G Белково-селективные GPCR Конформации Измеряется с использованием FRET датчиков в прямом эфире клеточной суспензии Флуорометр Пробирной

Общая цель этого анализа резонансного переноса энергии Форстера в живых клетках, или анализа на основе FRET, заключается в оценке селективного рецептора G-белка или конформаций GPCR в различных агонистических условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области GPCR о взаимодействии GPCR с различными эффекторами и влиянии различных препаратов на подтверждение рецепторов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что датчики являются модульными и могут быть легко переделаны для различных комбинаций GPCR и G-альфа-пептидов, включая полную и G-альфа-субединицу.

Тем не менее, этот метод может дать представление о выборе G-белка и реакции на различные лигены. Он также может быть применен для изучения физиологических последствий дифференциальной активации G-белка. Перед началом процедуры культивируйте интересующие клетки в полной среде при температуре 37 градусов Цельсия во влажной атмосфере с 5% углекислого газа до тех пор, пока культуры не достигнут конфлюенции.

Затем отделяют клетки с трипсином и пропускают культуры из расчета от восьми до 10 до пятой клетки на клетку в двух миллиметрах среды в культуру тканей, обработанную шестью лунками в течение шестнадцати-20 часов культивирования. Через 16–20 часов приготовьте одну реакцию трансфекции на лунку, когда клетки прилипнут к планшетам в шкафу биологической безопасности, и дайте смесям реагентов сбалансироваться в течение 15–30 минут. В конце инкубации добавьте по одной реакции к каждой клеточной культуре по каплям в лунке.

Осторожно встряхивайте пластину, чтобы обеспечить тщательное распределение реагента по всем культурам. Затем верните планшет в инкубатор для клеточных культур. Через 20 часов проанализируйте культуры на экспрессию белка плазматической мембраны и оцените здоровье клеток.

Если наблюдается существенная интернализация белка, контролируйте трансфекцию до тех пор, пока на плазматической мембране не будет обнаружена значительная экспрессия. Оценка уровня экспрессии белка является обязательным условием для оптимальной экспериментальной установки. Если клетки трансфицированы плохо или экспрессия белка слишком низкая, подождите, чтобы собрать клетки.

В противном случае флуоресцентный сигнал может оказаться недостаточным для анализа. Когда клетки будут готовы к сбору, перенесите их в шкаф биобезопасности и аккуратно удалите один миллилитр среды. С помощью пипетки P1000 повторно суспендируйте клетки в одном миллилитре оставшейся среды на лунку и перенесите клеточные суспензии в отдельные микроцентрифужные пробирки объемом 1,5 миллилитров.

Подсчитайте ячейки и гранулируйте их с помощью центрифугирования. Удалите среду из клетки с гранулой. Аккуратно суспендируйте надосадочную жидкость в одном миллилитре клеточного буфера при температуре 37 градусов Цельсия и повторите центрифугирование.

Ресуспендируйте гранулу в соотношении четыре раза по 10 до шестой клетки на миллилитр в буфере свежих клеток после второго спина. Далее добавьте в кювету 90 микролитров контрольных ячеек и приобретите контрольный спектр FRET. После сбора трех-пяти повторных контрольных спектров со свежими 90 микролитрами клеток для каждого измерения, повторите этапы суспензии, отжима и промывки для трансфицированных клеток.

Аликвотируйте 90 микролитров инфицированных клеток в каждую пробирку по 500 микролитров в держатели от двух до шести и от восьми до 12 в тепловом блоке, аккуратно ресуспендируя клетки между каждой аликвотой. Когда все клетки будут перенесены, добавьте 10 микролитров буфера для лекарств в пробирки со второй по шестую для образцов необработанного состояния. Затем добавьте 10 микролитров одного миллимоляра раствора препарата в восьмерку тюбика.

Запустите таймер для обратного отсчета от 10 минут и с помощью пипетки P200 аккуратно перемешайте содержимое пробирки. После смешивания закройте пробирку и верните ее в нагревательный блок. Затем сразу возьмите трубку вторую.

Аккуратно перемешайте его содержимое с помощью нового наконечника. Добавьте 90 микролитров трансфицированной клеточной суспензии в кювету необработанного состояния и поместите кювету во флуориметр. Получите спектр FRET для образца с использованием тех же параметров, что и для контрольных спектров.

Через девять минут и 10 секунд внесите в девятую трубку 10 микролитров раствора препарата с одним миллимоляром. Аккуратно перемешайте содержимое тюбика и верните пробирку в термоблок. Затем немедленно возьмите пробирку три, перемешайте и измерьте содержимое кюветы, как только что было показано для пробирки два.

Через пять минут и 10 секунд аккуратно перемешайте восьмерку с помощью пипетки P200. Добавьте 90 микролитров клеточной суспензии в отдельную кювету для измерения обработанного образца и получите спектр FRET для образца состояния препарата. После того, как все спектры будут получены, сохраните файлы проекта.

Тщательно промойте кюветы ультрачистой водой и пополните запасы тюбиков для следующего состояния. На этом изображении показан однородный монослой клеточной культуры, который оптимален для гальванизации и трансфекции на шесть лунок. Однако эти клетки, растущие в виде комков, которые приводят к дендритным формам, не рекомендуются для последовательного покрытия и точного анализа экспрессии белка или измерения FRET.

Условия трансфекции также могут быть оптимизированы для достижения воспроизводимой экспрессии. После того, как все данные будут собраны и введены в файл CSV для анализа, полученные результаты будут похожи на эти репрезентативные спектры RAW и нормализованных средних FRET. Все спектры RAW FRET из этого репрезентативного эксперимента демонстрируют плавный, достаточный диапазон сигнал/шум, что позволяет проводить последовательный анализ данных с минимальным пиком воды в образце.

Когда данные нормализованы на 475 нанометров, количество отсчетов в секунду этого значения устанавливается равным 1,0, и становится очевидным значительное изменение показаний на 525 нанометров между обработанными и необработанными образцами. Если экспрессия белка низкая, низкая эффективность трансфекции или низкая плотность клеток в кювете для показа флуоресценции, данные RAW могут быть зашумленными, что приводит к проблемам в фоновом вычитании и нормализации, что приводит к тому, что спектры не выравниваются и не могут быть проанализированы. После освоения этой техники ее можно выполнить за 25 минут, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о бережном обращении с клетками на всех этапах эксперимента. После этой процедуры методика может быть расширена для тестирования различных рецепторных FRET-сенсоров, различных лекарств и эффекторов, а также различных типов клеток. После своего развития этот метод внес свой вклад в область GPCR, где недавние исследования с использованием этих сенсоров пролили свет на молекулярный механизм отбора G-белка.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как оценивать конкретные подтверждения GPCR с помощью анализа измерения конструкции FRET с помощью проводного провода с живыми ячейками. Не забывайте, что работа с культурами клеток млекопитающих и некоторыми экспериментальными препаратами может быть чрезвычайно опасной, и что при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.