Name: El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 5 s
Description: Aprende a generar y cultivar fagocitos gigantes derivados de neutrófilos humanos in vitro. Este método permite estudiar su función en respuestas inmunes inflamatorias y antiinflamatorias.

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Los autores agradecen al Dr. Edith Suss-Toby por su inestimable ayuda con los estudios de microscopía confocal. Este estudio fue apoyado por el Ministerio de Absorción e Inmigración y el Comité de Planificación y Presupuesto del Consejo de Educación Superior en el marco del programa KAMEA (LD y AP). También agradecen el apoyo del investigador de la señora Davis postdoctorado de la Fundación de Becas de Investigación (O).

El protocolo fue aprobado por el Comité de Derechos Humanos local de acuerdo a la declaración de Helsinki, y todos los participantes firmaron un consentimiento informado. 1. Aislamiento de neutrófilos y Desarrollo de Gφ en Cultura NOTA: Todos los pasos deben realizarse utilizando lipopolisacárido grado de tejido estéril (LPS) soluciones -free en una campana de flujo laminar Bio-Seguridad. No añadir antibióticos, citocinas o factores de crecimiento para el Roswell Park Memorial Institute (RPMI) -1640 medio. <ol><li> Obtener al menos 40 ml de sangre venosa de los adultos jóvenes sanos utilizando un conjunto vena del cuero cabelludo estéril. Extraer la sangre en tubos vacutainer que contienen etilendiamina tetra acético sal de K (K 3 3 EDTA) y mezclar suavemente. Mantener la sangre a temperatura ambiente. </li><li> Aislar los neutrófilos por dos etapas de gradiente de densidad discontinuo utilizando polisucrosa a 1.119 y 1.077 g / ml. Aportar soluciones a la temperatura ambiente antes de usar. NOTA: Durante la centrifugación, la sangre rojacélulas (glóbulos rojos) son agregados por el polisucrosa y sedimentos rápidamente. Se encuentran las células mononucleares (monocitos / linfocitos) entre el plasma superior / polisucrosa -1077 interfaz, mientras que los neutrófilos se encuentran justo por encima de los RBC, en el polisucrosa -1077 / 1119 de interfaz (véase la figura 2). Este método permite la separación simultánea de las células mononucleares y neutrófilos del mismo individuo. </li></ol><img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig2.jpg"> Figura 2: Aislamiento de neutrófilos de sangre humana entera. Polisucrosa a 1,077 g / ml es en capas cuidadosamente sobre la parte superior de polisucrosa-1.119 g / ml para formar un gradiente discontinuo. La sangre entera diluida es entonces en capas en la parte superior de la polisucrosa-1.077. Los tubos se someten inmediatamente a centrifugación a 700 xg durante 30 min, a temperatura ambiente sin freno. se observan tres bandas distintas. Células polimorfonucleares células (A) mononucleares, (B) (PMN),y (C) las células rojas de la sangre (RBC) en la parte inferior del tubo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <ol style="margin-left: 40px;"><li> Añadir 12 ml polisucrosa-1119 a la parte inferior de un tubo de centrífuga cónico de polipropileno estéril de 50 ml. </li><li> la capa cuidadosamente 12 ml de polisucrosa-1077 en el polisucrosa -1119. </li><li> Diluir 10 - 12 ml de sangre entera a un volumen final de 24 ml de sangre con conexión fosfato ion solución salina tamponada (PBS) que contenía suero al 2% inactivado por calor fetal de ternera (HI-FCS). capa cuidadosamente 24 ml de la sangre entera diluida sobre el gradiente superior del tubo. </li><li> Centrifugar a 700 xg durante 30 min a temperatura ambiente (20-24 ° C) sin freno. NOTA: La centrifugación a temperaturas más bajas puede resultar en la formación de grumos de células y la mala recuperación. </li><li> Retirar con cuidado los tubos de la centrífuga Without perturbar el gradiente. Deben observarse dos capas opacas (A: células mononucleares y B: PMN, representados en la figura 2). </li><li> Aspirar y desechar el líquido hasta 0,5 cm por encima de la capa A. Transferencia (o descarte) Las células de esta capa a un tubo marcado "mononucleares". </li><li> Aspirar y desechar el líquido restante hasta 0,5 cm por encima de la capa B. La transferencia de las células de esta capa a un tubo etiquetado "PMN". </li><li> Piscina PMN de cada uno de dos tubos de gradiente y lavar con PBS que contiene 2% HI-FCS a un volumen final de 30 ml. Se centrifuga durante 12 minutos a 200 x g, separar el sobrenadante y desechar. </li><li> Para deshacerse de la contaminación de las células rojas de la sangre (glóbulos rojos), añadir 3 ml de hipotónica 0,2% de NaCl estéril frío hielo mientras resuspendiendo el sedimento dibujando suavemente dentro y fuera con una punta de pipeta estéril de 1 ml. Mantener en hielo durante 30 seg. </li><li> Después de 30 s, restaurar la isotonicidad mediante la adición de 3 ml de estéril 1,6% enfriado en hielo NaCl al tubo. </li><li> A los 6 ml de solución salina isotónica, añadir 6 ml de pre-calentado (37 ° C) RPMI-1640 suplementado con 2% HI-FCS y se centrifuga a 250 xg durante 12 min. Descartar el sobrenadante. El sedimento PMN debe estar limpio de contaminación de la FC. NOTA: Si está contaminado por RBC, el pellet PMN parece rojizo. </li><li> Si algunos glóbulos rojos contaminantes permanecen, repita los pasos 9 y 10 una vez más. </li><li> Resuspender el sedimento de células en 4 ml de RPMI-1640 suplementado con 10% HI-FCS y contar las células para determinar su concentración y la viabilidad mediante exclusión con azul de tripano. </li><li> Ajustar la concentración de 1.25 a 1.5 x 10 6 PMN / ml (dependiendo de las necesidades experimentales), y la placa de 1,0 ml pocillo en una placa así / 24. NOTA: La pureza de los neutrófilos en la población de granulocitos siempre supera 95%, tal como se evaluó por tinción de May-Grunewald Giemsa y microscopía de luz. </li><li> Después de la siembra, colocar las células en una humidificado 5% de CO2 a 37 ° C. </li><li> Reemplazar el medio cada 3 días aspirando suavemente la mitad deel medio y añadiendo el mismo volumen de medio RPMI-1640 fresco suplementado con 10% HI-FCS. El uso de soluciones de LPS libres y compuestos y LPS niveles bajos en HI-FCS (0,05 ng / ml o menos). NOTA: Un cambio de medio suave es imprescindible ya que el Gφ, que se desarrollan en la cultura no Fije firmemente a la placa de cultivo y lavado vigoroso también puede lavar las células en desarrollo. La aparición de Gφ es perceptible a los 3 - 4 días después del cultivo PMN, dependiendo del donante de sangre. La mayoría de los análisis y ensayos descritos aquí se llevan a cabo entre los 6 - 7 días en cultivo, cuando Gφ son muy grandes en tamaño. Cabe señalar que la adición de 1 - 10 ng / ml de LPS al medio RPMI-1640 no afectó el desarrollo Gφ en cultivo. 14 </li></ol> 2. Microscopía confocal de barrido láser <ol style="margin-left: 40px;"><li> Preparar cytospins 16 a partir de neutrófilos recién aisladas, y desde el día 7 desarrollado culturas Gφ(Preparado en el apartado 1). NOTA: Para aumentar la concentración de Gφ en el plato para diversos análisis, retire suavemente la mitad del medio. Asegúrese de que Gφ no se detectan en el medio eliminado mediante el examen el medio bajo un microscopio de luz. Entonces, intensamente pipetear el medio restante para eliminar la ligera adherido Gφ. Centrifugar el medio durante 10 minutos a 200 xg, y resuspender el sedimento en 100 a 120 l de medio. <ol><li> Utilice 100 - 120 l del medio que contiene células para cada diapositiva. Preparar en otro portaobjetos por duplicado o triplicado de cada tratamiento. Girar durante 7 minutos a 84 x g. </li></ol></li><li> Secar las células hiladas y fijar las células con paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente durante 10 min bajo una campana química. Lavar 3 veces con PBS (~ 100 l durante unos segundos por lavado). Para la tinción intracelular, permeabilizar las células con 0,5% Triton X-100 en PBS a temperatura ambiente durante 10 min y se lava 5 veces con PBS. NOTA: En todas las etapas, utilizar volu tampón / solución adecuadame para cubrir el perímetro de las células en el portaobjetos. Utilice un bolígrafo barrera hidrofóbica para determinar las células perímetro. Precaución: El paraformaldehído es tóxico. Evitar el contacto con la piel y los ojos. Use equipo de protección personal adecuado. </li><li> células de bloque con 10% de suero normal de cabra en medio RPMI-1640 y se incuba durante la noche a 4 ºC o a temperatura ambiente durante 40 min. Lavar con PBS. </li><li> Incubar con el anticuerpo solo (Ab) o una combinación de ratón y anticuerpos primarios de conejo (ABS) en una dilución 1: 100 (~ 100 l). Incubar durante la noche (18 - 20 h) a 4 ° C. NOTA: En este caso, el ABS monoclonal de ratón incluido: anti-CD14, anti-CD63, anti-CD66b, anti-CD1c, CD15 anti-, y la cadena ligera B-245 anti-citocromo (identificación phox p22-). Conejo policlonal Abs incluye: anti-CD68, anti-CD36, anti-LC3B, anti-mieloperoxidasa, elastasa de neutrófilos (NE), y anti-Nox2 / gp91- Abs phox. controles de isotipo IgG1 purificada incluyen ratón y IgG2, e IgG de conejo. Prepare los Abs de acuerdo con las instrucciones del fabricante y utilizar un volumen adecuado (aproximadamente 100 l) para cubrir el perímetro de las células. </li><li> Se lavan las células y se incuban con anticuerpos secundarios 1/400 Cy2-CF (488a) de cabra conjugado con IgG anti-conejo (verde) y / o Cy5 (CF 647) de cabra conjugado con anti-IgG de ratón (rojo) a temperatura ambiente durante 40 min. NOTA: Diluir y preparar Abs de acuerdo con las instrucciones del fabricante. </li><li> Después del lavado, montar diapositivas con una gota de medio de montaje, que contiene 4 ', 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción nuclear, a continuación, colocar de inmediato la hoja de la cubierta. </li><li> Analizar las muestras por un sistema de escaneo láser confocal utilizando microscopio de fluorescencia y el Plan Apo 40X petróleo objetivo de inmersión. Realizar el análisis dentro de 30 minutos a 2 horas después de la preparación de las diapositivas o mantener a 4 ° C durante la noche. <ol><li> Calcular el área de la celda y la intensidad de fluorescencia utilizando un software de imágenes (por ejemplo, J Imagen). Para co-localización, quantify por software utilizando Manders superposición Coeficiente (MOC) 17. NOTA: Sólo las células con MOC&gt; 0.6 se puede considerar como células con significativa co-localización. </li></ol></li></ol> 3. La transmigración de PMN través de las células endoteliales: Efectos de IL-8 en Fagocito gigante (Gφ) Formación NOTA: El uso de 24 pocillos de cultivo de células permeables insertos para el ensayo de transmigración celular. <ol style="margin-left: 40px;"><li> Escudo de la cámara superior de la pieza de inserción con 150 l de fibronectina a una concentración de 50 mg / ml, y mantener a temperatura ambiente durante 30 min. </li><li> Añadir a la cámara superior 5 x 10 4 EA.hy926 células endoteliales / pocillo, se resuspendieron en 150 ml de formulado medio de Dulbecco modificado de Eagle (medio de crecimiento completo). NOTA: Asegúrese de que la monocapa endotelial es confluentes antes de su uso. </li><li> A la cámara inferior, añadir 700 l de medio de cultivo completo. </li><li> Coloque la permeablecultivo celular inserta en bandejas de racimo y cultivar las células endoteliales EA.hy926 durante 2 días a 37 ° C en 5% de CO 2. NOTA: De forma paralela, en el segundo día de PMN preparar fresco (como se describe en la sección 1). </li><li> Después de 2 días, vuelva a colocar el medio en las cámaras superior e inferior de los insertos. <ol><li> Para la cámara inferior, se añade medio RPMI-1640 suplementado con 10% IH-FCS y la interleucina (IL) -8 a una concentración final de 50 nM / ml. No añadir IL-8 para controlar cámaras inferiores. </li><li> Para cada cámara superior, añadir 10 6 fresca PMN en 100 l de medio RPMI-1640 suplementado con 10% IH-FCS. </li></ol></li><li> Se incuban las bandejas de racimo a 37 ° C en 5% de CO2 durante 90 min. </li><li> Después de 90 minutos de incubación, retirar las células de la parte superior y las cámaras inferiores por separado y contar cada subpoblación. células expresan en cada cámara como un porcentaje del total de células añaden. NOTA: Retire con cuidado las células de la parte superior chamber pipeteando suavemente con el fin de evitar la eliminación de las células endoteliales y transferir a un tubo estéril. Eliminar las células de la cámara inferior con la pipeta y el lavado de la cámara baja con 500 l y la transferencia a un segundo tubo estéril. </li><li> Piscina de 10 6 células de varios pozos de transmigrar (cámara baja) y no migrantes (cámara superior) fracciones PMN y la cultura cada uno por 7 días sin factores de crecimiento como se especifica en los pasos 14 - 16 (sección 1). </li><li> Girar las células en portaobjetos 16 y analizar las células desarrolladas en cada condición de cultivo por microscopía confocal como se describe en la sección 2. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

fagocitos gigantes (Gφ) son una subpoblación recién definida de las células derivadas de neutrófilos que expresan marcadores neutrófilos fundamentales y específicos tales como CD66b / CD15 / CD63 / MPO / NE. Este tipo de fagocito de neutrófilos derivado no se describió en la literatura antes. A diferencia de los neutrófilos que son de corta duración y se someten a la apoptosis, Gφ son Anexina-V-negativo y visualizar la vida útil extendida. Sin embargo, al igual que los neutrófilos, Gφ también internalizar partículas y producen ROS NADPH oxidasa dependiente en respuesta a esas partículas y al PMA. Sin embargo, su capacidad de internalizar OxLDL y en consecuencia para producir ROS son características únicas de Gφ. 14 Un número de factores, se mostró a influir en su desarrollo en cultivo. La falta de citoquinas externos o factores de crecimiento en el medio de crecimiento es esencial (en concreto GM-CSF / IL-4). Sin embargo, la migración de neutrófilos hacia IL-8 resultó ser un factor discriminante entre los que devfugado en Gφ y aquellos que no lo hicieron. Además, la internalización de los restos derivados de los neutrófilos apoptóticos, la expresión de proteínas autofagia (LC3B) y NADPH oxidasa funcional, fueron todos demostrado ser imprescindible para su desarrollo, ya que su inhibición evita la formación Gφ (Figura 1). Al parecer, el desarrollo de estas células gigantes derivadas de neutrófilos difiere de la formación de células gigantes caracterizar en los monocitos / macrófagos linaje. La forma multi-nucleado últimas células gigantes asociados con diversas enfermedades inflamatorias crónicas, 20, 21 mientras que el neutrofílica Gφ descrito aquí desarrollan a través de autophagocytosis, por que envuelve los restos de células y se mantienen en su mayoría mono-nucleado largo de su desarrollo, 14 (raramente sin embargo, a veces un segundo núcleo se puede observar). Por otra parte, una serie de controles de establecimiento de su origen neutrofílica: (1) exprefisión de los marcadores neutropilic específica y la ausencia de marcadores dendríticas y monocitos linaje, (2) su desarrollo obstaculizado en monocitos / PMN co-cultivos, (3) sus diferentes patrones de movimiento en la cultura de los macrófagos (como lo demuestra imágenes de células vivas y hora la microscopía -lapse), 14 (4) su adhesión a la luz platos de plástico y (5) el desarrollo de CD15 pura + / CD14 - PMN adquiridos por citometría de flujo. Algunas de las funciones identificadas in vitro nos pueden dar pistas sobre sus posibles funciones en vivo. Por ejemplo, las capacidades de Gφ de consumir grandes cantidades de gránulos de los neutrófilos y los desechos, la presencia de grandes vacuolas, y la LC3B expresión - una proteína de la autofagia que contribuye a la disminución de la inflamación a través de interacciones de regulación con las vías de señalización inmune innata, 22 - todos los cuales capacidades de soporte de barrido. Como tal, Estos resultados también indican que Gφ podría estar funcionando en sitios inflamatorios donde el sistema Mφ / DC es insuficiente o abrumado, y por lo tanto contribuyen a la resolución de la inflamación. Esta idea podría ser apoyada por el hecho de que en cultivos de monocitos / neutrófilos mixtos se ve obstaculizado el desarrollo Gφ. 14 Además, dado que Gφ expresan receptores de LDL-ox del tesoro (CD36, CD68), internalizar LDLox, y producen ROS en respuesta a la misma, puede indicar que están involucrados en los procesos ateroscleróticos para resolver la inflamación. Desde Gφ desarrolló sólo de los neutrófilos que migraron hacia IL-8, y la transmigración de neutrófilos &#39;a través de monocapas endoteliales hacia IL-8 representa el reclutamiento de neutrófilos a los sitios inflamatorios agudos, este hallazgo también puede apoyar las funciones anti-inflamatorias. Por el contrario, el rendimiento de Gφ en ciertas condiciones inflamatorias podría puedan cumplir constituyentes granulares y ROS, por lo tanto, contribuir a perla inflamación y el daño tisular consistente. 20 Sin embargo, en general, sus habilidades autofágicos indican que Gφ es probable que participan en la disminución de la respuesta inflamatoria en lugar de perpetuarlo. Curiosamente hemos identificado recientemente la presencia de Gφ en placas ateroscleróticas humanas. (en la preparación de). Sin embargo, un gran número de preguntas aún no se han desentrañado. Por ejemplo, son Gφ pro- o anti-inflamatorio? ¿Cuáles son los factores que determinan su formación y función in vitro o in vivo? ¿Qué específica de neutrófilos subpoblación es su célula precursora que facilita su desarrollo en Gφ? Están asociadas con ciertas patologías, y que? En conjunto, lo que plantea cuestiones interesantes en cuanto a su origen y funciones potenciales. Sin embargo los pasos críticos y las trampas dentro del protocolo deben ser tenidos en cuenta. Un paso crítico en el desarrollo de Gφ is cultivando los neutrófilos puros en medio carente de citocinas, factores de crecimiento o antibióticos. Otro paso importante es descartar que Gφ desarrollan a partir de monocitos contaminantes y determinar el origen de Gφ neutrofílica. Por lo tanto, después de la separación de sangre por gradiente discontinuo, los neutrófilos se sometieron además a un paso adicional de purificación mediante citometría de flujo utilizando gating de granulocitos y CD15 + / CD14 - marcadores. El Gφ desarrollado obtiene a partir de los neutrófilos que se purificaron por citometría de flujo separación no difieren de los que no fueron sometidos a esta etapa de purificación. Por lo tanto, la mayoría de los experimentos se llevaron a cabo sin la citometría de flujo etapa de purificación debido a la pérdida de células adicional. Es de destacar que, en algunos casos raros se observaron algunos eosinófilos en la cultura. Su tamaño se mantuvo sin cambios durante todo el período de cultivo. También debemos señalar que, si bien hay una serie de métodospara la separación de los neutrófilos de la sangre humana, el método descrito aquí es el único método que empleamos y por lo tanto no se puede comparar el desarrollo Gφ por otros métodos disponibles para la separación de neutrófilos. Un error importante en la investigación de Gφ resulta de la incapacidad para obtener un número suficiente de población Gφ puro adecuado para diversos ensayos bioquímicos. Es básicamente imposible en las condiciones se llevaron a cabo los experimentos. En primer lugar, el rendimiento de Gφ es baja. De 1,0 x 10 6 PMN sembró sobre 100-200 Gφ desarrollar después de siete días en cultivo, dependiendo del donante de sangre. En segundo lugar, que es básicamente difícil en el momento de separar el Gφ desarrollada en la cultura de los escombros de neutrófilos que queda en el plato. Estas limitaciones hacen que sea prácticamente imposible analizar las células mediante métodos de biología molecular o bioquímica. Por lo tanto, este protocolo se centra en la descripción de la identificación y la función Gφ mediante el uso de la luzy microscopía confocal. Su transformación morfológica de neutrófilos en Gφ en la cultura también fue seguido por imágenes de células vivas y microscopía lapso de tiempo. 14 Al parecer, pueden ser necesarios volúmenes de sangre mucho más grandes con el fin de poner en práctica métodos de biología molecular o bioquímica y superar el bajo rendimiento obtenido y separar el Gφ viable desde los escombros &#39;neutrófilos en el plato. En resumen, hemos descrito recientemente por primera vez el desarrollo de Gφ en la cultura, una subpoblación de los fagocitos de vida larga de origen neutrofílica. Por lo tanto, este es el único método disponible actualmente para obtener Gφ en la cultura, a pesar de las dos limitaciones principales mencionadas anteriormente deben ser superados (el bajo rendimiento de la Gφ obtenido en la cultura y la imposibilidad de separar el Gφ desarrollado a partir de los restos de neutrófilos en la cultura plato). Aún así, su preparación e identificación, se presenta en este protocolo, es essential para los científicos interesados ​​en las respuestas inflamatorias y la biología de neutrófilos y la plasticidad, con el fin de investigar más a fondo el significado potencial y las funciones de Gφ.

neutrófilos polimorfonucleares (PMN) constituyen la mayor población de leucocitos en la sangre, que sirve como primera línea de defensa contra los patógenos invasores mediante la producción de una amplia gama de moléculas citotóxicas. La visión tradicional ha sido durante mucho tiempo el de los fagocitos profesionales que circula en la sangre, de corta duración, que son los primeros en llegar a los sitios inflamatorios agudos para combatir las infecciones y ayuda en la eliminación de patógenos y partículas nocivas. 1 En su estado no activado, los neutrófilos son constitutivamente comprometido con la apoptosis. Cuando la migración de la sangre a los sitios inflamatorios, los neutrófilos se someten a la activación de resolver la inflamación. Fagocitan y matan a los microorganismos invasores, mediante la producción de una gran variedad de moléculas citotóxicas especies reactivas de oxígeno (ROS), enzimas líticas como la elastasa de neutrófilos (NE) y catepsinas con potente efecto microbicida. Con el fin de atrapar los patógenos, los neutrófilos también liberan trampas extracelulares (TNE) Que consisten de hilos de cromatina nuclear que contienen péptidos antibacterianos y diversas enzimas líticas. Sin embargo, una liberación incontrolada de estas moléculas citotóxicas de los neutrófilos también puede perpetuar las respuestas inflamatorias e inducir daño a los tejidos circundantes. 2 Por lo tanto, una autorización eficaz de neutrófilos apoptóticos por macrófagos (Mφ) y células dendríticas (DC) es crucial para resolver la inflamación. 3, 4, 5, 6 En los últimos años, sin embargo, se ha hecho cada vez más evidente que los neutrófilos son células altamente versátiles, cuyas funciones van mucho más allá de la fagocitosis y destrucción de patógenos. 6, 7 Al pasar por el cebado o la activación, la plasticidad de neutrófilos está ganando atención. Por ejemplo, las bacterias y micobacterias desafiaron los neutrófilos se demostró quesecretar interleucina (IL) -10 y controlar la respuesta inflamatoria, lo que sugiere la presencia de respuestas inmuno-reguladora. 8 neutrófilos post-mitótico, se mostró a trans-se diferencian en células Mφ similares, o células DC-como por digestión y presentación de fragmentos de antígeno cuando son tratados con citoquinas y factores de crecimiento, 9, 10 por lo tanto, sirviendo un papel crítico en la integración de innata y adaptativa respuestas. 3, 6 de activación por factores de crecimiento promovidos inmersión de los neutrófilos apoptóticos o restos de células, por consiguiente, facilitar el despacho de los desechos en los sitios inflamatorios y la resolución de la inflamación, 3, 9 en particular cuando el sistema de despacho Mφ / DC es insuficiente o abrumado, 11, 12 sugiere un potencial 'autorregulación' para ayudar a reresolver la respuesta inflamatoria. Esto, ya que la apoptosis es una forma de auto-regulado muerte que puede inhibir la liberación extracelular de compuestos citotóxicos y así evitar lesiones a los tejidos circundantes. 6 La supervivencia prolongada es otra característica de la activación de neutrófilos y se demostró mediante tratamiento con diversos factores del huésped derivada, tales como granulocitos factor estimulante de colonias (G-CSF), factor estimulante de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), citoquinas inflamatorias tales como el interferón ( IFN) -γ, factor de necrosis tumoral (TNF) -a y / o productos derivados de patógenos, por lo tanto, permitiendo que los neutrófilos de modular su respuesta de supervivencia. 6 De hecho, la supervivencia de los neutrófilos es un requisito previo para su plasticidad y haya estado relacionada con su capacidad para llevar a cabo la fagocitosis. 6, 13 Por consiguiente, también fue demostrado asociarse con cambios fenotípicos y funcionales que DEPENded sobre la expresión génica regulada por incremento mediante la inducción de la síntesis de nuevas proteínas implicadas en la prolongación de la vida de los neutrófilos, y la disminución de la apoptosis. 10 A diferencia de los neutrófilos, que son de corta duración y constitutivamente se someten a la apoptosis en la cultura, o los neutrófilos activados por citoquinas / factores de crecimiento, descritos anteriormente, que han extendido la vida útil, se ha identificado recientemente una nueva, pequeña subpoblación de neutrófilos que se desarrolla espontáneamente en cultivo estándar prolongada condiciones de neutrófilos recién aisladas de sangre humana sin añadir externamente citoquinas o factores de crecimiento. 14 fagocitos gigantes Estas células derivadas de neutrófilos, que no se han descrito antes en la literatura se denominaron (Gφ). El Gφ han extendido la vida útil de la cultura, que se han desarrollado completamente dentro de 5-7 días, y se caracterizan por características morfológicas únicas, la expresión fenotípica y funciones. Se enormemente agrandadas debido a autophagocytosis de los restos de neutrófilos muertos, vacuolizadas, y contener fagolisosomas. El Gφ expresan el marcador de gránulos de los neutrófilos específico - grupo de diferenciación (CD) 66b, los marcadores de gránulos azurófilos - CD63 y mieloperoxidasa (MPO) y los marcadores de neutrófilos adicionales tales como CD11b, NE, CD15, las subunidades de NADPH oxidasa gp91- phox y p22- phox, y el -LC3BII marcador de autofagia. 14, 15 Funcionalmente, se activa de recogida de bolas de látex y partículas de zymosan, y generar ROS en respuesta a zymosan y forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) estimulación. Curiosamente, a diferencia de los neutrófilos frescas, Gφ también intensamente expresan los receptores scavenger CD68 y CD36, asimilación de resultados oxida las lipoproteínas de baja densidad (LDL-ox), y generan ROS en respuesta a la estimulación con LDLox. Además, Gφ carecen de los marcadores de linaje monocíticas CD14, CD16 y CD163 o los marcadores dendríticas CD1c y CD141. Por otra parte, phagocytosis y la autofagia y probablemente funcional NADPH oxidasa son requisitos previos para su desarrollo. Este puesto, la fagocitosis-inhibidor cytochalsin B, los inhibidores de la autofagia 3-metiladenina (3-MA) ​​y bafilomycin (BafA1) y el inhibidor de la NADPH oxidasa - difenilen yodonio (DPI) - impedido su desarrollo. Además, los monocitos / neutrófilos co-cultivos, así como la exposición a la hipoxia intermitente obstaculizado su desarrollo, mientras que la adaptación a la hipoxia sostenida de neutrófilos fue evidente. 14,15 Su desarrollo se sugiere en la cultura se ilustra en la Figura 1 .El protocolo en el presente documento se describe paso a paso la preparación de Gφ recién aisladas de neutrófilos circulantes de la sangre humana, su desarrollo, identificación y algunas características básicas. Este protocolo se puede utilizar para investigar más y revelar el amplio espectro y las funciones de estos recién descrito e intrigante derivada de neutrófilos Gφ con el fin de characterize su significado y sus funciones potenciales. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig1.jpg"> Figura 1: Representación esquemática de Desarrollo células gigantes en 7 culturas Día de neutrófilos. Se sugiere que en los sitios inflamatorios (1) los neutrófilos experimentan muerte celular por apoptosis, y (2) rodeados-membrana de liberación fragmentos que contienen restos nucleares, gránulos (verde y puntos rojos), y otros componentes subcelulares que desencadenan mecanismos autofagia. (3) los fagocitos gigantes (Gφ) desarrollar en cultivos de neutrófilos a largo plazo carentes de citocinas o factores de crecimiento mediante la internalización de cuerpos apoptóticos y restos de neutrófilos, mientras se mantiene oxidase.They NADPH funcionales se caracterizan por varios neutrofílica CD66b + / CD63 + / MPO + / CD15 + / CD11b + / marcadores NE, grandes fagosomas que encierran los gránulos y los restos celulares, y los receptores scavenger CD36 y CD68. gb1; son en su mayoría células mononucleadas, capaces de internalizar también diversas partículas y las LDL oxidadas y generar ROS. Las membranas de las vacuolas de llenado Gφ contienen LC3B (marcado en azul oscuro), un marcador de membrana autophagosomal, lo que sugiere una asociación estrecha entre la autofagia y la formación de los fagocitos gigante. Gφ no se desarrollan en un medio que contiene GM-CSF / IL-4. Además, los inhibidores tales como el inhibidor de la NADPH oxidasa - yodonio difenileno (DPI), los inhibidores de la autofagia 3-metiladenina (3-MA) ​​y bafilomycin (BafA1) y el inhibidor de la fagocitosis citocalasina B (. Cito b) eliminar su formación. (4) funciones Gφ potenciales en vivo pueden incluir propiedades anti-inflamatorias o pro-y participación en los procesos ateroscleróticos (esta cifra se basa en nuestros hallazgos, 15 y 14 se modificó a partir del editorial que acompaña por BErton 20). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Juego de venas estériles para cuero cabelludo (21GX3/4)&nbsp;</td><td>Bio Diagnóstico Ltd.</td><td># 20080312</td><td>Aguja de estril A para venipección</td></tr><tr><td>VACUETTE HOLDEX Soporte de un solo uso PP</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 450263</td><td>Para asegurar durante la venopunción&nbsp;</td></tr><tr><td>Tubo VACUETTE K3E K3EDTA (16 x 100/9 mL)</td><td>Greiner Bio-One</td><td># 455036</td><td>Tubo estéril para la extracción de sangre</td></tr><tr><td>Nunclon MultiDish (24 pocillos x 1 ml)</td><td>Thermo Scientific</td><td># 142475</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de centrífuga cónica de polipropileno (50 ml)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>#</td> E14103PJ <td></td></tr><tr><td>Transwell-24 pocillos (ensayo de transmigración)</td><td>Corning</td><td># CA-3415</td><td>Membrana de policarbonato, 6,5 mm de diámetro, 3 &mu; m poros)&nbsp;</td></tr><tr><td>RPMI-1640 medio</td><td>BioIndustries</td><td># 01-100-1A</td><td>No agregue antibióticos&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>EA.hy926 (ATCC CRL2922)&nbsp; &nbsp;</td><td>BioIndustries</td><td># CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' formulado por ATCC S&nbsp; Águila modificada' s Medium</td><td>BioIndustries</td><td># 302002</td><td>medio de crecimiento completo</td></tr><tr><td>Polisacarosa - Histopaco1119</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1119-1</td><td>Grado de cultivo de tejidos</td></tr><tr><td>Polisacarosa - Histopaque1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 1077-1 Grado de cultivo de</td><td>tejidos&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS) - libre de iones</td><td>BioIndustries</td><td># 02-023-1A Grado de</td><td>biología celular y biología molecular</td></tr><tr><td>Suero de ternero fetal inactivado por calor (HI-FCS)</td><td>BioIndustries</td><td># 04-121-1B</td><td>Grado de biología celular o grado de cultivo de tejidos, bajo LPS</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td># S3014</td><td>Grado de biología molecular, adecuado para cultivo celular</td></tr><tr><td>Paraformaldehído, 16%</td><td>Microscopía electrónica Ciencias</td><td># 15710</td><td>Grado de bología celular o grado de cultivo de tejidos (solo 16% PFA)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># 9002-93-1 Grado de</td><td>biología molecular&nbsp;</td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>BioIndustries</td><td># 04-009-1</td><td>Biología celular y biología molecular grado</td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>BioIndustries</td><td># 031021B</td><td>Grado de cultivo de tejidos&nbsp;</td></tr><tr><td>mayo-gr&uuml; nwald</td><td>Sigma-Aldrich</td><td># MG500</td><td>Grado de biología celular-(procedimiento No GS-10)Kit de</td></tr> <tr><td>tinción de Giemsa Sigma</td><td></td><td># 48900</td><td>Grado de biología celular-(procedimiento No GS-10)</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>BioIndustries</td><td>#</td> 03090105 <td></td></tr><tr><td>Interleucina-8 humana (CXCL8)</td><td>PeproTech</td><td># 200-08-5</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD14 (clon 5A3B11B5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-58951</td><td>IgG2b de ratón; expresado por&nbsp; monocitos</td></tr><tr><td>Anti-CD63 (clon MX-49.129.5)</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-5275</td><td>IgG1 de ratón; expresado por neutrófilos</td></tr><tr><td>Anti-CD66b (clon 80H3)</td><td>AbD Serotec</td><td># MCA216</td><td>IgG1 de ratón; expresado por neutrófilos</td></tr><tr><td>Anti-CD1c (BDCA-1) (clon AD5-8E7)</td><td>MACS Miltenyi Biotec</td><td># 130-090-695</td><td>IgG2a de ratón; expresado por&nbsp; células dendríticas</td></tr><tr><td>Anti-CD15 (clon MY-1)</td><td>Abcam</td><td># ab754</td><td>IgM de ratón; expresado por neutrófilos</td></tr><tr><td>Anti-Citocromo b-245 Cadena ligera (p22-phox) (clon 44.1)</td><td>BioLegend</td><td># 650001</td><td>ratón IgG2a; para reconocer el complejo de neutrófilos NADPH oxidasa</td></tr><tr><td>Anti-CD68</td><td>Protein Tech</td><td># 16192-1-AP</td><td>Rabbit IgG; para reconocer el receptor de eliminación de oxLDL&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-LC3B</td><td>Sigma</td><td># L7543</td><td>Conejo IgG&nbsp;</td></tr><tr><td>Anti-mieloperoxidasa</td><td>Abcam</td><td># ab45977</td><td>IgG de conejo</td></tr><tr><td>Elastasa anti-neutrófilos</td><td>Calbiochem</td><td># 481001</td><td>IgG de conejo</td></tr>;<tr><td>Anti-NOX2 (gp91-phox)</td><td>Abcam</td><td># ab131083</td><td>IgG de conejo</td></tr><tr><td>Anti-CD36 (SR-B3)</td><td>Novus Biologicals</td><td># NB400-144</td><td>IgG de conejo IgG1</td></tr><tr><td>de ratón purificada IgG1, &kappa; Control de isotipo (clon MG1-45)</td><td>BioLegend</td><td># 401401</td><td>Anticuerpo utilizado como control de isotipo</td></tr><tr><td>Ratón purificado IgG2a, &kappa; Control de isotipo (clon MOPC-173)</td><td>BioLegend</td><td># 400263</td><td>Anticuerpo utilizado como control de isotipo</td></tr><tr><td>IgG de conejo normal</td><td>Santa Cruz Biotechnologies</td><td># sc-2027</td><td>Anticuerpo utilizado como control de isotipo</td></tr><tr><td>CF488A Cabra Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20012</td><td>Anti-Conejo IgG con el colorante verde fluorescente CF488A</td></tr><tr><td>CF647 Cabra Anti-Conejo IgG (H + L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20043</td><td>Anti-Conejo IgG con el colorante rojo fluorescente CF647</td></tr><tr><td>CF488A Cabra Anti-Ratón IgG (H + L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20010</td><td>Anti-Mouse IgG con el colorante verde fluorescente CF488A</td></tr><tr><td>CF647 Cabra Anti-Mouse IgG (H + L)</td><td>Biotium&nbsp;</td><td># 20040</td><td>Anti-Mouse IgG con el tinte fluorescente rojo CF647</td></tr><tr><td>Medio de montaje fluorescente con DAPI</td><td>Vectashield H-1000; Laboratorio Vectorial Inc.</td><td># E19-18</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio de barrido láser confocal de tinción nuclear (LSM 700)&nbsp; &nbsp; &nbsp;</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3523000380</td><td>Plan Apo 40X objetivo de aceite de inmersión&nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Software Zeiss CLSM (ZEN 2010)</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH</td><td>versión 6.0</td><td>Para el análisis de colocalización</td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>Wayne Rasband, NIH, EE. UU.</td><td>versión 1.49k</td><td>Para la determinación de áreas celulares e intensidad de fluorescencia</td></tr><tr><td>Microscopio óptico (Axiovert 25)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 201060153</td><td>Examen de células en cultivo</td></tr><tr><td>Centrífuga (Megafuge 1.0 R)</td><td>Heraeus Instruments</td><td># D-37520</td><td>Separación de células de la sangre; Preparación de citospins</td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente invertido (Zeiss Axio Observer Z.1)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 3834001470</td><td>Demostración del desarrollo de fagocitos gigantes</td></tr><tr><td>Sistema de incubación a temperatura controlada (Cube& Box)</td><td>Life Imaging Services</td><td></td><td>Sistema de control de temperatura para microscopios</td></tr><tr><td>High&nbsp; cámara CCD digital de resolución (AxioCam HRm)</td><td>Carl Zeiss</td><td>Ser.# 117090279</td><td>Para capturar datos de imagen de alto contraste&nbsp; de objetos celulares examinados</td></tr><tr><td>Pluma de barrera hidrofóbica (Elite PAP Pen)</td><td>Biosystems de diagnóstico</td><td># K039</td><td>Para definir el perímetro celular para la tinción con inmunofluorescencia</td></tr></tbody></table>

el desarrollo y la identificación de una subpoblación de novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante in vitro

Development and Identification of a Novel Subpopulation of Human Neutrophil-derived Giant Phagocytes In Vitro

Los neutrófilos (PMN) son mejor conocidos por sus funciones fagocíticas contra la invasión de patógenos y microorganismos. Tienen la vida media más corta entre los leucocitos y en su estado no activado constitutivamente están comprometidos con la apoptosis. Cuando reclutado a los sitios inflamatorios para resolver la inflamación, producen una gran variedad de moléculas citotóxicas con matar a los antimicrobianos potentes. Sin embargo, cuando estas moléculas citotóxicas potentes se liberan de una manera incontrolada que pueden dañar los tejidos circundantes. En los últimos años, sin embargo, la versatilidad de neutrófilos se evidencia cada vez más, mediante la demostración de las funciones de plasticidad e inmunorreguladoras. Recientemente hemos identificado una nueva subpoblación de neutrófilos derivado, que se desarrolla de forma espontánea en condiciones de cultivo estándar sin la adición de factores de citoquinas / de crecimiento tales como granulocitos factor estimulante de colonias (GM-CSF) / interleucina (IL) -4. Sus capacidades fagocíticas de los restos de neutrófilos contribuyen en gran medida a aumentar sutamaño inmensamente; fagocitos gigantes por lo que se denominan (Gφ). A diferencia de los neutrófilos, Gφ se vivió en la cultura. Expresan el grupo de diferenciación (CD) marcadores de los neutrófilos CD66b / CD63 / CD15 / CD11b / mieloperoxidasa (MPO) / elastasa de los neutrófilos (NE), y están desprovistos de los marcadores de linaje de monocitos CD14 / CD16 / CD163 y los marcadores de CD1c / CD141 dendríticas . También se tienen en marcha látex y zimosán, y responden por el estallido oxidativo a la estimulación con zimosán opsonizado-y PMA. Gφ también expresan el eliminador de los receptores CD68 / CD36, ya diferencia de los neutrófilos, internalizar la lipoproteína de baja densidad oxidada (LDLox). Por otra parte, a diferencia de los neutrófilos frescas, o monocitos cultivados, responden a la captación de oxLDL por el aumento de la producción de especies reactivas de oxígeno (ROS). Además, estos fagocitos contienen la proteína-1 de la cadena ligera asociada a los microtúbulos 3B (LC3B) vacuolas recubiertos, lo que indica la activación de la autofagia. El uso de inhibidores específicos, es evidente que tanto la fagocitosis y la autofagia son prerequisites para su desarrollo y es probable que la NADPH oxidasa dependiente de ROS. Se describe aquí un método para la preparación de esta nueva subpoblación de células fagocíticas, neutrófilos derivado de larga vida en cultivo, su identificación y sus características conocidas en la actualidad. Este protocolo es esencial para la obtención y caracterización de Gφ con el fin de investigar más a fondo su significado y funciones.

Autophagocytosis de neutrófilos y el Desarrollo de la Cultura Autophagocytosis de neutrófilos y su desarrollo en Gφ plazo de 7 días en cultivo se muestra en las figuras 3 y 4. Por días 4 - 7, su tamaño era muy ampliada, 15 y autophagosytosis era evidente tan pronto como 90 minutos después del co-cultivo de los neutrófilos con manchas de membrana fluorescentes (PKH-26, rojo; PKH-67, verde). 14 Como control para esta subpoblación de neutrófilos, algunas culturas neutrófilos también fueron tratados con GM-CSF / IL-4. Las citoquinas de las células tratadas aumentaron de tamaño dentro de los 7 - 14 días en cultivo como se describe anteriormente. 18, 19 Pero, eran más pequeños que Gφ y tenía proyecciones citoplasmáticas que se asemeja DC-como las células (Figura 5), como se informó anteriormente b y Oehler et al. 19 Además, el GM-CSF / IL-4 células tratadas fueron negativos o tuvo una baja expresión de CD66b, 15 que demuestra claramente las diferencias morfológicas y funcionales potencialmente también. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig3.jpg"> Figura 3: Autophagocytosis en el desarrollo de fagocitos gigante (Gφ) en cultivo. neutrófilos purificados recién aislados se marcaron con PKH-67 (verde) o de membrana (rojo) colorantes fluorescentes-26 PKH en el tiempo cero, y luego co-cultivadas y siguieron hasta siete días. Las células se centrifugaron sobre portaobjetos de vidrio, los núcleos se tiñeron con DAPI y las muestras se analizaron por microscopía confocal. Autophagocytosis ya es perceptible después de 90 min de co-cultivo. La fusión de rojo y verde a amarillo y naranja es claramente evidente en el desarrollo de Gφ.archivos / ftp_upload / 54826 / 54826fig3large.jpg "target =" _ blank "&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig4.jpg"> Figura 4: Desarrollo de gigante fagocitos (Gφ) en cultivo. neutrófilos purificados recién aislados fueron seguidos hasta 7 días en cultivo. Las células se centrifugaron en portaobjetos de vidrio en los intervalos de tiempo indicados, se tiñeron con May-Grunewald Giemsa, y se analizaron con un microscopio de campo brillante. Un individuo con pocos eosinófilos se presenta para comparación. Tenga en cuenta que el tamaño de los eosinófilos se mantiene sin cambios en cultivo. aceite de aumento de 100X. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig5.jpg"> Figura 5: Comparación entre el desarrollo de gigante fagocitos (G φ) y GM-CSF / IL tratada neutrófilos en la Cultura. (A) de mayo de Grunwald-Giemsa manchadas neutrófilos cultivaron sin (Gφ) y con GM-CSF / IL-4 durante 7 días. Las muestras fueron analizadas con una microscopía de campo claro. Magnificación, X40. Las células desarrolladas en cultivos con medio suplementado con GM-CSF / IL-4 muestran proyecciones citoplasmáticas generalizadas pero son más pequeños que Gφ. (B) los neutrófilos recién aislados se marcaron con-26 PKH colorante (rojo) y se cultivaron en medio libre de citoquinas durante 7 días o etiquetados con-67 PKH colorante (verde) y se cultivaron en medio suplementado con GM-CSF / IL-4 para 7 días. Entonces, las células desarrolladas se mezclaron en una relación 1: 1 y co-cultivaron durante 2 hr. Las células se fijaron y se analizaron por micr confocaloscopy. Esta cifra ha sido modificado de referencia. 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig5large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para investigar más a fondo el curso del desarrollo Gφ, sus cambios morfológicos también fueron seguidos por microscopía de lapso de tiempo. Video-1 (día 3 hasta el día 4) y video-2 (día 4 al día 5) demuestran su desarrollo en cultivos de neutrófilos purificados. Estos son Gφ no adherente o ligeramente adherente con capacidad de movimiento limitado e ingieren activamente rodea restos de neutrófilos y escombros. En vídeo-3, el movimiento de derivados de monocitos Mφ y Gφ se compara en un cultivo de monocitos / neutrófilos mixto. El Mφ se arrastra de forma activa (izquierda, células sin etiqueta). El Gφ (derecha), es brillante células marcadas PKH-26. Video-1: Demuestra el desarrollo de gigante en fagocitos purificada PMN culturas en los Días 3 - 4 por microscopía de lapso de tiempo. Los neutrófilos fueron seguidos en la cultura desde el día 3 hasta el día 4 por sistema de microscopía de lapso de tiempo microscopy.The lapso de tiempo se compone de microscopio de fluorescencia invertido motorizado, y una cámara CCD B / W de alta resolución, con una etapa en la incubadora. Adquisición de imágenes de captura de lapso de tiempo fue tomada cada 10 minutos. Publicado originalmente en referencia 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-1.mpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov2.jpg"> Video-2: Demuestra el desarrollo de gigante en fagocitos purificada PMN Cultura en los días 4 - 5 Por Time-lapse microscopía. Los neutrófilos fueron seguidos en la cultura desde el día 4 al día 5 por microscopía de lapso de tiempo. El sistema de microscopía de lapso de tiempo se compone de microscopio de fluorescencia invertido motorizado, y una cámara CCD B / W de alta resolución, con una etapa en la incubadora. Adquisición de imágenes de captura de lapso de tiempo fue tomada cada 10 minutos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-2.mp4" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver el vídeo.</a> <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54826/54826mov3.jpg"> Video-3: Una Fagocito gigante y un macrófago Desarrollado en Co-cultura. Monocitos / neutrófilos de co-cultivo se realizó un seguimiento desde el día 4 hasta el día 5 por microscopía de lapso de tiempo. macrófagos derivados de los monocitos (izquierda); brillante (PKH-26 manchado celular) fagocitos gigante derivada de neutrófilos (derecha). El sistema de microscopía de lapso de tiempo de vídeo se compone de micr fluorescente invertida motorizadooscope, y una cámara CCD B / W de alta resolución, con una etapa en la incubadora. Adquisición de imágenes de captura de lapso de tiempo fue tomada cada 10 minutos. Publicado originalmente en referencia 14 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/54826/Video-3.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para ver el vídeo.</a> La expresión de marcadores de fagocitos gigantes El origen de neutrofílica Gφ se verificó mediante la expresión positiva de los siguientes marcadores de los neutrófilos CD66b / CD63 / MPO / NE / CD15 (Figura 6). El Gφ también expresó NADPH oxidasa, los receptores scavenger LDLox - CD68 y CD36, y contenía vacuolas recubiertas con LC3B y agregados (identificadas por transferencia Western como LC3BII 15), lo que demuestra la presencia de un marcador de autofagia. Sin embargo, eran negativos para el linaje de monocitos (CD14, CD16 y CD163) y DendritIC (células CD141) CD1c y marcadores, lo que sugiere que Gφ no surgió a partir de monocitos contaminantes. <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig6.jpg"> Figura 6: La expresión de diversos marcadores para los neutrófilos, monocitos y células dendríticas en el gigante fagocitos (Gφ) después de 7 días de cultivo. expresión positiva de los neutrófilos específica marcador CD66b gránulos, gránulos azurófilos al marcadores CD63 y MPO, elastasa de neutrófilos y CD15. expresión negativa para los CD1c y CD141 marcadores dendríticas y los marcadores de linaje monocitos CD14, CD16 y CD163. Además, Gφ expresó el marcador LC3B autofagia, los receptores scavenger CD68 y CD36 y las subunidades de la NADPH oxidasa subunidades gp91-phox / p22-phox. Los núcleos se tiñeron con DAPI, y las muestras se analizaron por microscopía confocal. Esta cifra ha sido modificado a partir de las referencias. 14 p&gt;, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Funciones de Gφ - NADPH oxidasa de activación, ROS Producción y fagocitosis: La fagocitosis de perlas de látex y zymosan opsonizado fue evidente en Gφ. Gφ también generó basales de ROS (Figura 7A), y respondió a zymosan y la estimulación con PMA por el estallido oxidativo (Figura 7B-D). Sin embargo, a diferencia de los monocitos o neutrófilos, Gφ genera ROS también en respuesta a la estimulación LDLox y se tiñeron por Oil Red O (Figura 7B, F). Es de destacar que el tratamiento de los neutrófilos frescas con el inhibidor de la NADPH oxidasa - DPI, no sólo inhibe la producción de ROS, sino también pformación Gφ revented en la cultura, lo que sugiere que la señalización de ROS es esencial para la formación Gφ. 14, 15 <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig7.jpg"> Figura 7: estallido oxidativo, la fagocitosis, y LDLox captación por Giant fagocitos (Gφ). De producción (A) Basal ROS es evidente en los lisosomas de Gφ. (B) la producción de ROS en respuesta a las LDL oxidadas (LDLox), PMA y zimosán (partículas de zymosan se observan con claridad). (C) de nitro-tetrazolio (NBT) de prueba en Gφ que muestra la actividad estallido respiratorio sin y con PMA (diapositivas son sin mancha, pero las inserciones se tiñeron con May Grunwald-Giemsa). (D) Prueba de NBT y mayo de Grunewald-Giemsa manchadas Gφ con PMA y PMA / DPI que inhibió la NADPH oxidasa y ROS. (E) La fagocitosis de LATEX y zimosán opsonizado-IgG en PKH-26 (rojo) las células teñidas. (F) Oil Red O tinción de LDLox no tratado y tratado Gφ. Esta cifra ha sido modificado a partir de las referencias. 14, 15 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Al otro lado de la transmigración de PMN células endoteliales Con el fin de identificar posibles neutrófilos subpoblaciones que podrían convertirse en Gφ, la migración de los neutrófilos a través de monocapas de células endoteliales se determinó (Figura 8A). Después de 90 minutos, 62,3 ± 12,2% de los neutrófilos transmigró través de las células endoteliales hacia IL-8 en el compartimiento inferior. De nota, Gφ positivo para CD66b / CD15 / LC3B desarrollado sólo de la población transmigrado de los neutrófilos, mientras que las células que se desarrollaron a partir de la fracción de neutrófilos no migrar eran más pequeñas en tamaño y negativo para los marcadores de neutrófilos CD66b / CD15 (Figura 8B, 8C) . <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54826/54826fig8.jpg"> Figura 8: Efectos de la IL-8 dependiente de PMN transmigración a través de células endoteliales en Giant Fagocito Formation (Gφ). (A) Un esquema que ilustra ensayo de transmigración de neutrófilos a través de monocapas de células endoteliales (EC) hacia IL-8. Este ensayo se puede considerar como un modelo para los neutrófilos reclutamiento a los sitios inflamatorios agudos. (B - C) En el ensayo de migración celular (especificado en el protocolo 3), transmigrating (B) y no migrantes (C) neutrófilos fracciones se cultivaron durante siete días sin factores de crecimiento (como en el protocolo 1). Luego, las células se centrifugaron sobre portaobjetos de vidrio y se analizaron por microscopía confocal. Las células fijadas se tiñeron para CD66b (rojo), LC3B (verde) y CD15 (rojo). Los núcleos se tiñeron con DAPI (azul). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54826/54826fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Se describe aquí un método para la obtención y la identificación de una subpoblación recién caracterizado de los fagocitos gigantes derivadas de neutrófilos. Estas células se desarrollan en cultivo a partir de neutrófilos de sangre humana fresca, y se caracterizan por la fagocitosis, la autofagia, inmensamente gran tamaño, y la vida útil extendida. Este método es esencial para investigar más a fondo esta subpoblación única de neutrófilos derivado.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro

Neutrophils (PMN) are best known for their phagocytic functions against invading pathogens and microorganisms. They have the shortest half-life amongst ...

Los objetivos generales de este método son generar e identificar fagocitos gigantes cultivados in vitro derivados de neutrófilos humanos circulantes para la investigación de su papel en las respuestas inmunitarias inflamatorias y antiinflamatorias. Este método se puede utilizar para obtener e identificar una nueva subpoblación de fagocitos gigantes que se desarrollan a partir de neutrófilos humanos para mantener las condiciones de cultivo a largo plazo. Esta técnica se puede utilizar para investigar más a fondo la importancia y las funciones de los fagocitos gigantes, así como para responder a preguntas clave sobre su activación y plasticidad.Eva Leder, nuestra asistente de investigación, y Oksana Rogovoy, postdoctoral, ambas de mi laboratorio, harán una demostración del procedimiento. Utilice un juego de venas estériles del cuero cabelludo para obtener al menos 40 mililitros de sangre venosa de un voluntario joven y sano. A continuación, mezcle suavemente la sangre en una campana de flujo laminar de bioseguridad.Diluir de 10 a 12 mililitros de alícuotas de la muestra de sangre entera hasta un volumen final de 24 mililitros con PBS sin iones precalentado que contenga un 2% de FCS inactivado por calor. A continuación, añada 12 mililitros de polisacarosa 1119 al fondo de un tubo de centrífuga cónica de polipropileno estéril de 50 mililitros por alícuota de muestra de sangre, seguido de la cuidadosa superposición de 12 mililitros de polisacarosa 1077 sobre la solución de gradiente de polisacarosa 1119. Pipetear cuidadosamente 24 mililitros de sangre diluida en tubos individuales de las soluciones de gradiente de densidad y separar las células por centrifugación.Se deben observar dos capas opacas resultantes. Deseche el líquido hasta 0,5 centímetros por encima de la capa de células mononucleares en cada tubo. A continuación, transfiera las células mononucleares de cada muestra a un único tubo nuevo.A continuación, deseche el líquido restante hasta 0,5 centímetros por encima de la célula polimorfonuclear o capa de PMN y transfiera los PMN de cada muestra a un tubo nuevo diferente. Lavar los PMN en un volumen final de 30 mililitros de PBS que contenga un 2% de FCS inactivados por calor, seguido de una lisis de los glóbulos rojos con tres mililitros de cloruro de sodio hipotónico al 0,2% helado estéril. Después de 30 segundos en hielo, restaure la isotonicidad con tres mililitros de cloruro de sodio estéril frío al 1,6%.Luego agregue seis mililitros de 37 grados Celsius RPMI 1640 Medio suplementado con FCS inactivado por calor y recoja las celdas por centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en cuatro mililitros de RPMI 1640 suplementado con FCS inactivado por calor al 10%. Después de contar, ajuste la concentración a 1,25 a 1,5 veces 10 por el sexto PMN por mililitro de medio de cultivo y coloque un mililitro de células por pocillo en pocillos individuales de una placa de 24 pocillos.A continuación, coloque la placa en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% a 37 grados centígrados, alimentando los cultivos mediante la sustitución suave de la mitad del medio con medio RPMI 1640 fresco suplementado con FCS inactivado por calor al 10% cada tres días. Los neutrófilos se diferenciarán en fagocitos gigantes a los siete días de cultivo. En el séptimo día de cultivo, retire con cuidado la mitad del medio de cada pocillo.A continuación, pipetee enérgicamente el medio restante para eliminar los fagocitos gigantes ligeramente adheridos. Transfiera las células desprendidas de dos a cuatro pocillos de cada grupo de tratamiento a tubos cónicos individuales de 15 milímetros y recoja las células por centrifugación, resuspendiendo los gránulos en 100 a 120 microlitros de medio por tubo. A continuación, equipe dos o tres soportes por grupo de tratamiento con portaobjetos de microscopio, tarjetas de filtro y embudos.A continuación, agregue todo el volumen de células de cada tubo en el embudo Cytospin apropiado. A continuación, cargue los soportes en un Cytospin y gire las células en los portaobjetos. Seque los portaobjetos centrifugados durante 10 minutos.A continuación, utilice un marcador estable al agua para dibujar una barrera hidrofóbica alrededor de las células y fije las muestras con un 4% de paraformaldehído bajo una cubierta química a temperatura ambiente. Después de 10 minutos, enjuague brevemente los portaobjetos tres veces con aproximadamente 100 microlitros de PBS por lavado. A continuación, permeabilice las células con Triton X-100 al 0,5% en PBS durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguidos de cinco lavados con PBS, como se acaba de demostrar.Bloquee la unión inespecífica con suero de cabra normal al 10% en RPMI 1640 Medium durante el período de tiempo adecuado seguido de un solo lavado PBS. Ahora, agregue una pequeña cantidad de agua a la caja para mantener la humedad y luego etiquete las células con aproximadamente 100 microlitros del anticuerpo primario apropiado de interés durante la noche a cuatro grados Celsius en una cámara oscura humidificada. A continuación, realice un solo lavado con PBS y, a continuación, añada el anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia adecuado.Después de 40 minutos a temperatura ambiente protegidos de la luz, lavar las muestras para eliminar el exceso de anticuerpos y montar los portaobjetos con una gota de medio de montaje por muestra y un cubreobjetos. Analice los portaobjetos mediante microscopía de fluorescencia de barrido láser confocal en un plazo de 30 a 120 minutos con un objetivo de aceite de inmersión 40X. A continuación, calcule el área de la célula, la intensidad de fluorescencia y la colocalización utilizando el software adecuado.En estas imágenes se puede observar el desarrollo de neutrófilos en fagocitos gigantes dentro de los siete días posteriores al cultivo. La autofagocitosis es evidente a los 90 minutos después del cultivo de neutrófilos con tinciones fluorescentes en la membrana con un diámetro celular muy grande aparente a los cuatro a siete días. Sin embargo, si los cultivos de neutrófilos se complementan con GM-CSF e IL-4, las células muestran un diámetro general más pequeño y proyecciones citoplasmáticas que se asemejan a las células dendríticas.La microscopía de lapso de tiempo de los fagocitos gigantes en los días tres a cuatro y cuatro a cinco de cultivo revela células poco o ninguna o ninguna adherente con una capacidad de movimiento limitada que ingiere activamente los restos y desechos de neutrófilos circundantes. En este cultivo mixto de neutrófilos monocitarios, la migración de un macrófago rastrero activo puede compararse con el movimiento casi estacionario de un fagocito gigante marcado con fluorescencia en el mismo pocillo de cultivo. El origen neutrofílico de los fagocitos gigantes puede verificarse por su expresión positiva de marcadores de no neutrófilos y su falta de expresión de marcadores de células monocíticas y dendríticas.Los fagocitos gigantes también generan especies reactivas basales de oxígeno y responden a la estimulación de zymosan y PMA por estallido oxidativo. Sin embargo, a diferencia de los monocitos o los neutrófilos, también responden mediante ráfagas oxidativas a la estimulación de lipoproteínas oxidadas de baja densidad. Una vez dominada, esta técnica se puede completar en seis o siete días.Al intentar este procedimiento, es importante recordar reemplazar la mitad del medio suavemente cuando alimente los cultivos de neutrófilos. Después de este procedimiento, se pueden realizar otras técnicas de tinción para responder preguntas sobre las funciones adicionales de estas intrigantes células in vitro e in vivo. Esta técnica podría allanar el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los neutrófilos exploren la activación y la plasticidad de los neutrófilos e identifiquen estas células in vivo en condiciones fisiológicas y fisiopatológicas en humanos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo obtener e identificar fagocitos gigantes en cultivo. No olvide que trabajar con sangre humana puede ser potencialmente infeccioso y que es imprescindible tomar precauciones como el uso de guantes y desechar todos los líquidos y el uso de equipos desechables en los contenedores de riesgo biológico apropiados al realizar este procedimiento.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Las trampas de neutrófilos extracelular (TNE) es un importante mecanismo de inmunidad innata para luchar contra las bacterias patógenas, hongos y parásitos. A continuación se describen los métodos para aislar a los granulocitos neutrófilos de la sangre humana y para activarlos para formar NET. Se presentan las técnicas de preparación para visualizar NET en la microscopía óptica y electrónica.

Las trampas de neutrófilos extracelular: Cómo generar y visualizarlas

Se muestra, cómo el uso de 2-fotón microscopio para la observación de la dinámica de los granulocitos neutrófilos en los pulmones infectados, mientras que fagocitan los agentes patógenos o producir trampas de neutrófilos extracelular (NET).

La observación directa de la fagocitosis y la formación de NET-por los neutrófilos en los pulmones infectados con dos fotones Microscopía

Este video muestra una técnica in vitro para generar y aislar trampas extracelulares (NETs) de neutrófilos. Los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica y se estimulan con acetato de forbol miristato (PMA) para producir NET. Durante la incubación, los neutrófilos se someten a un proceso de muerte celular (NETosis) para liberar NETs que comprenden cromatina descondensada mezclada con proteínas citoplasmáticas granulares.

Una técnica in vitro para generar trampas extracelulares de neutrófilos humanos

Los neutrófilos desempeñan un papel importante no solo en la defensa del huésped contra los microorganismos invasores, sino que también están implicados en la vigilancia inmunitaria de las células tumorales. En este trabajo describimos técnicas relacionadas con el aislamiento de neutrófilos con propiedades antitumorales y métodos para monitorizar la función de neutrófilos antitumorales in vitro e in vivo.

Aislamiento y caracterización de los neutrófilos con propiedades antitumorales

Los neutrófilos son el tipo más abundante de glóbulos blancos. Aquí se describe el aislamiento de neutrófilos de la sangre humana mediante el método de separación en gradiente de densidad y la diferenciación de células promielocíticas humanas (HL60) a lo largo de la vía granulocítica; para probar su papel en la sensibilidad de las células de linfoma a los agentes antilinfomas.

Aislamiento de neutrófilos y análisis para determinar su papel en el linfoma de células sensibles a los agentes terapéuticos

Este manuscrito describe un método simple para medir el pH phagosomal y zona, así como el pH citoplasmático de los neutrófilos humanos y de ratón utilizando el indicador radiométrica seminaphthorhodafluor (SNARF) -1, o S-1. Esto se consigue utilizando células vivas microscopía de fluorescencia confocal y análisis de imágenes.

Imágenes de la Neutrófilos Fagosoma y el citoplasma usando un indicador de pH Ratiometric

Aquí, presentamos un protocolo para detectar la presencia de neutrófilos en las secciones fijas/permeabilized histología y evaluar el estado de activación de los neutrófilos purificados vivo. En particular, el péptido de40 MUB ATA lactoferrina presente en gránulos específicos de neutrófilos y terciarios. Exposición de los contenidos del gránulo a través de permeabilización o neutrófila activación permite el marcado de los neutrófilos.

El péptido de40 de MUB para uso en la detección de eventos de la inflamación mediada por neutrófilos

Este protocolo detalla un método para el aislamiento de neutrófilos de sangre total, capas buffy o membranas de leucoféresis, logrando un buen rendimiento, alta pureza y mínima activación celular. Utilizamos la purificación por gradiente, la sedimentación de glóbulos rojos (RBC) y la lisis de RBC para obtener una preparación de neutrófilos de alta calidad / pureza.

Aislamiento de neutrófilos humanos de sangre entera y buffy coats

Este protocolo presenta un conjunto de ensayos funcionales de neutrófilos que se utilizarán como método de cribado para cubrir las funciones de diferentes vías de señalización. El protocolo incluye una evaluación inicial y sencilla de la viabilidad celular, la pureza, la producción de especies reactivas de oxígeno, la migración en tiempo real, la fagocitosis y una sugerencia preliminar de trampas extracelulares de neutrófilos.

Un conjunto de técnicas de cribado para una visión general rápida de la función de los neutrófilos

Este manuscrito describe un protocolo para la preparación de una biblioteca ATAC-seq de neutrófilos de médula ósea murina, con el objetivo de garantizar una viabilidad óptima de los neutrófilos y una alta calidad de la biblioteca. Ofrece instrucciones paso a paso sobre la preparación de BMC, la clasificación inmunomagnética y la construcción de bibliotecas, lo que sirve como una guía valiosa, especialmente para los recién llegados al estudio de los neutrófilos.

Preparación de neutrófilos derivados de la médula ósea murina

Los neutrófilos de baja densidad (LDN) aumentan significativamente en varias enfermedades. Las LDN generalmente se aíslan mediante clasificación celular. Presentamos un método práctico para obtener LDN pura y viable. Después de la centrifugación en gradiente de densidad de la sangre periférica, las células se incuban con microperlas magnéticas y luego las LDN se separan a través de columnas magnéticas.

Método rápido de microperlas magnéticas para la purificación eficiente de neutrófilos de baja densidad

Aprende a generar y cultivar fagocitos gigantes derivados de neutrófilos humanos in vitro. Este método permite estudiar su función en respuestas inmunes inflamatorias y antiinflamatorias.

El desarrollo y la identificación de una subpoblación de Novela derivada de neutrófilos humanos fagocitos gigante In Vitro

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