Microscopía de luz Hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel

El objetivo general de este procedimiento es adquirir observaciones a largo plazo de un sistema radicular de una planta utilizando microscopía de lámina de luz. Para lograr esto, es esencial contar con un método suave de preparación de muestras, condiciones de crecimiento controladas y una técnica de imagen que no altere el desarrollo de la planta, como la microscopía de lámina de luz. Para empezar, las plantas se cultivan en la superficie de una fina capa de gel de dos milímetros.

A continuación, se corta el gel con una plántula de Aribidopsis, se recoge y se transfiere al portamuestras del microscopio. Dentro del microscopio, la planta crece en su posición vertical natural. Las raíces crecen en un medio líquido, mientras que las hojas permanecen en el aire.

Un sistema de iluminación ilumina solo las hojas. La superficie del agua está cubierta para mantener las raíces en la oscuridad. Una de las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como incrustar la raíz en el interior del gel, es que estamos acostumbrados a cultivar plantas en la superficie de un gel.

Por lo tanto, podemos ceñirnos al mismo protocolo de cultivo que antes. Y en segundo lugar, la raíz está en contacto directo con el medio líquido, que puede intercambiarse por tratamientos farmacológicos, por ejemplo. Vierta 30 mililitros de medio MS de media concentración recién esterilizado en autoclave que contenga un 1,5 por ciento de fitogel en una placa de Petri cuadrada para crear una capa de aproximadamente 2 milímetros.

Siembre las semillas estériles una al lado de la otra con un espacio de al menos un centímetro entre ellas. Luego, envuelva el plato con una cinta adhesiva de microporos. Cultive la placa en su incubadora de crecimiento verticalmente durante un máximo de 10 días.

En este experimento, utilizamos plantas de seis días de edad para observar el desarrollo de las raíces laterales. Proporcionamos un modelo para imprimir en 3D el portamuestras. Hemos probado diferentes materiales.

Las resinas transparentes eran las más adecuadas en términos de rigidez y resistencia al agua. En el manuscrito se describe una descripción detallada de las dimensiones para mecanizar un portamuestras a partir de material sólido. Corta el gel alrededor de la planta con un bisturí.

A continuación, recoge el bloque de gel en el que crece la planta y llévalo con cuidado al portamuestras. Derrita el 1 por ciento de aggros a 80 grados centígrados y enfríe a 33 grados centígrados. Pegue el bloque de gel en el portamuestras y pegue la planta en el gel con cuidado.

Use un microscopio estereoscópico para verificar la posición de la planta y asegúrese de que la región de interés no esté cubierta por ningún gel. Para evitar que la planta se seque, deslice el portamuestras sobre una punta de pipeta de 1.000 microlitros siempre que sea posible. Coloque el soporte en una caja de pipetas y prepare más muestras si es necesario.

Nuestro microscopio es un clásico de giro abierto sin mayores modificaciones. Implementamos un sistema de iluminación para el cultivo de plantas dentro del microscopio. Los LED rojos y azules están dispuestos en un anillo.

Los pares de LED se pueden encender y apagar individualmente para la iluminación direccional. El espectro del sistema de iluminación coincide con el de nuestras cámaras de crecimiento. Casi toda la iluminación proveniente de los LED está bloqueada por un filtro de emisión para GFP.

No pudimos detectar ninguna luz parásita que llegara a la cámara. Por lo tanto, la luz se puede mantener encendida mientras se toman imágenes. La intensidad de la luz se puede ajustar, oscilando entre 30 y 250 micro moles por metro cuadrado por segundo.

Atornille o pegue el anillo LED en la parte inferior del brazo de la etapa de giro abierto. Móntelo de nuevo en el microscopio y conecte los cables. Ensamble el sistema de profusión.

Conecte los tubos a la cámara de muestras en una disposición unidireccional. Ajusta la velocidad a un mililitro por minuto. Añade cuadrados de tres milímetros de una lámina de plástico negro estéril y distribúyelos por la superficie del agua.

Inserte la muestra en el microscopio. Verifique que no haya láminas de plástico pegadas al portamuestras. Cierre la cámara con dos tapas hechas de papel de aluminio negro.

Encienda la luz y ajuste la intensidad de la luz. Apague la luz de la habitación y comience a grabar. Este método permite registrar el crecimiento de la raíz durante varias horas hasta días, presentado aquí por el crecimiento de una raíz lateral.

Las imágenes de una pila z de un solo punto de tiempo muestran buenas propiedades de sección óptica. Capturamos todo el proceso de formación de raíces laterales en 3D, lo que nos permite estudiar la dinámica de este proceso. Al mirar una sola porción de esta grabación, se muestra una buena resolución, incluso en el interior de la raíz.

Después de ver este video, debe tener una comprensión clara del método de preparación de muestras de plantas para la microscopía de lámina ligera. Siguiendo este protocolo, ahora podemos observar la localización de proteínas intracelulares o los patrones de expresión génica durante la organogénesis, los tropismos de las plantas o la adaptación de las plantas. Esto nos ayudará a entender la regulación espacio-temporal del desarrollo de las plantas.