea necesario para confirmar la recelularización. Para el análisis de la expresión génica, tome muestras con un punzón de biopsia de cuatro milímetros. Para evaluar la recelularización, las criosecciones se tiñeron con hematoxilina y eosina.

Los lóbulos de dos hígados transducidos y un hígado de control que fue recelularizado pero no transducido fueron repoblados con células Hep G2. Se cuantificó la expresión de ARN y el título vectorial a partir de 28 biopsias de punch de cada modelo hepático. En los dos modelos de hígado transducidos, se midieron 55 y 90 genomas de vectores por célula, que es suficiente vector para inducir el silenciamiento génico.

No se midieron genomas en el control, como se esperaba. La expresión de EmGFP se analizó mediante RT-PCR y western blot. La mayoría de las biopsias mostraron expresión de ARNm de EmGFP y expresión de proteínas de EmGFP.

La inmunoposición de las criosecciones mostró que, dondequiera que el modelo se recelularizara con éxito, también se podía ver la expresión de EmGFP. Esto es indicativo de una buena expresión del gen AAV. A continuación, se analizó la eliminación mediada por AAV de la ciclofilina B humana mediante RT-PCR cuantitativa.

La reducción media de la ciclofilina B humana fue de entre el 70 y el 90% en todos los lóbulos de los dos hígados transducidos. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran la distribución de virus y vectores virales en el sistema de órganos vascularizados y tridimensionales. Estos estudios ayudarán a mejorar las técnicas actuales de transferencia de genes y a desarrollar nuevas estrategias antivirales.