El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro

Los objetivos generales de este método son generar e identificar fagocitos gigantes cultivados in vitro derivados de neutrófilos humanos circulantes para la investigación de su papel en las respuestas inmunitarias inflamatorias y antiinflamatorias. Este método se puede utilizar para obtener e identificar una nueva subpoblación de fagocitos gigantes que se desarrollan a partir de neutrófilos humanos para mantener las condiciones de cultivo a largo plazo. Esta técnica se puede utilizar para investigar más a fondo la importancia y las funciones de los fagocitos gigantes, así como para responder a preguntas clave sobre su activación y plasticidad.

Eva Leder, nuestra asistente de investigación, y Oksana Rogovoy, postdoctoral, ambas de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Utilice un juego de venas estériles del cuero cabelludo para obtener al menos 40 mililitros de sangre venosa de un voluntario joven y sano. A continuación, mezcle suavemente la sangre en una campana de flujo laminar de bioseguridad.

Diluir de 10 a 12 mililitros de alícuotas de la muestra de sangre entera hasta un volumen final de 24 mililitros con PBS sin iones precalentado que contenga un 2% de FCS inactivado por calor. A continuación, añada 12 mililitros de polisacarosa 1119 al fondo de un tubo de centrífuga cónica de polipropileno estéril de 50 mililitros por alícuota de muestra de sangre, seguido de la cuidadosa superposición de 12 mililitros de polisacarosa 1077 sobre la solución de gradiente de polisacarosa 1119. Pipetear cuidadosamente 24 mililitros de sangre diluida en tubos individuales de las soluciones de gradiente de densidad y separar las células por centrifugación.

Se deben observar dos capas opacas resultantes. Deseche el líquido hasta 0,5 centímetros por encima de la capa de células mononucleares en cada tubo. A continuación, transfiera las células mononucleares de cada muestra a un único tubo nuevo.

A continuación, deseche el líquido restante hasta 0,5 centímetros por encima de la célula polimorfonuclear o capa de PMN y transfiera los PMN de cada muestra a un tubo nuevo diferente. Lavar los PMN en un volumen final de 30 mililitros de PBS que contenga un 2% de FCS inactivados por calor, seguido de una lisis de los glóbulos rojos con tres mililitros de cloruro de sodio hipotónico al 0,2% helado estéril. Después de 30 segundos en hielo, restaure la isotonicidad con tres mililitros de cloruro de sodio estéril frío al 1,6%.

Luego agregue seis mililitros de 37 grados Celsius RPMI 1640 Medio suplementado con FCS inactivado por calor y recoja las celdas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de RPMI 1640 suplementado con FCS inactivado por calor al 10%. Después de contar, ajuste la concentración a 1,25 a 1,5 veces 10 por el sexto PMN por mililitro de medio de cultivo y coloque un mililitro de células por pocillo en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.

A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados, alimentando los cultivos mediante la sustitución suave de la mitad del medio con medio RPMI 1640 fresco suplementado con FCS inactivado por calor al 10% cada tres días. Los neutrófilos se diferenciarán en fagocitos gigantes a los siete días de cultivo. En el séptimo día de cultivo, retire con cuidado la mitad del medio de cada pocillo.

A continuación, pipetee enérgicamente el medio restante para eliminar los fagocitos gigantes ligeramente adheridos. Transfiera las células desprendidas de dos a cuatro pocillos de cada grupo de tratamiento a tubos cónicos individuales de 15 milímetros y recoja las células por centrifugación, resuspendiendo los gránulos en 100 a 120 microlitros de medio por tubo. A continuación, equipe dos o tres soportes por grupo de tratamiento con portaobjetos de microscopio, tarjetas de filtro y embudos.

A continuación, agregue todo el volumen de células de cada tubo en el embudo Cytospin apropiado. A continuación, cargue los soportes en un Cytospin y gire las células en los portaobjetos. Seque los portaobjetos centrifugados durante 10 minutos.

A continuación, utilice un marcador estable al agua para dibujar una barrera hidrofóbica alrededor de las células y fije las muestras con un 4% de paraformaldehído bajo una cubierta química a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, enjuague brevemente los portaobjetos tres veces con aproximadamente 100 microlitros de PBS por lavado. A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguidos de cinco lavados con PBS, como se acaba de demostrar.

Bloquee la unión inespecífica con suero de cabra normal al 10% en RPMI 1640 Medium durante el período de tiempo adecuado seguido de un solo lavado PBS. Ahora, agregue una pequeña cantidad de agua a la caja para mantener la humedad y luego etiquete las células con aproximadamente 100 microlitros del anticuerpo primario apropiado de interés durante la noche a cuatro grados Celsius en una cámara oscura humidificada. A continuación, realice un solo lavado con PBS y, a continuación, añada el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado.

Después de 40 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz, lavar las muestras para eliminar el exceso de anticuerpos y montar los portaobjetos con una gota de medio de montaje por muestra y un cubreobjetos. Analice los portaobjetos mediante microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal en un plazo de 30 a 120 minutos con un objetivo de aceite de inmersión 40X. A continuación, calcule el área de la célula, la intensidad de fluorescencia y la colocalización utilizando el software adecuado.

En estas imágenes se puede observar el desarrollo de neutrófilos en fagocitos gigantes dentro de los siete días posteriores al cultivo. La autofagocitosis es evidente a los 90 minutos después del cultivo de neutrófilos con tinciones fluorescentes en la membrana con un diámetro celular muy grande aparente a los cuatro a siete días. Sin embargo, si los cultivos de neutrófilos se complementan con GM-CSF e IL-4, las células muestran un diámetro general más pequeño y proyecciones citoplasmáticas que se asemejan a las células dendríticas.

La microscopía de lapso de tiempo de los fagocitos gigantes en los días tres a cuatro y cuatro a cinco de cultivo revela células poco o ninguna o ninguna adherente con una capacidad de movimiento limitada que ingiere activamente los restos y desechos de neutrófilos circundantes. En este cultivo mixto de neutrófilos monocitarios, la migración de un macrófago rastrero activo puede compararse con el movimiento casi estacionario de un fagocito gigante marcado con fluorescencia en el mismo pocillo de cultivo. El origen neutrofílico de los fagocitos gigantes puede verificarse por su expresión positiva de marcadores de no neutrófilos y su falta de expresión de marcadores de células monocíticas y dendríticas.

Los fagocitos gigantes también generan especies reactivas basales de oxígeno y responden a la estimulación de zymosan y PMA por estallido oxidativo. Sin embargo, a diferencia de los monocitos o los neutrófilos, también responden mediante ráfagas oxidativas a la estimulación de lipoproteínas oxidadas de baja densidad. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis o siete días.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar reemplazar la mitad del medio suavemente cuando alimente los cultivos de neutrófilos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas de tinción para responder preguntas sobre las funciones adicionales de estas intrigantes células in vitro e in vivo. Esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los neutrófilos exploren la activación y la plasticidad de los neutrófilos e identifiquen estas células in vivo en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas en humanos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener e identificar fagocitos gigantes en cultivo. No olvide que trabajar con sangre humana puede ser potencialmente infeccioso y que es imprescindible tomar precauciones como el uso de guantes y desechar todos los líquidos y el uso de equipos desechables en los contenedores de riesgo biológico apropiados al realizar este procedimiento.