El estudio de procesos dinámicos de nano-objetos de tamaño en el líquido de utilizar el escaneado Microscopía Electrónica de Transmisión

El objetivo general de la microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida es observar las estructuras y los fenómenos de los nanomateriales en muestras biológicas totalmente incrustadas en una capa líquida de hasta varios micrómetros de espesor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Ciencia de los Materiales, como el comportamiento de los nanomateriales en líquido y el estudio de muestras biológicas en el entorno líquido natural. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información morfológica a nanoescala sobre los especímenes en líquido.

Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la carga del portamuestras y la adquisición de imágenes no son tan simples como se hacen al principio con la microscopía electrónica. Para comenzar el procedimiento, en una campana de flujo laminar limpia, limpie un portaobjetos de vidrio de microscopía óptica con un pañuelo sin fibras y etanol puro. Coloque el portaobjetos sobre un pañuelo de papel en una sala limpia en una placa de Petri con tapa.

Para manipular los microchips de SiN, utilizando pinzas recubiertas de carbono, agarre el microchip con firmeza pero con cuidado por los lados largos, manteniendo la membrana de SiN hacia arriba en todo momento. Con esta técnica, coloque cinco microchips sin espaciador y cinco microchips con un espaciador de 200 nanómetros en el portaobjetos de vidrio. Cierre la placa de Petri y lleve los microchips a una campana extractora.

Coloque los microchips en un vaso de precipitados de acetona de grado HPLC con la membrana hacia arriba. Agite suavemente el vaso de precipitados durante dos minutos para eliminar la capa protectora, teniendo cuidado de no voltear los microchips. Luego, transfiera rápidamente los microchips a un vaso de precipitados de etanol puro.

Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio. Gire suavemente el vaso de precipitados durante dos minutos para terminar de quitar el recubrimiento y llévelo en una placa de Petri cerrada a la campana de flujo laminar. Coloque los microchips en un pañuelo de papel nuevo de la sala limpia, teniendo cuidado de no voltear los microchips a medida que se liberan de las pinzas.

Deje que los microchips se sequen durante unos minutos. Y luego coloque los microchips en el portaobjetos de vidrio en la placa de Petri. Cierre la placa de Petri y lleve los microchips a un limpiador de plasma.

Coloque el portaobjetos de vidrio y los microchips en el limpiador de plasma y ejecute un programa de limpieza de cinco minutos para eliminar los hidrocarburos de la membrana de SiN. Con un microscopio óptico, inspeccione los microchips en busca de membranas rotas o partículas de suciedad. Deseche los microchips dañados o sucios.

En la campana de flujo laminar, inmovilice los microchips en una caja de transporte limpia con una superficie interior pegajosa. Aplique una gota de un microlitro de una solución acuosa de nanopartículas de oro estabilizada con citrato de tres molares a la membrana de SiN de cada microchip sin espaciador, y deje que la solución se seque. Luego, aplique un microlitro de agua desionizada a la membrana para eliminar la sal y los tensioactivos.

Después de 30 segundos, use papel de filtro para eliminar cuidadosamente el agua y dejar que los microchips se sequen. Coloque la punta del soporte TEM de flujo de líquido debajo de un microscopio óptico binocular. Retire la tapa de titanio de la punta del soporte y colóquela sobre una hoja de papel de aluminio.

Instale una bomba de jeringa microfluídica con una jeringa de vidrio de un mililitro que contenga 0,5 mililitros de agua apta para HPLC. Conecte la jeringa al sistema de flujo y ponga en marcha la bomba. A medida que el agua se descarga a través del sistema, revise las líneas en busca de fugas o constricciones de flujo.

Cuando se complete el bombeo, retire el enjuague del compartimiento de la celda líquida y seque la punta del soporte con papel de filtro. Inspeccione la punta del soporte con el microscopio óptico. Seque la punta con un pañuelo de papel para salas limpias y elimine el polvo o las fibras con pinzas limpias recubiertas de PTFE.

Inspeccione la tapa de la punta del soporte, la junta tórica y los tornillos, y elimine el polvo o las fibras con pinzas recubiertas de PTFE. Coloque la junta tórica en los grupos de soportes. Coloque el primer tornillo y gírelo unas cuantas veces para que se quede.

Con pinzas curvas limpias, coloque el microchip de muestra en el bolsillo de la punta del soporte con la membrana de SiN hacia arriba. Utilice el microscopio óptico binocular para comprobar que el microchip está colocado correctamente. Coloque una gota de 0,3 microlitros de agua pura filtrada sobre el microchip de muestra.

Sujetar el microchip en su lugar con pinzas. Luego, tome un microchip espaciador con pinzas curvas sostenidas al revés. Gire con cuidado las pinzas para que la membrana del microchip quede hacia abajo.

Coloque el microchip espaciador en el microchip de muestra. Coloque el material reflectante de luz debajo de la punta del soporte y verifique la alineación del microchip debajo del microscopio óptico binocular. Use pinzas para ajustar cuidadosamente los microchips si las ventanas de SiN están desalineadas.

A continuación, levante la tapa de la cámara de muestras con unas pinzas. Dé la vuelta a la tapa y, sin tocar los microchips, apoye la parte posterior de la tapa en la punta del soporte. Coloque el tornillo restante con unas pinzas y apriete ambos tornillos de forma iterativa.

Apriete con cuidado hasta que encuentren resistencia. Las ventanas pueden romperse fácilmente si el apriete es demasiado fuerte. Inicie un flujo de líquido de cuatro microlitros por minuto a través del sistema y verifique si hay fugas en la punta del soporte.

A continuación, lleve el soporte a una estación de bombeo de vacío y realice una comprobación de fugas. Asegúrese de que la presión alcance al menos 10 hasta el quinto mbar negativo en cinco minutos. Coloque el soporte en su caja.

Y acerque el soporte al microscopio electrónico. Configura el microscopio en modo STEM. Mida la densidad de corriente del haz de electrones con una fina película de carbono recubierta con nanopartículas de oro como muestra de referencia sin agua.

Inicie el flujo de agua pura a una velocidad no mayor de dos microlitros por minuto. Inserte el soporte TEM de flujo de líquido en la cerradura de carga de vacío y comience la evacuación. Asegúrese de que la presión disminuya normalmente.

Y luego inserte el soporte TEM completamente en el microscopio. Una vez que la presión sea lo suficientemente baja, abra la válvula de haz e inserte el detector ADF. Configure el microscopio en modo de adquisición continua y traslade la etapa de muestra en las direcciones X e Y para encontrar la ventana SiN.

Ajuste el contraste y el brillo para que los bordes de la ventana sean claramente visibles. Transfiera el escenario en las direcciones X e Y para que una esquina de la ventana quede en el centro del campo de visión. A continuación, reinicie la lente del objetivo.

Ajuste la posición vertical de la etapa de muestra para enfocar la esquina de forma aproximada. Incline la platina cinco grados hacia adelante y hacia atrás para comprobar que la muestra está a la altura eucéntrica. Centre la esquina de la ventana en el campo de visión y, a continuación, almacene la posición del escenario en el software.

Transfiera la etapa en las direcciones X e Y hasta que las nanopartículas de oro sean visibles. Y luego enfoca la lente del objetivo. Anote la densidad actual y calcule el espesor de la celda líquida.

Transfiera la etapa en las direcciones X e Y para ubicar un área con al menos 20 nanopartículas de oro. Establezca los parámetros y adquiera una imagen. Las nanopartículas de oro se inmovilizan en una membrana de nitruro de silicio y se visualizan con STEM en fase líquida.

En agua pura, las nanopartículas de oro mantuvieron su forma a lo largo de las imágenes. Los productos de radiólisis del agua podrían oxidar átomos de oro individuales, lo que eventualmente podría alterar la forma de las nanopartículas. En otro experimento, los iones de cloruro se introducen en la fase líquida.

Las nanopartículas de oro se disolvieron lentamente a lo largo del experimento a medida que los átomos de oro oxidados formaban tetracloroaureata soluble. Para investigar los movimientos de las nanopartículas de oro en el agua, en el experimento posterior, las nanopartículas no estaban completamente inmovilizadas en la membrana de la muestra. Las nanopartículas de oro se aglomeraron y, al alcanzar un tamaño de cúmulo crítico, se movieron fuera del campo de visión.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Se requerirán varias semanas de entrenamiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar con calma y verificar la estanqueidad al vacío y el espesor del líquido.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en Ciencia de los Materiales, Química y Biología exploraran el crecimiento y el movimiento de nanopartículas en líquidos, la estructura de los materiales a nanoescala en entornos líquidos y la funcionalidad de las proteínas en células de mamíferos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía electrónica de transmisión de barrido de nanopartículas de oro incrustadas en una capa de agua, incluida la carga correcta del portamuestras y el ajuste del microscopio. No olvide que trabajar con líquido en el microscopio electrónico puede causar daños si el portamuestras no está cargado correctamente.

Por lo tanto, es importante verificar si hay fugas de vacío antes de cargar.