Name: Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-10-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 13 s
Description: Aprenda a desarrollar un modelo hepático tridimensional recelularizado con HepG2 para estudiar vectores virales AAV. Este método reduce el uso de animales vivos y mejora la relevancia fisiológica en investigación de terapia génica.

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Los autores agradecen a Bernd Krostitz por su asistencia técnica, a Radoslaw Kedzierski por sus contribuciones iniciales al proyecto, a Erik Wade por corregir y hacer comentarios útiles, y a la Prof. Heike Walles por proporcionar el biorreactor y compartir su valiosa experiencia con la descelularización de órganos. También estamos agradecidos por la financiación del proyecto y la publicación por parte de la Universidad Tecnológica de Berlín.

NOTA: RL obtuvo la aprobación ética para el explante de órganos de la Landesamt für Gesundheit und Soziales (LaGeSo). Los hígados fueron explantadas de ratas Wistar. La vena cava inferior y la vena portal del hígado fueron canuladas con una cánula 22 G. Los métodos para la descelularización de hígados explantados se han descrito anteriormente. 4,5 Las matrices extracelulares utilizados aquí se obtuvieron mediante perfusión excesiva de un hígado de rata con desoxicolato de sodio al 1%. 1. recelularización de la matriz extracelular (ECM) de un hígado de rata <ol><li> Expansión de la línea celular HepG2 hepática <ol><li> Cultura la línea celular de carcinoma hepatocelular HepG2 en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 10% de suero de ternero fetal, glutamina 2 mM, y 2 mM de penicilina y estreptomicina, cada uno. </li><li> Sembrar 1,5 x 10 7 células en frascos T175 y hacer crecer las células a 37 ° C y 5% de CO2 </sub&gt;. Las células de la cosecha después de 4 días de tratamiento con tripsina durante 5 min a 37 ° C, 5% de CO 2. </li><li> Centrifugar las células a 300 xg y volver a suspender en 4 ml de PBS y contar las células con una cámara de Neubauer bajo un microscopio. Una botella T175 producirá aproximadamente 4,5 x 10 7 células. NOTA: Asegúrese de que el cultivo contiene el número de células suficientes para recelularización de la ECM de hígado de rata con 6 x 10 8 células HepG2 por ECM (10 x 175 cm 2 frascos de cultivo con 4-5 x 10 8 células de cada uno). </li></ol></li></ol><img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig1.jpg" /> Figura 1. El sistema de biorreactor. A) Este sistema de biorreactor fue medida. Mantiene los modelos de órganos a 37 ° C y 5% de CO2. Los caudales de las bombas peristálticas pueden ser reguladas individualmente. B) El hígado se coloca en una cámara de crecimiento y se conectaned al circuito de perfusión, que consiste en una bomba peristáltica, un contenedor de medios, una trampa de burbujas y un sensor de presión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> Recelularización de la MEC <ol><li> Establecer el sistema de biorreactor, que contiene una cámara de perfusión hepática, un sistema de perfusión, un depósito de medio y una trampa de burbujas. Esterilizar el sistema de biorreactor (121 ° C, 15 min). </li><li> Conectar el sistema de biorreactor con una bomba peristáltica y colocarlo en una incubadora proporcionando las condiciones adecuadas (37 ° C, 5% de CO 2). Coloque los andamios de hígado de rata descelularizado 8 en la cámara de perfusión del hígado del sistema de biorreactor (Figura 1). </li><li> Conectar la vena porta y la vena cava canulado con clips de tubo para el sistema de perfusión. Equilibrar andamio con 150 ml de medio RPMI (como se describe en 1.1)durante 5 d con una velocidad de flujo de 1,25 ml / min. </li><li> Desconectar el andamio hígado desde el circuito de los medios de comunicación e inocular el andamio con 3 x 10 8 células HepG2 (en 5 ml) a través de la vena portal utilizando una jeringa de 5 ml, evitar la formación de burbujas de aire y permitir que las células para repoblar la ECM por incubación de las mismas para 1 h en el andamio con la bomba desconectada. </li><li> Aumentar gradualmente la velocidad de flujo mediante el ajuste de la bomba, a partir de 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min y, finalmente, 3,75 ml / min durante 30 min. </li><li> Repita los pasos 1.2.4-1.2.5 para llegar a un número total de células de 6 x 10 8. </li><li> Ejecutar el sistema de biorreactor con un caudal de 3,75 ml / min. Cultura del hígado de la rata recelularizado durante 2 semanas. Nota: reemplazar un tercio del medio con medio fresco (50 ml) cada dos días. Muestra el medio de cultivo para medir parámetros fisiológicos, como la actividad de lactato deshidrogenasa, el pH de muestras de medio y la concentración de glucosa y lactato. </li></ol></li></ol> 2. La transducción de la rata de hígado recelularizado <ol start="1"><li> La producción a gran escala de vectores AAV <ol><li> Producir, purificar y cuantificar vectores AAV como se ha descrito anteriormente: 11 <ol><li> En pocas palabras, producir vectores AAV en botellas de rotación y purificarlos por centrifugación en gradiente de iodixanol. Eliminar iodixanol residual por filtración sobre PD10 columnas de filtración en gel. Determinar la concentración de vector de AAV por qPCR utilizando ADN genómico de AAV como un estándar. NOTA: La auto-complementaria, pseudotyped AAV2 / 6 vector utilizado en el presente estudio codificado EmGFP como reportero para demostrar la eficacia de transducción y un casete de expresión shRNA por la caída de un gen expresado de forma endógena (ciclofilina B humana (hCycB), la Figura 2) . Asegurar una cantidad suficiente de vectores pseudotyped VAAac de serotipo 6 (2,7 x 10 13 vectores AAV por modelo hígado). </li></ol></li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig2.jpg" /> Figura 2. Mapa de la auto-complementaria, pseudotyped AAV2 / 6 vector utilizado en el presente estudio. El genoma consiste en las repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV2 y codifica EmGFP bajo el control del promotor de CMV, así como un shRNA bajo control de un promotor U6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol start="2"><li> La transducción de hígado Modelo <ol><li> Ajustar la solución del vector AAV a una concentración final de 2,7 x 10 13 genomas de vector en 5 ml añadiendo el volumen respectivo de PBS. </li><li> Desconectar el hígado desde el circuito de los medios de comunicación mediante la eliminación del tubo de la cánula. Conectar una jeringa de 5 ml a la cánula de la vena portal e inyectar la solución del vector AAV completa (5 ml). NOTA: Optionally, poner rojo fenol (5 g / ml) para seguir la distribución de la solución del vector AAV por todo el hígado. </li><li> Incubar durante 1 hora sin bombear. Gradualmente aumentar la velocidad de flujo, a partir de 1,25 ml / min durante 10 min; 2,5 ml / min durante 20 min y 3,75 ml / min durante 30 min. Cultura del hígado de la rata recelularizado más de 6 días. NOTA: Reemplazar un tercio del medio como se indica en la nota bajo 1.2.7 </li></ol></li></ol> 3. Evaluación del hígado de la rata transducidas recelularizado <ol start="1"><li> Hematoxilina y eosina (HE) tinción inmunohistoquímica y análisis <ol><li> Tomar muestras (0,5 x 0,5 x 1,5-2 cm) de cada lóbulo del hígado utilizando un bisturí. </li><li> Incubar las muestras (de 3.1.1) en 4% de paraformaldehído (PFA) + solución de sacarosa al 4% durante 1,5 horas a 4 ° C. (Precaución: PFA es tóxico y cancerígeno Siempre tenga PFA dentro de una campana de extracción y uso de ropa protectora adecuada..) Lavar tres veces con PBS (1 min por paso de lavado) y se incuba en un 8%sacarosa durante la noche a 4 ° C. </li><li> Verter la fijación en medio criomoldes de plástico, colocar las muestras en la fijación de un medio libre de burbujas de aire. Se añade medio de fijación hasta que la muestra está bien cubierta. Tienda incrustado muestras a -80 ° C hasta su uso posterior. </li><li> Preparar crio-secciones (10 micras) con un 12 cryotome. Evaluar recelularización por hematoxilina eosina + 8. Evaluar la eficacia de transducción por tinción inmunohistoquímica para el gen de interés-de-(aquí: EmGFP). </li></ol></li><li> muestreo biológico molecular <ol><li> Muestra cada lóbulo del hígado con un punzón de biopsia (4 mm de diámetro). Aislar el ARN total, ADN y proteínas de acuerdo con las instrucciones del fabricante para la evaluación de la expresión transgénica de EmGFP, y hCycB tumbar 8. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Chang, T. T., Hughes-Fulford, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monolayer+and+spheroid+culture+of+human+liver+hepatocellular+carcinoma+cell+line+cells+demonstrate+distinct+global+gene+expression+patterns+and+functional+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng.+Part+A%22%5BJournal%5D)">Monolayer and spheroid culture of human liver hepatocellular carcinoma cell line cells demonstrate distinct global gene expression patterns and functional phenotypes.</a> Tissue Eng. Part A. 15 (3), 559-567 (2009).</li>
<li>Butler, D., Callaway, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scientists+in+the+dark+after+French+clinical+trial+proves+fatal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Scientists in the dark after French clinical trial proves fatal.</a> Nature. 529 (7586), 263-264 (2016).</li>
<li>Enger, P. O., Thorsen, F., Lonning, P. E., Bjerkvig, R., Hoover, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vectors+penetrate+human+solid+tumor+tissue+in+vivo+more+effectively+than+adenoviral+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Hum.+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vectors penetrate human solid tumor tissue in vivo more effectively than adenoviral vectors.</a> Hum. Gene Ther. 13 (9), 1115-1125 (2002).</li>
<li>Uygun, B. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decellularization+and+recellularization+of+whole+livers%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Decellularization and recellularization of whole livers.</a> J. Vis. Exp. (48), e2394(2011).</li>
<li>Hillebrandt, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+Decellularization+of+Rat+Livers+in+an+Oscillating-pressure+Perfusion+Device%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Procedure for Decellularization of Rat Livers in an Oscillating-pressure Perfusion Device.</a> J. Vis. Exp. (102), e53029(2015).</li>
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<li>Kay, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((State-of-the-art+gene-based+therapies%3A+the+road+ahead%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet%22%5BJournal%5D)">State-of-the-art gene-based therapies: the road ahead.</a> Nat. Rev. Genet. 12 (5), 316-328 (2011).</li>
<li>Yla-Herttuala, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endgame%3A+glybera+finally+recommended+for+approval+as+the+first+gene+therapy+drug+in+the+European+union%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Ther%22%5BJournal%5D)">Endgame: glybera finally recommended for approval as the first gene therapy drug in the European union.</a> Mol. Ther. 20 (10), 1831-1832 (2012).</li>
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<li>Takagi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microdissected+region-specific+gene+expression+analysis+with+methacarn-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues+by+real-time+RT-PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Microdissected region-specific gene expression analysis with methacarn-fixed, paraffin-embedded tissues by real-time RT-PCR.</a> J. Histochem. Cytochem. 52 (7), 903-913 (2004).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Los hígados 3D reconstituidas descritas aquí proporcionan un modelo para estudiar los vectores virales en un sistema humanizado. Repoblación de la ECM de un hígado de rata con una línea celular de carcinoma hepatocelular humano genera un sistema vascularizado que permite el estudio de grandes biológicos. Estos resultados proporcionan una prueba de concepto de que el modelo de hígado reconstituida se puede transducir eficientemente con un vector viral. Para los experimentos que se muestran aquí, todos y cada lóbulo del hígado fue transducida por el vector AAV. Sin embargo, en algunos experimentos preliminares, los lóbulos individuales fueron no repoblado con células. Por tanto, es importante evitar que los desechos celulares u otros componentes de la oclusión del sistema vascular. Para probar si todos los lóbulos pueden ser perfundidos, un colorante no tóxico, tal como rojo de fenol se puede lavar a través del modelo de hígado. Otra cuestión fundamental es mantener el andamio hígado estéril. Mientras que el tratamiento con etanol o antibióticos es disadvantageous para el sistema vascular, la irradiación de la matriz extracelular con γ-radiación conserva los vasos y se esteriliza la muestra. Además, el tamaño de los hígados explantados será diferente, de modo que el número de células utilizadas para el procedimiento de recelularización y el tiempo de repoblación puede tener que ser ajustada para obtener resultados reproducibles. Los hígados de ratas utilizadas en el presente estudio son relativamente grandes y requieren grandes cantidades de células y reactivos de prueba (por ejemplo, vectores AAV). Además, el procedimiento de repoblación tomó más de dos semanas. Esto limita el número de réplicas que se pueden hacer con un esfuerzo razonable. Actualmente estamos estableciendo el modelo de hígados de los ratones, que son sólo aproximadamente una quinta parte del volumen de hígado de rata, lo que permite el uso de un menor número de células y menos reactivos de la prueba. Aunque proporcional a escala reducida del número de células parece razonable, las cantidades exactas deben ser determinados en Furtsus experimentos. Otro defecto de la presente modelo es el uso de la línea celular HepG2 hepatocelular. Los experimentos están en curso para desarrollar el uso de hepatocitos diferenciados a partir de células madre pluripotentes inducidas, que proporcionarán un modelo fisiológicamente más relevante. Además, el hígado consiste en múltiples tipos de células, además de los hepatocitos, por ejemplo, células de Kupffer y sinosoids. Suponemos que los diferentes tipos de células se repoblar sus entornos naturales cuando un ECM se recelularizado con múltiples tipos de células. El modelo 3D del hígado combina varias ventajas. Una desventaja importante de convencional en modelos in vivo es que la fisiología animal difiere sustancialmente de la fisiología humana. Los efectos secundarios tóxicos del tratamiento de un paciente humano, por lo tanto pueden no ser detectados. Esta deficiencia puede superarse mediante la reconstitución del modelo de hígado 3D con células humanas que reflejan más estrechamente la biología de hulos pacientes por el hombre. La segunda ventaja del modelo de hígado es su contribución al bienestar de los animales. Aunque se requieren componentes de animales para los experimentos de reconstitución, el enfoque todavía sigue los objetivos de la principio 3R (sustitución, reducción, refinamiento), como animales excedentes se pueden utilizar que fueron sacrificados para otros experimentos con animales, es decir, no se necesitan animales adicionales y el enfoque evita por completo el sufrimiento de los animales que con frecuencia se asocian con experimentos in vivo. Los esferoides son una herramienta alternativa para estudiar procesos celulares en un sistema 3D. Sin embargo, esferoides no están vascularizados de modo que grandes sustancias y productos biológicos no penetran profundamente en las partes interiores de la estructura. Estos problemas han sido superados con el modelo 3D del hígado vascularizado. En los experimentos descritos aquí, se investigaron los vectores de VAA, ya que se encuentran entre los candidatos más prometedores para terapia génicaaplicaciones. Como numerosos genes enfoques terapéuticos apuntan a la orientación del hígado, por ejemplo, para el tratamiento de infecciones con virus de la hepatitis o de la deficiencia de alfa-1-antitripsina, el hígado 3D se puede utilizar en el proceso de desarrollo estos AAV vector. Es, por supuesto, también es adecuado para el estudio de otros vectores virales hepatotropos, por ejemplo, vectores adenovirales. Además, puede ser usado para estudiar virus de la hepatitis infecciosas, como la hepatitis B o el virus C. Se puede, por ejemplo, ser empleado para el diseño de nuevas estrategias antivirales. Por otra parte, los modelos 3D de órganos representan herramientas prometedoras para el desarrollo de nuevas terapias para tratar el cáncer citostáticos y llevar a cabo estudios toxicológicos. En el largo plazo, hígados artificiales pueden ser utilizados en la medicina regenerativa como trasplantes. En su conjunto, el modelo 3D del hígado ofrece una amplia gama de aplicaciones en biología infección y otros campos de la investigación biomédica.

La mayoría de las investigaciones biomédicas actuales se basan en uno de dos enfoques, ya sea experimentos de cultivo celular bidimensionales (2D) o modelos animales, que son tridimensionales (3D) por su propia naturaleza. Sin embargo, estos enfoques tienen algunos inconvenientes graves. Se ha demostrado que las células cultivadas en cultivo 2D difieren en los patrones de expresión génica y la fisiología celular de las cultivadas en condiciones 3D. 1 Los modelos animales, además de estar asociados con preocupaciones éticas, a menudo no modelan bien la fisiología humana. Aunque la ausencia de efectos tóxicos evidentes de un compuesto debe confirmarse en modelos animales antes de la primera dosis en humanos, se han documentado múltiples casos en los que se han producido efectos adversos graves, a veces mortales, en ensayos clínicos. número arábigo
Para superar estas deficiencias, los modelos de órganos humanizados 3D ex vivo se han convertido en importantes herramientas de investigación. Cuando se cultivan en condiciones adecuadas, las células se autoensamblan en estructuras 3D conocidas como esferoides. Sin embargo, estos esferoides carecen de un sistema vascular, lo que limita la distribución de compuestos moleculares pequeños, biológicos grandes y vectores virales por igual. Por ejemplo, los vectores adenovirales solo transducían las capas celulares externas de los esferoides preparados a partir de glioblastomas humanos. 3 Una solución a este problema es el uso de un modelo de órgano que contiene un sistema vascular. Con este fin, el órgano de interés puede ser explantado de un animal, y las células animales pueden ser reemplazadas por células humanas. Se han descrito varios métodos para la descelularización de hígados animales mediante tratamiento con detergentes o colato de sodio. 4-6 La matriz extracelular (MEC) resultante alberga citoquinas y factores de crecimiento que regulan diversos procesos celulares. 7 Se puede utilizar como andamio para la recelularización con células humanas para obtener un modelo de órgano funcional.
En un estudio reciente, utilizamos un modelo de hígado humanizado en 3D para estudiar la distribución y la expresión transgénica de un vector de virus adenoasociado (AAV). 8 Los vectores AAV pertenecen a los vectores virales más prometedores para aplicaciones terapéuticas génicas. 9 La primera y hasta la fecha única intervención génica terapéutica aprobada en el mundo occidental utiliza un vector AAV para la transferencia de lipoproteína lipasa. 10

<table><tbody><tr><td>Incubadora</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Bomba peristáltica</td><td>Fraunhofer</td><td>/</td><td></td></tr><tr><td>Brida con ranura</td><td>Duran</td><td>2439454</td><td>modificada por gaffer</td></tr><tr><td>Junta tórica Duran transparente</td><td></td><td>2922551</td><td></td></tr><tr><td>Abrazadera de liberación rápida</td><td>Duran</td><td>2907151</td><td></td></tr><tr><td>tapa de brida plana</td><td>Duran</td><td>2429857</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Rosca de rosca Tubo</td><td>Duran</td><td>2483802</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Rosca de rosca Tubo</td><td>Duran</td><td>2483602</td><td>modificado por gaffer</td></tr><tr><td>Anillo de sellado de silicona</td><td>Duran</td><td>2862012</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca</td><td>Duran</td><td>2924013</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca</td><td>Duran</td><td>2924008</td><td></td></tr><tr><td>Tapón de rosca con apertura</td><td>Duran</td><td></td><td></td>2922709</tr><tr><td>Tapón de rosca con apertura</td> Filtro <td>de 2922705</td><td></td><td></td>Duran</tr><tr><td>Sarstedt</td><td>831,826,001</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona</td><td>VWR</td><td>228-1500</td><td></td></tr><tr><td>Conector de tubo</td><td>Ismatec</td><td>ISM556A</td><td></td></tr><tr><td>Tubo biocompatible</td><td>Ismatec</td><td>SC0736</td><td></td></tr><tr><td>T175 Matraces de cultivo</td><td>Greiner bio-one</td><td>660 160</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0501-500</td><td></td></tr><tr><td>glutamina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>X0551-100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0940-100</td><td></td></tr><tr><td>penicilina/estreptomicina</td><td>BioWest SAS (Th. Geyer)</td><td>L0022-100</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal para terneros</td><td>cc pro</td><td>S-10-M</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T.</td><td>Weckert-Labortechnik</td><td>600001</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>DSMZ</td><td>ACC 180</td><td></td></tr><tr><td>Cryommold 15 x 15 x 5 mm</td><td>Sakura</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Punzón de biopsia 4 mm</td><td>pfm medical</td><td>48401</td><td></td></tr><tr><td>Nucleospina miRNA</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740971.10</td><td></td></tr><tr><td>Juego de tampones de ARN/ADN de nucleospina</td><td>Macherey & Nagel</td><td>740944</td><td></td></tr></tbody></table>

estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado modelo repoblado con la línea celular humana hepg2 carcinoma hepatocelular

Study of Viral Vectors in a Three-dimensional Liver Model Repopulated with the Human Hepatocellular Carcinoma Cell Line HepG2

Este protocolo describe la generación de un tridimensional (3D) ex vivo modelo de hígado y su aplicación al estudio y desarrollo de sistemas de vectores virales. El modelo se obtiene mediante la repoblación de la matriz extracelular de un hígado de rata descelularizado con una línea celular de hepatocitos humanos. El modelo permite estudios en un sistema de células 3D vascularizado, en sustitución de los experimentos potencialmente dañinos con animales vivos. Otra de las ventajas es la naturaleza humanizada del modelo, que está más cerca de la fisiología humana que los modelos animales. En este estudio, hemos demostrado la transducción de este modelo de hígado con un vector viral derivado de virus adeno-asociados (AAV vector). El circuito de perfusión que suministra el modelo 3D del hígado con los medios de comunicación es un medio sencillo de aplicar el vector. El sistema permite la supervisión de los principales parámetros metabólicos del hígado. Para el análisis final, las muestras de tejido se pueden tomar para determinar la extensión de recellularización por técnicas histológicas. Distribución del vector de virus y la expresión del transgén entregado puede analizarse por PCR cuantitativa (qPCR), inmunotransferencia de tipo Western e inmunohistoquímica. Numerosas aplicaciones del modelo del vector en la investigación básica y en el desarrollo de aplicaciones terapéuticas de genes se pueden prever, incluyendo el desarrollo de nuevas terapias antivirales, la investigación del cáncer, y el estudio de los vectores virales y sus efectos secundarios potenciales.

Para la evaluación de la extensión de la recelularización, crio-secciones se preparan a partir de cada lóbulo de cada modelo de hígado recelularizado. Las secciones fueron analizadas por tinción de hematoxilina y eosina. Como puede verse en la Figura 3, cada lóbulo de los tres modelos de hígado, denotado como SLT1, TLM2 (transducidas modelos de hígado 1 2) y Ctrl (modelo de hígado de control que se recelularizado, pero no transducidas), se repoblada con células HepG2. Esta línea celular de carcinoma hepatocelular se estableció a partir del tejido tumoral de un niño argentino de 15 años de edad. Algunas áreas de los modelos de hígado fueron más intensamente recelularizado que otros. Las razones de estas variaciones no se habían determinado. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig3.jpg" /> Figura 3. Hematoxilina y eosina de cada lóbulo de los tres modelos analizados hígado SLT1 + 2:. Transducidas hígadomodelos 1 y 2; Ctrl .: modelo de hígado de control que fue recelularizado pero no transducidas. Barra de escala: 200 micras. (Re-impreso con el permiso de la Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En el siguiente paso, se evaluó la transducción de los modelos de hígado. Con este fin, el ADN se preparó a partir de 28 biopsias de perforación de cada uno de los modelos del hígado y el título de vector se cuantificó por qPCR. En promedio, se midieron 55 y 90 genomas de vector internalizadas por célula (VG / célula) para los dos modelos de hígado transducidas. Los experimentos en cultivos celulares han demostrado 2D 30 VG / célula son suficientes para una fuerte expresión del transgen y el silenciamiento mediado por RNAi. Producción de EmGFP se analizó por RT-PCR y Western Blot. De hecho, no se detectó expresión del reportero en el 80-90% de las biopsias en los niveles de ARNm y de proteína, respectivamente.8 Para obtener una imagen completa de la eficacia de transducción, crio-secciones se analizaron inmunohistoquímicamente. Como puede verse en la Figura 4, las áreas del modelo de hígado que fueron recelularizado con éxito, como se visualiza mediante tinción con DAPI, también dieron señales fluorescentes fuertes en el análisis inmunohistoquímico de la expresión EmGFP. Como era de esperar, el modelo de hígado de control, no tratados con vectores AAV, no mostró ninguna expresión EmGFP. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig4.jpg" /> Figura 4. El análisis inmunohistoquímico de la expresión EmGFP Las células que repoblaron los modelos de hígado se visualizaron por tinción con DAPI (azul).; expresión EmGFP se visualizó por tinción inmunoquímica (rojo). SLT1 + 2: Modelos de hígado transducidas 1 y 2; Ctrl .: modelo de hígado de control que fue recelularizado pero no transducidas. Barra de escala: 200 micras. (Re-impreso con el permisode Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> En una prueba final, caída mediada por AAV de hCycB se analizó mediante qRT-PCR. La caída de hCycB se encontró que era entre 70 y 90%, como media de todos los lóbulos de los dos modelos de hígado transducidas (Figura 5). <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54633/54633fig5.jpg" /> Figura 5. RNAi mediada desmontables de hCycB en modelos 3D del hígado AAV transducidas. Silenciamiento de hCycB se determinó mediante qRT-PCR. Los valores medios y las desviaciones estándar (SD) se calcularon para todas las muestras de cada modelo 3D del hígado transducidas (SLT1 y 2, respectivamente) y se normalizaron al valor medio del control no transducidas (Ctrl.). (Re-impreso con el permiso de Ref. 8.) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54633/54633fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

La matriz extracelular recelularizada de un hígado de rata descelularizado se puede utilizar como un modelo humanizado y tridimensional ex vivo para estudiar la distribución y la expresión transgénica de un virus o vector viral.

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

This protocol describes the generation of a three-dimensional (3D) ex vivo liver model and its application to the study and development of viral vector ...

El objetivo general de este procedimiento es desarrollar un modelo tridimensional de hígado para estudiar virus y vectores virales. Este método permite el estudio de procesos biológicos en un sistema tridimensional vascularizado con células humanas, que difieren en su fisiología de las células de roedores en un modelo de ratón o rata. Además, constituye un paso para mejorar el bienestar animal, ya que evita experimentos con animales vivos y, a largo plazo, pretende reemplazar por completo los componentes animales.Aunque desarrollamos este método para estudiar vectores virales para la transferencia de genes, también puede aplicarse al estudio de virus infecciosos y otras áreas de investigación, como la investigación del cáncer. La procedimiento lo demostrará Viola Rohrs, una técnica de mi laboratorio. Por respeto al bienestar animal, solo se utilizaron animales sobrantes para el presente estudio, los cuales fueron sacrificados por otros experimentos con animales, es decir.no se necesitaron animales adicionales para obtener los andamiajes hepáticos. Para comenzar, expanda primero la línea celular hepática Hep G2. Siembre 15 millones de células en botellas T175 con 30 mililitros de medio que contenga 10% de suero fetal bovino y dos milimoles de glutamina, penicilina y estreptomicina. Después de cuatro días de cultivo, use cinco minutos de exposición a solución de tripsina en condiciones de cultivo para desprender las células y luego recójalas.Luego, centrifugar las células a 300 G durante tres minutos. A continuación, re-suspenderlas en cuatro mililitros de PBS y obtener un recuento celular. Cada frasco debe producir aproximadamente 45 millones de células.Se necesitan 600 millones de células para recelularizar una matriz extracelular (ECM) de hígado de rata. Para recelularizar la ECM, primero prepare el sistema de biorreactor que contiene una cámara de perfusión hepática, un sistema de perfusión, un depósito de medio y un trampa de burbujas. Existen dos pasos críticos en el procedimiento de recelularización.Uno es evitar atrapar burbujas de aire en el sistema de perfusión. El segundo es que todo el sistema debe mantenerse estéril. Primero, esterilice estos componentes del sistema de biorreactor a 121 grados Celsius durante 15 minutos.En segundo lugar, llene los tubos y la cámara de perfusión esterilizada con medio. Luego, coloque el andamio hepático de rata descelularizado dentro de la cámara de perfusión hepática. El siguiente paso consiste en usar pinzas para tubos para conectar la vena porta canulada al sistema de perfusión.Ahora coloque el sistema de biorreactor en el incubador y conéctelo a una bomba peristáltica. A continuación, equilibre el andamio con 150 mililitros de medio suplementado durante cinco días. Establezca el flujo en 1,25 mililitros por minuto.Después de cinco días, desconecte el sistema de biorreactor de la bomba y transfiéralo a una cabina estéril. Desconecte el andamio hepático del circuito de medio. A continuación, cargue una jeringa con cinco mililitros de medio que contenga 300 millones de células Hep G2 e inyecte las células a través de la vena porta, evitando la formación de burbujas de aire.Luego, permita que las células repoblen la MEC durante una hora sin hacer funcionar la bomba. Después de una hora, inicie la bomba a 1,25 mililitros por minuto. Después de 10 minutos, aumente la presión a 2,5 mililitros por minuto.Después de otros 20 minutos, ajuste la bomba a la velocidad de operación de 3,75 mililitros por minuto. Después de 30 minutos a velocidad máxima de la bomba, apague la bomba, agregue otros 300 millones de células y deje que las células colonizen la MEC durante una hora. Después de una hora, aumente gradualmente la circulación mediante ajustes incrementales de la velocidad de la bomba como antes.Ahora deje que el cultivo recelularice el hígado durante dos semanas. Cada dos días, reemplace 50 mililitros del medio y mida los parámetros fisiológicos a partir de una muestra del medio usado. La producción de vectores AAV es un procedimiento complicado que implica muchos pasos que se resumen en el protocolo escrito.En esta sección del video, se muestran algunos de los pasos cruciales. Primero, produzca, purifique y cuantifique los vectores AAV. Breve producción de los vectores AAV en botellas rotatorias y purificación mediante centrifugación en gradiente de yodixanol.Elimine el iodixanol residual mediante filtración en columnas de filtración en gel PD10. Luego, determine la concentración del vector AAV mediante QPCR utilizando ADN genómico de AAV como estándar. Se necesitan un total de 27 billones de vectores AAV por modelo.Ahora transduzca el modelo de hígado. Primero, obtenga 27 billones de vectores en cinco mililitros de PBS cargados en una jeringa. Se puede añadir rojo de fenol a 5 microgramos por mililitro.Luego, desconecte el hígado del circuito de medio e inyecte los vectores en el sistema. Una vez inyectados, incube el sistema durante una hora sin bombeo. A continuación, aumente gradualmente el flujo como se describió anteriormente.Posteriormente, mientras el hígado transducido se incuba durante seis días, cambie 50 mililitros del medio cada dos días. Con un escalpelo, corte muestras de cada lóbulo hepático de aproximadamente medio centímetro de grosor y entre 1,5 y dos centímetros de largo. Incube los fragmentos en paraformaldehído al 4% con sacarosa al 4% durante 90 minutos a cuatro grados Celsius.Luego, lave la muestra tres veces con PBS durante un minuto por lavado. Después de los lavados, incube las muestras durante la noche en sacarosa al 8 % a cuatro grados Celsius. Al día siguiente, cargue las muestras en moldes criogénicos que contengan algo de medio de fijación.Evite introducir burbujas de aire. Una vez cargados, cubra completamente las muestras con medio de fijación y colóquelas a menos 80 grados Celsius. Una vez congeladas, prepare secciones criostáticas de 10 micrones a partir de las muestras utilizando un criostato.Tiña las muestras según sea necesario para confirmar la recelularización. Para el análisis de expresión génica, tome muestras utilizando un punzón de biopsia de cuatro milímetros. Para evaluar la recelularización, se tiñeron secciones criostáticas con hematoxilina y eosina.Lóbulos de dos hígados transducidos y de un hígado control que fue recelularizado pero no transducido fueron repoblados todos con células Hep G2. La expresión de ARN y el título del vector se cuantificaron a partir de 28 biopsias por punch de cada modelo hepático. En los dos modelos hepáticos transducidos, se midieron 55 y 90 genomas virales por célula, lo cual corresponde a una cantidad suficiente de vector para inducir la silenciación génica.No se midieron genomas en el control, como era de esperar. La expresión de EmGFP se analizó mediante RT-PCR e inmunotransferencia. La mayoría de las biopsias mostraron expresión de ARNm de EmGFP y expresión proteica de EmGFP.La inmunotinción de las criosecciones mostró que, en todos los lugares donde el modelo se recelularizó con éxito, también se pudo observar la expresión de EmGFP. Esto indica una buena expresión génica del AAV. A continuación, se analizó mediante RT-PCR cuantitativa el silenciamiento mediado por AAV de la ciclofilina B humana.La inhibición promedio de la ciclofilina B humana estuvo entre el 70 y el 90 % en todos los lóbulos de los dos hígados transducidos. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores estudiaran la distribución de virus y vectores virales en el sistema orgánico tridimensional y vascularizado. Dichos estudios ayudarán a mejorar las técnicas actuales de transferencia génica y a desarrollar nuevas estrategias antivirales.

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Investigación del cáncer

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De alta eficiencia de transducción de las células de cáncer de hígado por recombinante serotipo del virus adeno-asociado 3 Vectores

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Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular (Video) | JoVE Journal

Estudio de vectores virales en un tridimensional del hígado Modelo repoblado con la línea celular humana HepG2 carcinoma hepatocelular

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