Name: El estudio de procesos dinámicos de nano-objetos de tamaño en el líquido de utilizar el escaneado Microscopía Electrónica de Transmisión (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 29 s
Description: Aprende a realizar microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida para observar nanopartículas de oro en agua. Este método permite estudiar procesos dinámicos nanométricos en tiempo real.

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Agradecemos a E. Arzt por su apoyo a través del INM. La investigación fue financiada en parte por el Concurso Leibniz 2014.

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

El protocolo descrito permite STEM de AuNPs en un líquido, incluyendo la observación de procesos dinámicos. El montaje del soporte es una técnica fácil de aprender. Sin embargo, varios aspectos deben ser considerados cuando se trabaja con el titular de TEM flujo de líquido. Por ejemplo, los bordes rotos del microchip Si o partículas grandes en las juntas tóricas pueden dar lugar a fugas de la celda de líquido. Por otra parte, las partículas grandes (&gt; 200 nm, por ejemplo, polvo o suciedad Si) en la membrana SiN puede resultar en un aumento del grosor de la celda de líquido, que conduce a un bajo contraste de formación de imágenes o para una resolución espacial baja y puede incluso causar SiN ventanas se rompan. Es importante destacar que los residuos de sal u otros productos químicos pueden influir en el resultado de los experimentos de un modo no deseado. Por lo tanto, es crucial que las diferentes etapas de preparación de la muestra y el conjunto de soporte se llevan a cabo con cuidado y en un entorno limpio y libre de polvo. El espesor de la ce líquidoll determina la resolución alcanzable, así como el contraste de las imágenes obtenidas 17. Este espesor se puede ajustar a través de espaciadores situados en una de las dos microchips Si. Dependiendo de las dimensiones de la muestra, diferentes espesores de la célula de líquido se pueden realizar. Para el estudio de AuNPs, es posible utilizar espaciadores pequeños (200-500 nm), mientras que las células eucariotas enteros necesitan grandes espaciadores de hasta 5 m. El espesor de la celda de líquido está influenciada además por el abultamiento de las ventanas de membrana SiN resultantes de la diferencia de presión entre la célula de líquido y el vacío circundante. Este efecto es más pronunciado con grandes ventanas de membrana pecado. Por lo tanto, con el fin de minimizar el espesor de la celda de líquido, se recomienda el uso de pequeñas ventanas de membrana SiN. En caso de que es difícil encontrar una superposición entre dos pequeñas ventanas, que se puede montar en una configuración cruzada usando un microchip de base diferente. configuraciones alternativas largEly prevenir el vientre y se componen de un microchip 18 o membrana monolítica ventanas sostenidos por pilares 19, pero esos inconvenientes presentan con respecto a la carga de muestras. Uno de los aspectos más desafiantes de la tecnología actual es la falta de un control preciso sobre el espesor líquido. A menudo, el líquido es mucho más gruesa que lo que se espera de las dimensiones separadores utilizados, como se muestra aquí. Varios grupos utilizan cámaras cerradas líquido 4, 20, 21, 22; estos sistemas tienen algunas ventajas con respecto a la resolución espacial, como el espesor de líquido se puede reducir mediante la inducción de una burbuja en el líquido. Alternativamente, las ventanas SiN pueden ser obligados a colapsar, lo que lleva a una capa de líquido delgada. En tercer lugar, existe el recinto de otras ventanas más delgadas (por ejemplo, el grafeno) 23, también resulta en líquidos mucho más delgadosde lo que es posible con el sistema descrito en este protocolo. Sin embargo, es imposible de flujo de líquido en dichos sistemas. En cuanto a cualquier técnica de microscopía de alta resolución, debe tenerse en cuenta una serie de aspectos experimentales. El aspecto más importante es la interacción del haz de electrones con el líquido o la muestra. Además de los daños por radiación, lo que limita la resolución espacial alcanzable para muchos muestras sólidas 24, las muestras líquidas también están influenciadas por los productos de radiólisis generado haz de electrones 15, 25. Dado que estos productos pueden influir en el experimento, la interpretación de datos cuidadosos y diseño experimental son esenciales 26. Los ajustes del microscopio debe ser elegido de acuerdo a los objetivos de un estudio en particular. STEM ADF es más potente para las nanopartículas de imagen de un alto número atómico (Z) con espesores mayores de la célula líquida, WHILe TEM da un mejor contraste en materiales de bajo Z y suele ser más rápido, pero requiere más delgadas capas líquidas 3. En lugar de utilizar el detector de ADF, la (BF) detector de campo brillante se utiliza a veces para la imagen de la célula de líquido, ya que STEM BF es ventajoso para formar imágenes de materiales de bajo Z en capas gruesas 27. Con el aumento de espesor de la célula de líquido, se necesita más actual. Sin embargo, esto también aumenta las concentraciones de los productos de radiólisis y aumenta el daño por radiación. También hay que señalar que una inversión de contraste se observó en el detector ADF para líquidos muy gruesas (&gt; 10 m para el agua). Las condiciones de líquidos se cambiaron entre nuestros experimentos mediante la eliminación del soporte del microscopio y el intercambio de la muestra y el líquido. Además de cambiar la concentración de sal, es fácilmente posible cambiar otras propiedades del líquido que fluye en por diferentes líquidos (por ejemplo, uno puedeusar soluciones tampón con el fin de establecer un pH específico 16 o puede introducir soluciones orgánicas u otros aditivos). También es posible cambiar el líquido mientras el soporte todavía está insertada en el microscopio por el flujo de líquidos a través del sistema de microfluidos. Sin embargo, en este caso, se desconoce momento en el que punto el líquido a los cambios de la muestra. También es digno de mención que los microchips de apoyo electrodos están disponibles, por lo que los experimentos de la electroquímica a nanoescala pueden llevarse a cabo 28. Los objetos de estudio no se limitan a AuNPs en agua, pero una amplia variedad de muestras se pueden estudiar usando el protocolo descrito anteriormente, incluyendo sílice, óxido de titanio, y polímeros. Si los movimientos de los objetos son demasiado rápidos para capturar en una imagen dentro de la adquisición, la viscosidad se puede reducir en un orden de magnitud mediante el uso de una mezcla de 50% de glicerol y 50% de agua. A partir de los puntos antes mencionados,una serie de ventajas, posibilidades, y también desventajas se hacen evidentes. Cuando se trabaja con STEM-fase líquida, las desventajas más importantes a considerar son que: 1) cualquier experimento está influenciada por la interacción dinámica del haz de electrones con la muestra completa (el objeto bajo observación, el líquido y las membranas SIN); 2) manipulación de la muestra es tedioso, y a menudo es difícil lograr una capa de líquido delgada porque la muestra o los microchips contienen algunas partículas de tamaño micrométrico; 3) el espesor de líquido por lo general difiere en gran medida del espesor previsto establecido por el espaciador; y 4) de resolución espacial y de contraste dependen en gran medida del espesor de líquido y la diferencia entre la densidad de cambio del objeto bajo observación y el líquido. En la actualidad, existen amplios métodos para la microscopía de objetos en un líquido con una resolución espacial nanométrica. La microscopía electrónica de hielo amorfo es una poderosa técnica 29,pero los procedimientos experimentales implicadas son delicadas, no todos los experimentos permiten la preparación de la muestra en hielo, y los experimentos con resolución temporal son imposibles. La microscopía 30 de rayos X, 31 en principio, podría ser utilizado, pero tiene una resolución espacial limitada y no está ampliamente disponible en los laboratorios. Microscopía de fuerza atómica en líquido ha sido establecido, pero es una técnica única superficie de 32, 33, 34, 35. La microscopía óptica no presenta la suficiente resolución espacial. En la actualidad, la microscopía electrónica en el líquido parece ser la técnica más poderosa para la microscopía directa de los objetos a nanoescala y procesos en líquido. TEM-fase líquida y STEM aún no son técnicas de análisis de rutina, pero todavía se están desarrollando. El número de parámetros a tener en cuenta es considerable, y es often difíciles de reproducir los resultados experimentales. Por otra parte, los datos cuantitativos es difícil de obtener debido a los efectos que se investigan se entrelazan con los procesos que ocurren como resultado del haz de electrones. El protocolo descrito aquí tiene como objetivo estandarizar el protocolo experimental, lo que representa de esta manera para todos los aspectos de base pertinentes del experimento. Esperamos que este protocolo conducirá a una mejor reproducibilidad del trabajo experimental en este campo emergente.

Escaneo convencional microscopía electrónica de transmisión (STEM) está limitada por la gama de muestras adecuadas para el análisis, específicamente las muestras secas y sólidas adecuadas para la colocación en un alto vacío. Sin embargo, muchas cuestiones científicas y tecnológicas se refieren a materiales y procesos en medio líquido a nanoescala. Las muestras totalmente embebidos en líquido ahora se pueden estudiar con el vástago utilizando un concepto que implica una cámara de microfluidos montado en el soporte de muestras para microscopía electrónica de transmisión (TEM) y STEM 1. Esta técnica desarrollada recientemente se ha vuelto cada vez más popular, ya que proporciona una nueva visión de los procesos importantes de diversos temas de investigación, incluyendo el crecimiento, la disolución y procesos de agregación de nanopartículas 2, 3, 4, 5, 6. No sólo los metales, sino también BIOMInerals 7 y los sistemas biológicos pueden ser estudiados 8, 9, 10, 11. La carga de la muestra y la adquisición de imágenes de STEM en fase líquida es diferente a la de STEM de muestras secas e implican un protocolo que requiere una formación especializada. El sistema microfluídico se compone de dos microchips de silicio de soporte de nitruro de silicio ventanas (SiN) membrana transparente para el haz de electrones a 200 keV de energía 12 (véase la Figura 1A). Los detalles de las dimensiones y de la manipulación de estos microchips se pueden encontrar en otros lugares 12, 13. La muestra por lo general contiene objetos a nanoescala. En este trabajo se observó nanopartículas de oro (AuNPs). Los AuNPs se inmovilizan en la ventana superior (con respecto a un haz de electrones hacia abajo de viaje) o flotan en el jabón lcarné de identidad. Resolución espacial nanoescala en STEM se obtiene mediante la exploración del haz de electrones sobre los AuNPs y la recolección de electrones dispersados de transmisión utilizando el detector anular campo oscuro (ADF) 9. Los dos microchips se colocan en una pequeña ranura en la punta del soporte de TEM de flujo de líquido 1 (el titular opera tanto para STEM y TEM pero se conoce como el soporte TEM). Uno de los microchips contiene un espaciador de modo que se forma un compartimiento de líquido entre los microchips. Juntas tóricas en ambos lados de las dos microchips proporcionan sellado al vacío del compartimiento de líquido 13 (véase la Figura 1B). El objetivo de este artículo es demostrar los pasos básicos de la carga de la muestra y adquisición de datos para que los usuarios interesados ​​pueden acceder fácilmente a esta nueva técnica emergente. Se utiliza un sistema disponible de una compañía específica, pero el protocolo también es válido para los sistemas de otras compañías. La técnica esmás complejo que TEM y STEM convencional, y un número de aspectos prácticos debe ser considerado cuando se trabaja con un sistema de receptáculo de líquido 13. Lo más importante de todo es asegurarse de que el compartimiento de líquido está montado correctamente, proporcionando así una capa líquida delgada y un sello de vacío. Por lo tanto, es muy importante trabajar de forma limpia y para evitar la formación de polvo durante la preparación y el montaje del soporte de TEM de flujo de líquido. En particular, las juntas tóricas y los dos microchips de silicio necesitan estar libres de toda contaminación. Incluso pequeñas partículas de polvo en uno de los microchips pueden aumentar gravemente el grosor de la celda de ensamblado, que puede impedir la consecución de una resolución espacial útil. Un sello de vacío es importante para que no hay contaminación o daño se dejarán en el microscopio electrónico después del experimento. Este protocolo describe el procedimiento de carga y varios ensayos necesarios. El funcionamiento del microscopio electrónico es sencillo, but requiere algunos pasos adicionales en comparación con la microscopía de muestras sólidas. Con el aumento de espesores líquidos, más electrones son absorbidos y dispersados ​​por el líquido; una medición del espesor de líquido es esencial. Por último, el protocolo explica cómo se toman las imágenes y cómo los procesos dinámicos pueden ser estudiados. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig1.jpg"> Figura 1: Celda de flujo líquido para Escaneo microscopía electrónica de transmisión (STEM). (A) Ilustración esquemática de la celda de líquido montado. Dos microchips de silicio con nitruro de silicio (SiN) las ventanas de membrana se colocan entre dos juntas tóricas. El líquido está encerrada entre la membrana SiN y por lo tanto se separa del vacío en el microscopio electrónico. A enfocadas exploraciones del haz de electrones sobre la muestra. El contraste se obtiene a partir de electrones dispersados. Las nanopartículas de oro (AuNPs) se inmovilizan dentro del líquido en la membrana SiN, pero también puede moverse en lalíquido. (B) sección transversal esquemática vista lateral de la pila de dos microchips con juntas tóricas. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Microscopio óptico binocular</td><td>Leica</td><td>M60 CMO</td><td></td></tr><tr><td>Mircoscopio electrónico de transmisión de barrido con corrector de aberración esférica</td><td>JEOL</td><td>ARM200F</td><td></td></tr><tr><td>Flujo de líquido Portamuestras TEM</td><td>DENS Solutions Ocean</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa microfluídica</td><td>Harvard Scientific</td><td>PicoPlus</td><td></td></tr><tr><td>Limpiador de plasma</td><td>Gatan</td><td>Solarus950<</td><td></td></tr><tr><td>strong>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetone, Rotisolv&nbsp; Plus para HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7328.2</td><td></td></tr><tr><td>Agua, chromasolv Plus para HPLC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34877-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Etanol, Rotisolv grado HPLC</td><td>Carl Roth</td><td>P076.2</td><td></td></tr><tr><td>Citrato coloidal de oro estabilizado, diámetro 30 nm</td><td>British-Biocell</td><td>EM. GC20</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Base microchips de silicio con membranas de nitruro de silicio de 50 nm de espesor y dimensiones de 20 & m x 0,40 mm</td><td>Soluciones DENS</td><td>para el sistema</td><td></td>Ocean</tr><tr><td>Microchips de silicio espaciadores con membranas de nitruro de silicio de 50 nm de espesor, dimensiones de 20 y micro; m x 0,40 mm, y espesor del espaciador de 200 nm</td><td>Soluciones DENS</td><td>para el sistema</td><td></td>oceánico</tr><tr><td>Tubo de peek microfluídico</td><td>Upchurch Scientific</td><td>1570</td><td></td></tr><tr><td>Plástico Puntas</td><td></td><td></td><td></td> reemplazables</tr> (<tr><td>cuerpo de acero inoxidable antimagnético antiácido con puntas ESD PVDF (SV)</td><td>IDEAL-TEK</td><td>2ASVR.SA</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de acero dobladas recubiertas de teflón (EMS SA con "PTFE" Recubrimiento)</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>78322-7Te</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas de acero de pico ancho recubiertas de teflón (Recubrimiento EMS 2A "PTFE")</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica</td><td>78322-2ATe</td><td></td></tr><tr><td>Jeringa Hamilton, 1 mL, hermética al gas (Modelo 1001 TLLX SYR)</td><td>Hamilton</td><td>81323</td><td></td></tr><tr><td>Pañuelo tisú para sala limpia Sontara Micropure AP (224 x 224 mm)</td><td>DuPont</td><td>Sontara MicroPure</td><td></td></tr></tbody></table>

el estudio de procesos dinámicos de nano-objetos de tamaño en el líquido de utilizar el escaneado microscopía electrónica de transmisión

Studying Dynamic Processes of Nano-sized Objects in Liquid using Scanning Transmission Electron Microscopy

Las muestras totalmente integrados en un líquido pueden ser estudiados a una resolución espacial nanoescala con el escaneado microscopía electrónica de transmisión (STEM) usando una cámara de microfluidos montado en el soporte de muestras para microscopía electrónica de transmisión (TEM) y STEM. El sistema de microfluidos se compone de dos microchips de silicio delgadas ventanas de soporte de membrana de nitruro de silicio (SiN). En este artículo se describen los pasos básicos de la carga de la muestra y adquisición de datos. Lo más importante de todo es asegurarse de que el compartimiento de líquido está montado correctamente, proporcionando así una capa líquida delgada y un sello de vacío. Este protocolo también incluye un número de ensayos necesarios para llevar a cabo durante la carga de la muestra con el fin de asegurar un montaje correcto. Una vez que la muestra se carga en el microscopio electrónico, el espesor de líquido necesita ser medida. Un montaje incorrecto puede dar lugar a un líquido demasiado gruesa, mientras que un líquido demasiado delgada puede indicar la ausencia de líquido, por ejemplo, cuando se forma una burbuja. Finalmente, el protocoloexplica cómo se toman las imágenes y cómo los procesos dinámicos pueden ser estudiados. Una muestra que contiene AuNPs se forma la imagen tanto en agua pura y en solución salina.

El titular de TEM flujo de líquido se utilizó para estudiar el comportamiento de AuNPs en líquido. AuNPs se inmovilizaron de forma estable en la membrana de SiN en agua pura y se obtuvieron imágenes con una resolución nanoescala utilizando STEM en fase líquida (Figura 6). se obtuvo un contraste excelente en el oro fuertemente de dispersión. La densidad de corriente en la pantalla de fósforo medido para una muestra de ensayo en seco era de 20 pA / cm², mientras que fue de 8 pA / cm² con el titular de TEM flujo de líquido que se inserta. Utilizando la ecuación 1, T agua = 2,4 ± 0,5 micras, mucho más grande que lo que se esperaba en función del espesor del espaciador 200 nm. Sin embargo, el espesor no es demasiado grande para la formación de imágenes de los AuNPs con resolución espacial nanométrica. El espesor líquido era más gruesa que la de 200 nm establecido por el separador debido a la abultada de las membranas pecado, no planitud de los microchips, y los residuos que residen en los microchips. 16, aunque los productos de radiólisis reactivos (e - AQ, H •, H +, OH •) procedentes de la interacción del haz de electrones con agua puede oxidar átomos de oro individuales, que conduce a un cambio de forma de la AuNPs 15. Sin embargo, cuando se utilizó el sistema de flujo de líquido para introducir iones cloruro en un segundo experimento, la estabilidad de los AuNPs cambió. Los iones cloruro son capaces de estabilizar átomos de oro oxidado en forma de tetrachloroaureat, AuCl 4 -. La Figura 7 muestra que los AuNPs disueltos lentamente durante una serie de lapso de tiempo de formación de imágenes de STEM, similar a los resultados reportados anteriormente 16. Para la tasa de dosis de electrones usados, se llevó a ~ 300 s para disolver los 30 AuNPs nm de tamaño. Los movimientos de AuNPs en finales r se estudiaron en un tercer experimento (Figura 8). Antes del experimento, el titular de TEM flujo de líquido se limpió con el fin de eliminar los restos de sal. A diferencia del primer experimento, se utilizó un enfoque de preparación de la muestra alternativa para lograr una unión más débil de las AuNPs a la membrana SiN 14. En este experimento, la solución AuNP se colocó en el microchip de silicio y montado en el soporte de TEM de flujo de líquido sin dejar que la solución se seque. De esta manera, los AuNPs fácilmente separados de la membrana SiN sobre formación de imágenes en la tasa de dosis utilizado. Algunos de los AuNPs movido fuera del campo de vista en las soluciones a granel, mientras que los restantes AuNPs permanecieron dentro del campo de visión en las proximidades de la ventana de SiN. No se observaron movimientos de estos AuNPs, y finalmente se aglomeran. Después de un tiempo, estos aglomerados también se separan de la membrana de SiN y movidos fuera del campo de visión y en la solución. ntent "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig6.jpg"> Figura 6: Escaneo microscopía electrónica de transmisión (STEM) Micrografía de AuNPs 30 nm de diámetro en la parte superior de una capa de agua pura. La imagen que se muestra es un área seleccionada de la imagen original. El tamaño de la imagen era 1.024 x 1.024 píxeles, el tiempo de permanencia fue de 19 píxeles mu s, el tamaño de píxel era 0,73 nm, y el aumento fue 400,000X. La dosis de electrones era por lo tanto 7,1 x 10 4 e - / nm². La densidad de corriente medida en la pantalla de fósforo fue de 8 pA / cm 2, por lo que el espesor de líquido se calculó a ascender a 2,4 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig6large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig7.jpg"> Figura 7: Serie de lapso de tiempoMicrografías de tallo de AuNPs en solución salina. (AD) Imágenes extraídas de la serie de lapso de tiempo de las imágenes de STEM en intervalos de 30 segundos. Los AuNPs disuelven gradualmente en el líquido como consecuencia de la presencia de iones cloruro. El tiempo de permanencia del pixel fue de 2 mu s, el tiempo de trama de la serie lapso de tiempo fue de 1,75 s, el tamaño del pixel fue de 0,44 nm, y la ampliación fue 500,000X. La dosis de electrones por imagen fue de 1,2 x 10 4 e - / nm². El espesor de líquido era 2,4 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig7large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 8" src="/files/ftp_upload/54943/54943fig8.jpg"> Figura 8: STEM Micrografía de AuNPs moviéndose en el agua pura. (A) de la membrana de SiN con AuNPs, varios de los cuales se seleccionan con flechas. (B) pistas de movimientoAuNPs de los seleccionados (véase A). Algunos AuNPs se alejan del campo de visión durante el tiempo de formación de imágenes. Las AuNPs restantes se desplazan lateralmente a lo largo de la membrana de SiN y comenzar a aglomerar. Tras alcanzar un tamaño crítico clúster, despachan desde la membrana y se alejan del campo de la view.The tiempo de permanencia fue de píxeles a 1 microsegundo, el marco de tiempo fue 0,52 s, el tamaño del pixel fue de 1,8 nm, y la ampliación fue 120,000X. La dosis de electrones por imagen era de 3,5 x 10 2 E - / nm² y el espesor de líquido fue de 2,4 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54943/54943fig8large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Este protocolo describe el funcionamiento de un soporte de la muestra de flujo de líquido para la digitalización de microscopía electrónica de transmisión de AuNPs en agua, tal como se utiliza para la observación de procesos dinámicos a nanoescala.

El estudio de procesos dinámicos de nano-objetos de tamaño en el líquido de utilizar el escaneado Microscopía Electrónica de Transmisión

Samples fully embedded in liquid can be studied at a nanoscale spatial resolution with Scanning Transmission Electron Microscopy (STEM) using a ...

El objetivo general de la microscopía electrónica de transmisión de barrido en fase líquida es observar las estructuras y los fenómenos de los nanomateriales en muestras biológicas totalmente incrustadas en una capa líquida de hasta varios micrómetros de espesor. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la Ciencia de los Materiales, como el comportamiento de los nanomateriales en líquido y el estudio de muestras biológicas en el entorno líquido natural. La principal ventaja de esta técnica es que proporciona información morfológica a nanoescala sobre los especímenes en líquido.Por lo general, las personas nuevas en este método tendrán dificultades porque la carga del portamuestras y la adquisición de imágenes no son tan simples como se hacen al principio con la microscopía electrónica. Para comenzar el procedimiento, en una campana de flujo laminar limpia, limpie un portaobjetos de vidrio de microscopía óptica con un pañuelo sin fibras y etanol puro. Coloque el portaobjetos sobre un pañuelo de papel en una sala limpia en una placa de Petri con tapa.Para manipular los microchips de SiN, utilizando pinzas recubiertas de carbono, agarre el microchip con firmeza pero con cuidado por los lados largos, manteniendo la membrana de SiN hacia arriba en todo momento. Con esta técnica, coloque cinco microchips sin espaciador y cinco microchips con un espaciador de 200 nanómetros en el portaobjetos de vidrio. Cierre la placa de Petri y lleve los microchips a una campana extractora.Coloque los microchips en un vaso de precipitados de acetona de grado HPLC con la membrana hacia arriba. Agite suavemente el vaso de precipitados durante dos minutos para eliminar la capa protectora, teniendo cuidado de no voltear los microchips. Luego, transfiera rápidamente los microchips a un vaso de precipitados de etanol puro.Cubra el vaso de precipitados con papel de aluminio. Gire suavemente el vaso de precipitados durante dos minutos para terminar de quitar el recubrimiento y llévelo en una placa de Petri cerrada a la campana de flujo laminar. Coloque los microchips en un pañuelo de papel nuevo de la sala limpia, teniendo cuidado de no voltear los microchips a medida que se liberan de las pinzas.Deje que los microchips se sequen durante unos minutos. Y luego coloque los microchips en el portaobjetos de vidrio en la placa de Petri. Cierre la placa de Petri y lleve los microchips a un limpiador de plasma.Coloque el portaobjetos de vidrio y los microchips en el limpiador de plasma y ejecute un programa de limpieza de cinco minutos para eliminar los hidrocarburos de la membrana de SiN. Con un microscopio óptico, inspeccione los microchips en busca de membranas rotas o partículas de suciedad. Deseche los microchips dañados o sucios.En la campana de flujo laminar, inmovilice los microchips en una caja de transporte limpia con una superficie interior pegajosa. Aplique una gota de un microlitro de una solución acuosa de nanopartículas de oro estabilizada con citrato de tres molares a la membrana de SiN de cada microchip sin espaciador, y deje que la solución se seque. Luego, aplique un microlitro de agua desionizada a la membrana para eliminar la sal y los tensioactivos.Después de 30 segundos, use papel de filtro para eliminar cuidadosamente el agua y dejar que los microchips se sequen. Coloque la punta del soporte TEM de flujo de líquido debajo de un microscopio óptico binocular. Retire la tapa de titanio de la punta del soporte y colóquela sobre una hoja de papel de aluminio.Instale una bomba de jeringa microfluídica con una jeringa de vidrio de un mililitro que contenga 0,5 mililitros de agua apta para HPLC. Conecte la jeringa al sistema de flujo y ponga en marcha la bomba. A medida que el agua se descarga a través del sistema, revise las líneas en busca de fugas o constricciones de flujo.Cuando se complete el bombeo, retire el enjuague del compartimiento de la celda líquida y seque la punta del soporte con papel de filtro. Inspeccione la punta del soporte con el microscopio óptico. Seque la punta con un pañuelo de papel para salas limpias y elimine el polvo o las fibras con pinzas limpias recubiertas de PTFE.Inspeccione la tapa de la punta del soporte, la junta tórica y los tornillos, y elimine el polvo o las fibras con pinzas recubiertas de PTFE. Coloque la junta tórica en los grupos de soportes. Coloque el primer tornillo y gírelo unas cuantas veces para que se quede.Con pinzas curvas limpias, coloque el microchip de muestra en el bolsillo de la punta del soporte con la membrana de SiN hacia arriba. Utilice el microscopio óptico binocular para comprobar que el microchip está colocado correctamente. Coloque una gota de 0,3 microlitros de agua pura filtrada sobre el microchip de muestra.Sujetar el microchip en su lugar con pinzas. Luego, tome un microchip espaciador con pinzas curvas sostenidas al revés. Gire con cuidado las pinzas para que la membrana del microchip quede hacia abajo.Coloque el microchip espaciador en el microchip de muestra. Coloque el material reflectante de luz debajo de la punta del soporte y verifique la alineación del microchip debajo del microscopio óptico binocular. Use pinzas para ajustar cuidadosamente los microchips si las ventanas de SiN están desalineadas.A continuación, levante la tapa de la cámara de muestras con unas pinzas. Dé la vuelta a la tapa y, sin tocar los microchips, apoye la parte posterior de la tapa en la punta del soporte. Coloque el tornillo restante con unas pinzas y apriete ambos tornillos de forma iterativa.Apriete con cuidado hasta que encuentren resistencia. Las ventanas pueden romperse fácilmente si el apriete es demasiado fuerte. Inicie un flujo de líquido de cuatro microlitros por minuto a través del sistema y verifique si hay fugas en la punta del soporte.A continuación, lleve el soporte a una estación de bombeo de vacío y realice una comprobación de fugas. Asegúrese de que la presión alcance al menos 10 hasta el quinto mbar negativo en cinco minutos. Coloque el soporte en su caja.Y acerque el soporte al microscopio electrónico. Configura el microscopio en modo STEM. Mida la densidad de corriente del haz de electrones con una fina película de carbono recubierta con nanopartículas de oro como muestra de referencia sin agua.Inicie el flujo de agua pura a una velocidad no mayor de dos microlitros por minuto. Inserte el soporte TEM de flujo de líquido en la cerradura de carga de vacío y comience la evacuación. Asegúrese de que la presión disminuya normalmente.Y luego inserte el soporte TEM completamente en el microscopio. Una vez que la presión sea lo suficientemente baja, abra la válvula de haz e inserte el detector ADF. Configure el microscopio en modo de adquisición continua y traslade la etapa de muestra en las direcciones X e Y para encontrar la ventana SiN.Ajuste el contraste y el brillo para que los bordes de la ventana sean claramente visibles. Transfiera el escenario en las direcciones X e Y para que una esquina de la ventana quede en el centro del campo de visión. A continuación, reinicie la lente del objetivo.Ajuste la posición vertical de la etapa de muestra para enfocar la esquina de forma aproximada. Incline la platina cinco grados hacia adelante y hacia atrás para comprobar que la muestra está a la altura eucéntrica. Centre la esquina de la ventana en el campo de visión y, a continuación, almacene la posición del escenario en el software.Transfiera la etapa en las direcciones X e Y hasta que las nanopartículas de oro sean visibles. Y luego enfoca la lente del objetivo. Anote la densidad actual y calcule el espesor de la celda líquida.Transfiera la etapa en las direcciones X e Y para ubicar un área con al menos 20 nanopartículas de oro. Establezca los parámetros y adquiera una imagen. Las nanopartículas de oro se inmovilizan en una membrana de nitruro de silicio y se visualizan con STEM en fase líquida.En agua pura, las nanopartículas de oro mantuvieron su forma a lo largo de las imágenes. Los productos de radiólisis del agua podrían oxidar átomos de oro individuales, lo que eventualmente podría alterar la forma de las nanopartículas. En otro experimento, los iones de cloruro se introducen en la fase líquida.Las nanopartículas de oro se disolvieron lentamente a lo largo del experimento a medida que los átomos de oro oxidados formaban tetracloroaureata soluble. Para investigar los movimientos de las nanopartículas de oro en el agua, en el experimento posterior, las nanopartículas no estaban completamente inmovilizadas en la membrana de la muestra. Las nanopartículas de oro se aglomeraron y, al alcanzar un tamaño de cúmulo crítico, se movieron fuera del campo de visión.Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en dos horas si se realiza correctamente. Se requerirán varias semanas de entrenamiento. Al intentar este procedimiento, es importante recordar trabajar con calma y verificar la estanqueidad al vacío y el espesor del líquido.Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en Ciencia de los Materiales, Química y Biología exploraran el crecimiento y el movimiento de nanopartículas en líquidos, la estructura de los materiales a nanoescala en entornos líquidos y la funcionalidad de las proteínas en células de mamíferos. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo realizar la microscopía electrónica de transmisión de barrido de nanopartículas de oro incrustadas en una capa de agua, incluida la carga correcta del portamuestras y el ajuste del microscopio. No olvide que trabajar con líquido en el microscopio electrónico puede causar daños si el portamuestras no está cargado correctamente.Por lo tanto, es importante verificar si hay fugas de vacío antes de cargar.

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