Name: Microscopía de luz Hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 41 s
Description: Aprende a preparar muestras de Arabidopsis para microscopía de hoja de luz y observar el desarrollo de raíces laterales en 3D sin alterar el crecimiento natural de la planta.

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Agradecemos a Matyáš Fendrych para la lectura / visualización crítica y Stephan Stadlbauer para el equipo de audio. Gracias a la Miba Machine Shop en IST Austria por su contribución a la OpenSPIM. La investigación que lleva a estos resultados ha recibido financiación de las personas del programa (acciones Marie Curie) del Séptimo Programa Marco de la Unión Europea (FP7 / 2007-2013) en virtud de acuerdo de subvención REA n ° [291734] y el Consejo Europeo de Investigación (ERC-2011 proyecto -StG-20101109-PDSP).

1. El cultivo Arabidopsis antes de la imagen <ol><li> Preparar medio ½ MS (medio-fuerza Murashige y Skoog) mediante la adición de 2,15 g MS-medio, 10 g de sacarosa, 0,97 g MES (2- (N morfolino) etanosulfónico) y 1 L de ddH 2 O (agua bidestilada ) en una botella de 1 L. Ajustar el pH a 5,8 usando KOH. </li><li> Añadir 15 g / L de goma gellan al medio ½ MS y se esterilice en autoclave durante 20 minutos a 121 ° C. </li><li> Verter 30 ml del medio caliente en placas de Petri cuadrados (245 x 245 x 25 mm) para crear una capa de gel con un espesor de aproximadamente 2 mm. Deje que los platos se enfrían a temperatura ambiente para permitir que el medio se solidifique. </li><li> Ponga las semillas de Arabidopsis esterilizados en un tubo de reacción de 1,5 ml que contenía 1 ml de H2O estéril Recoger las semillas utilizando una pipeta de vidrio o una punta de pipeta de 1.000 ly sembrarlas sobre la superficie del gel. Coloque las semillas por separado aproximadamente 10 mm de separación. Sellar la placa con cinta adhesiva. </li><li> Se incuba la placa durante 24 horas a 4° C (estratificación). </li><li> Cultivar la placa en una incubadora de crecimiento, por ejemplo, a 22 ° C en un ciclo de 16/8 h día / noche con 120-140 m² / s cantidad mmol / de la luz durante 6 días. Hasta 10 días las plantas viejas se pueden utilizar. </li></ol> 2. Método de preparación de la muestra de la planta Nota: El soporte de la muestra puede ser ya sea impreso o 3D hecho a mano en un taller de la máquina utilizando las dimensiones mostradas en la figura 2C. El archivo de modelo 3D se ofrece en el material complementario (Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl). Vea el enlace para ordenar la impresión 3D en la lista de materiales. <ol><li> Añadir 5 g de agarosa bajo punto de fusión en una botella de 50 ml que contiene 50 ml de medio ½ MS y se autoclave durante 20 min a 121 ° C. </li><li> Alícuota de la solución de agarosa de bajo punto de fusión al 1% en tubos de 1,5 mL de reacción. Almacenar a 4 ° C (se puede utilizar durante al menos dos meses). </li><li> Fundir una parte alícuota de 1 %% de agarosa de bajo punto de fusión a 80 ° C y dejar que se enfríe hasta alcanzar33 ° C. </li><li> Limpiar el soporte de muestra en una unidad de ultrasonido. Esterilizar el soporte de muestra con 70% de etanol y se lava con agua estéril. </li><li> Cortar el gel alrededor de la planta utilizando un bisturí. </li><li> Levantar el bloque con una espátula plana y deslice con cuidado sobre el soporte de la muestra utilizando un segundo espátula. </li><li> Pegar el gel sobre el soporte de muestra con 1% de agarosa (a 33 ° C) usando una pipeta de 100 l. </li><li> Pegar la planta en el gel con agarosa al 1% usando una pipeta de 10 mL. Utilice un microscopio estéreo para verificar que las hojas no están cubiertas con gel. No coloque el gel directamente sobre la región de interés. </li><li> Para evitar que la planta se seque, trabajar de forma ininterrumpida. Inserte el soporte de la muestra en una punta de pipeta de 1.000 l siempre que sea posible. Utilice la punta de la pipeta como una tapa y deslice con cuidado sobre un extremo del soporte de la muestra donde se encuentra la planta. </li><li> Ponga el soporte de la muestra en un cuadro de punta de la pipeta y preparar las plantas más si es necesario. Las plantas pueden ser directly fotografiado o poner de nuevo en la incubadora crecimiento. </li></ol> 3. Puesta en funcionamiento del microscopio NOTA: El sistema de iluminación LED es una lámpara hecha a la medida. Los detalles técnicos necesarios para construir el anillo de LED se pueden encontrar en la Figura 3 y la lista de material. Vea el archivo de material complementario (Supplemental_File _-_ LED_Ring_Board.brd) para el diseño de la placa. <ol><li> Tornillo o pegamento (por ejemplo, cinta de doble cara) el anillo de LED en la parte inferior del brazo OpenSPIM x / y / z / θ-etapa. </li><li> Conecte el anillo de LED con una fuente de alimentación ajustable (0-30 V, max 2 A). </li><li> Ajustar la tensión a la intensidad de luz deseada (por Arabidopsis, 120-140 mol / m 2 / s, la figura 3D). </li><li> Esterilizar la cámara de muestra con 70% de etanol y lavar con agua estéril. </li><li> Limpiar la lente del objetivo con el tejido bencina y la limpieza de lentes. Esterilizar la lente del objetivo con 70% de etanol. </li><li> Conectar los perfusien los tubos a la cámara de muestra en una disposición de una sola vía. Ponga una botella de 1 l que contenía medio fresco ½ MS y otra botella vacía al lado de la bomba de perfusión peristáltica. Conectar la botella con medio con la entrada inferior de la cámara de muestra utilizando un tubo de perfusión. Conecte la salida superior de la cámara de muestra con la botella vacía a la basura el medio utilizado usando otro tubo de perfusión. </li><li> Ajuste la velocidad de flujo de 1 ml / min. NOTA: Para no Overspill la cámara de muestra, es importante tener un flujo de salida más alto que el flujo de entrada. O bien aumentar la velocidad de bombeo o utilizar un tubo con un diámetro interior más grande para el flujo de salida. </li><li> Cortar una lámina de plástico negro en 3 mm cuadrados pequeños, lavar con etanol al 70% y dejar que se sequen antes de colocarlos en la cámara de muestra sobre la superficie del agua. </li><li> Retire la punta de la pipeta del soporte de la muestra e inserte el soporte de la muestra en la cámara de muestra. Si el soporte de muestra de nueva fabricación no encaja en el brazo etapa, utilizar una arena finapapel para que sea más delgado o utilizar una junta tórica (∅ 6 mm) en el caso de que sea demasiado delgada. </li><li> Para crear las tapas, corte el papel de aluminio negro en dos piezas de 50 x 25 mm. Hacer a 5 mm, cortado en el medio de un lado de cada pieza. Doblar para crear una muesca triangular (Figura 1D). Cerrar la cámara de muestra con las dos tapas poniendo las tapas en la parte superior de la cámara de muestra con las muescas triángulo hacia el soporte de muestra. Asegúrese de que las hojas de las plantas no están en la sombra de los párpados y recibir la luz del sistema de iluminación. </li><li> Encontrar la región de interés utilizando la etapa X / Y / Z y rotación para posicionar una raíz lateral emergente en el campo de visión. </li><li> Antes de grabar, deje que el sistema se equilibre durante al menos 15 minutos. </li><li> Configuración de la adquisición de la imagen. <ol><li> Establecer una pila de 217 imágenes con 3 micras z-separación (650 micras) y ajustar el lapso de tiempo con un intervalo de 15 minutos de imágenes durante un periodo total de 17 h. NOTA: Una documentación detalladacómo operar el software OpenSPIM se puede encontrar en (http://openspim.org/Acquisition#Acquiring_a_Stack). </li></ol></li><li> Empezar a grabar. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Hoja de luz microscopía de fluorescencia tiene la gran ventaja de combinar baja fototoxicidad y la velocidad de adquisición ultrarrápida, que se puede utilizar para capturar un gran volumen con una alta resolución espacio-temporal mientras se mantiene la muestra en un estado fisiológico. La resolución de un microscopio de lámina de luz se puede comparar con la de un microscopio confocal 9. Sin embargo, la dispersión de luz y la absorción se produce a lo largo de la trayectoria de excitación y de emisión de forma individual y la calidad general de la imagen pueden ser significativamente más baja dentro de los tejidos opacas en comparación con la superficie. Para evitar esta complicación se puede utilizar la posibilidad de girar la muestra a lo largo del eje vertical y observar el mismo volumen desde diferentes direcciones. Pero esto no siempre es ventajoso, por ejemplo, raíces laterales emergen en un lado de la raíz y de formación de imágenes desde atrás da como resultado una baja calidad de imagen sin aumentar de más información. Sin embargo, la rotación se puede utilizar principalmente para posicionar el sample de la mejor manera. La disposición horizontal clásico de las lentes del objetivo permite nuevas formas de montaje de la muestra. Las plantas se benefician de una posición vertical. Se presenta aquí, la &quot;en la superficie del gel&quot; método de montaje tiene varias ventajas en comparación con otros métodos de montaje tales como la incorporación de la raíz en el interior de un gel 24,25. 1) El sistema de la raíz está en contacto directo con el medio líquido. La cámara de muestra está conectado a un sistema de perfusión que proporciona continuamente medio fresco. También se puede utilizar para intercambiar rápidamente todo el volumen de la cámara de muestra para aplicar diferentes medios de comunicación o drogas. 2) Antes de muestrear las plantas de preparación crecen a medida que se utilizan para crecer en los laboratorios. Las plantas pueden ser seleccionados bajo un microscopio de fluorescencia y sólo las plantas deseadas deben estar preparados. 3) La planta se transfiere de la placa de Petri para el soporte de la muestra sin ser tocado. De esta manera la planta puede desarrollar aún más en el mismo gel que estaba creciendo en el crecimiento incubator y el estrés mecánico se reduce a un mínimo. 4) La vista en la muestra no está obstruido y aberraciones ópticas se reducen al mínimo debido a que el espacio entre la muestra y el objetivo de detección está exclusivamente lleno de medio y no hay otros materiales con diferentes índices de refracción. Con el fin de realizar las imágenes a largo plazo, el sistema de planta de iluminación es necesario para asegurar la actividad fotosintética de la planta. En la mayoría de los laboratorios de las plantas crecen en un gel transparente, es decir, las raíces están expuestas a la luz. Esto puede causar diferentes respuestas a su medio ambiente e induce cambios en su bioquímica y desarrollo 26,27. Con el fin de reducir la cantidad de luz en el sistema de la raíz, hoja de plástico negro se utiliza para cubrir la superficie del agua, así como una tapa hecha de papel de aluminio negro cubierto la cámara de muestra. La luz puede llegar a la hojas de la planta a través del agujero central en la tapa. En esta configuración, sin aumento de la luz de fondo se observó, suggesting que la cantidad de luz parásita de los LED rojos y azules se redujo significativamente por el filtro de GFP y los enfoques de sombreado. Esto permitió mantener la luz encendida durante la adquisición de la imagen sin incrementar el ruido de fondo de la cámara. El soporte de muestras está diseñado para la impresión 3D. Sin embargo, la elección del material es crucial como varios plásticos que se probaron no eran 100% estable, lo que resulta en una deriva de la muestra. Por lo tanto, se recomienda el uso de resinas en lugar o construir el soporte de muestra por el fresado de una varilla (PEP) polietileno. Cuando se utiliza una configuración de microscopio de lámina de luz con el sistema de iluminación de doble cara el soporte de muestra puede interferir con una de las hojas de luz dependiendo del ángulo de rotación. Para reducir el estrés mecánico durante recogiendo la planta de la placa, utilizar un ángulo plano de la espátula. La planta puede secar rápidamente y el flujo de experiencia al aire por primera vez. Trate de evitar cualquier corriente de aire (movimientos rápidos, el flujo de aire acondicionado), work ininterrumpidamente y deslice el soporte de la muestra en una punta de pipeta de 1.000 l siempre que sea posible. En el interior del microscopio, es crucial para no mojar la planta entera en un líquido y mantener las hojas secas. La técnica es ideal para la formación de imágenes las etapas tempranas de formación de la raíz lateral. Al realizar la proyección de imagen a largo plazo de las puntas de las raíces maduras hay que tener en cuenta que las raíces de Arabidopsis crecen con 100-300 micras / h rápidamente fuera del campo de visión. Una aplicación muy útil futuro podría ser un algoritmo de seguimiento automatizado, lo que permitiría el crecimiento de la raíz punta siguiente durante períodos prolongados de tiempo. La capacidad de controlar las condiciones ambientales como la luz y la composición nutricional del medio durante el proceso de adquisición permite la investigación de cómo las plantas se adaptan a los cambios. La raíz está en contacto directo con el medio líquido, que se puede utilizar para aplicar fármacos para activar químicamente la expresión génica, por ejemplo utilizando la dexametasona inducible 28 o de la β-estradiol sistema inducible 29. Sin embargo, se necesita tiempo para el intercambio de todo el volumen de la cámara de muestra para lavar un medicamento. La configuración se puede mejorar reduciendo al mínimo el volumen de la cámara de muestras para acelerar el intercambio de medio. Sin embargo, esta técnica tiene un gran potencial. La combinación de procedimiento de montaje, las condiciones de cultivo estandarizadas y la adquisición de la imagen suave usando microscopía de luz de hoja permite estudios a largo plazo de desarrollo de la planta con una alta resolución a un nivel fisiológico. Esto ayudará a los investigadores a explorar los mecanismos fundamentales del desarrollo de la planta.

Una de las cuestiones clave en el desarrollo de la comprensión de la planta es cómo se comportan las células individuales durante la diferenciación de órganos y el crecimiento. Idealmente, los procesos celulares, como los patrones de expresión de genes y localización de la proteína intracelular, pueden ser vistos a la luz de un contexto más amplio del tejido. Este objetivo plantea desafíos técnicos y requiere una observación órgano completo con una alta resolución espacial, así como la resolución temporal durante períodos prolongados de tiempo, lo que puede causar efectos foto-toxicidad. Dado que las plantas se adaptan rápidamente a los cambios ambientales, las condiciones de cultivo deben ser estrictamente controlados. Con el fin de hacer imágenes a largo plazo sin interferir con el estado fisiológico de la planta, tres cosas tienen que ser asegurado de condiciones, 1) que crecen en la cámara de muestra, 2) muestra montaje estable durante largos períodos de tiempo, y 3) la formación de imágenes con bajas intensidades de luz para evitar la foto-daño y condiciones no fisiológicas. Fisiológica conditi crecimientocomplementos en la cámara del microscopio de muestras son cruciales para experimentos a largo plazo. Hay una serie de protocolos disponibles que describen las cámaras de crecimiento de imágenes para microscopios confocales 1 - 3. Sin embargo, la microscopía confocal introduce luz de alta intensidad para la planta, que puede causar respuestas de estrés y por lo general inhibe el crecimiento 4. Además, la mayoría de los microscopios convencionales sólo permiten el posicionamiento horizontal de la muestra, que no es óptimo para las plantas, ya que tratan de reorientarse y crecer hacia el vector de la gravedad. Durante los últimos diez años, la microscopía de luz de hoja se ha convertido en una herramienta poderosa para capturar el desarrollo de grandes muestras a celulares de resolución por períodos de tiempo de hasta varios días 5 - 9. Microscopía de luz de hoja permite posicionar la muestra verticalmente y se utiliza cada vez más en la investigación de plantas estudiar el desarrollo radicular de 10 - 21, revisada recientemente por Berthety Maizel 22. Muchos de los estudios mencionados 10,13 - 18,21 se optimizaron y llevado a cabo en el laboratorio de Ernst Stelzer HK empleando una forma especial de montaje de la muestra caracterizan por el crecimiento de la raíz en la superficie de un gel de 17. En estos estudios, se utilizó un microscopio a medida, en el que la planta se lleva a cabo desde la parte inferior. En contraste, la mayoría de los microscopios de luz de hoja ampliamente disponibles mantenga la muestra desde la parte superior. Por lo tanto, este método de preparación en particular no se puede aplicar fácilmente. El método presentado aquí proporciona un protocolo para el método de montaje en superficie bien establecida aplicable para la OpenSPIM 23, una plataforma de acceso abierto para la aplicación y la mejora selectiva plano de iluminación Microscopy (SPIM). El objetivo general de este protocolo es permitir que las imágenes a largo plazo de las raíces de Arabidopsis en el OpenSPIM microscopio de hoja de luz. Esto se logra por el crecimiento de una planta en posición vertical sobre los surface de un gel con las raíces en un medio líquido, mientras que las hojas se mantienen en el aire. Con el fin de asegurar la actividad fotosintética de la planta, un sistema de iluminación a medida ilumina las hojas pero no las raíces (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Agarosa, bajo punto de fusión</td><td>VWR</td><td>AFFY3282125GM</td><td></td></tr><tr><td>Papel de aluminio negro</td><td>Thorlabs</td><td>BKF12</td><td></td></tr><tr><td>Papel de plástico negro</td><td>Carl Roth</td><td>HT83.2</td><td></td></tr><tr><td>LED azul (453 nm)</td><td>OSRAM</td><td>LD&nbsp; CN5M-1R1S-35-1</td><td></td></tr><tr><td>LED rojo (625 nm)</td><td>Placa LED OSRAM</td><td>LR T66F-ABBB-1-1</td><td></td></tr><tr><td>- Software de diseño de PCB</td><td>Cadsoft Eagle</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MES monohidrato</td><td>Duchefa</td><td>M1503.0100</td><td></td></tr><tr><td>Cinta quirúrgica Micropore 3M</td><td></td><td>1530-1</td><td></td></tr><tr><td>Murashige & Skoog Medium (MS-Medium)</td><td>Duchefa</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>Portamuestras Impresión 3D</td><td>i.materialise</td><td><a href="https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1">https://i.materialise.de/shop/item/sampleholder-openspim-zeisslightsheetz1</a>Placas de</td><td></td></tr> <tr><td>Petri cuadradas (245 x 245 x 25 mm)</td><td>VWR</td><td>734-2179</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>84097-1KG</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopía de luz hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel

Light Sheet Fluorescence Microscopy of Plant Roots Growing on the Surface of a Gel

Una de las preguntas clave para comprender el desarrollo de las plantas es cómo se comportan las células individuales en un contexto más amplio del tejido. Por lo tanto, requiere la observación de todo el órgano con una alta resolución espacial y temporal durante períodos prolongados de tiempo, lo que puede causar efectos fototóxicos. Este protocolo muestra un método de preparación de muestras de plantas para microscopía de lámina de luz, que se caracteriza por montar la planta verticalmente sobre la superficie de un gel. La planta está montada de tal manera que las raíces se sumergen en un medio líquido mientras que las hojas permanecen en el aire. Para garantizar la actividad fotosintética de la planta, un sistema de iluminación hecho a medida ilumina las hojas. Para mantener las raíces en la oscuridad, la superficie del agua se cubre con láminas de papel de aluminio negro. Este método permite obtener imágenes a largo plazo del desarrollo de los órganos de la planta en condiciones estandarizadas.

Este método de preparación de la muestra permite el cultivo de la planta en el interior de la cámara de muestra microscopio mientras se observa el sistema radicular con un microscopio de luz de hoja (Figura 1). La planta crece en la superficie de una capa de gel (½ medio MS que contiene 1,5% de goma gellan) montado en un soporte de muestra diseñado a medida (Figura 2). El soporte de la muestra es 3D impreso utilizando una resina transparente como material. Una versión fabricado destacando las dimensiones se representa en la Figura 2C. Las raíces se sumergen en líquido (½ medio MS), que se actualiza continuamente mediante un sistema de perfusión. Las hojas se mantienen en el aire y se iluminan de forma continua con una intensidad de luz de 130 mol / m² / s procedente de los LED azules y rojos que están dispuestos en un anillo por encima de la planta (Figura 1A, B y la Figura 3A-C). El anillo de LED se fabrica en nuestro taller de máquina yproporcionamos detalles técnicos sobre cómo construir el anillo de LED en la Figura 3 y la lista de materiales. La intensidad de la luz se puede ajustar de forma continua que va desde 30-250 mmol / m 2 / s (Figura 3D). El sistema de raíces es la sombra de pequeñas hojas de una lámina de plástico negro que cubre la superficie del agua (Figura 1). Cualquier luz parásita de la iluminación, que se recaba por la lente de detección es filtrada por el filtro de GFP (Figura 3E). Con esta configuración, se registró un lapso de tiempo de un crecimiento de las raíces laterales de Arabidopsis durante 17 h usando un lente de 20X / 0.5 (Figura 4). La raíz lateral tiene su origen en la capa de células periciclo, que se encuentra en el interior de la raíz primaria. Con el fin de demostrar las capacidades de formación de imágenes incluso más profundos en el interior de un tejido durante períodos de tiempo prolongados, se utilizó un aumento mayor (40X / 0.75) para capturar la formación de un ro lateralot de la primera etapa primordio hasta la aparición de la raíz primaria dentro de un período de tiempo de 38 h (Figura 5). Una rebanada 2D ejemplar del conjunto de datos se muestra en la Fig. 5B. Esta grabación nos permite seguir la dinámica de la formación de raíces laterales en 3D (Figura 5A) con una resolución celular. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig1.jpg" /> Figura 1: Las condiciones de crecimiento dentro de la cámara de muestra OpenSPIM. A) Croquis de la cámara de imágenes. La planta está creciendo en posición vertical sobre la superficie de un gel, montado en un soporte de muestra hecha a la medida (véase también la figura 2). Las raíces están creciendo en un medio líquido, que se intercambia continuamente por un sistema de perfusión. La planta de hojas crecen en el aire y son iluminados por LED rojos y azules (véase también la Figura 3). El sistema radicular es la sombra del ingenio<html> h pequeñas hojas de una lámina de plástico negro que cubre la superficie del agua. Una tapa hecha de dos pedazos de papel de aluminio negro reduce aún más la cantidad de luz por debajo de la superficie del agua y mantiene la humedad en la cámara de muestra. El panel ampliada a la derecha destaca la planta que crece en la superficie de un bloque de gel sumergido en el medio líquido. Una gota de agarosa monta la raíz en el gel. La caja de puntos indica la región de interés observada por el microscopio. B) Fotografía de la cámara de imágenes (sin tapa). Números (1) - (10) en A y B representan: (1): x / y / z / θ-etapa con el anillo de LED, (2): soporte de muestra, (3): tapa, (4): Arabidopsis thaliana , (5): hojas de lámina de plástico negro, (6): sistema de perfusión, (7): detección de lente de objetivo, (8): medio líquido, (9): cámara de muestra, (10): iluminación de lente de objetivo. C) La tapa está hecha de dos piezas de papel de aluminio negro.<html> target = &quot;_ blank&quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig2.jpg" /> Figura 2: El soporte de la muestra. A) Modelo 3D. El archivo de modelo 3D se ofrece en el material complementario. B) Fotografía de grabados 3D utilizando diferentes materiales (1) - (3): plástico transparente de acrílico, (4) y (5): resina, (6): resina transparente. C) Dibujo técnico del soporte de la muestra, los números representan milímetro. D) Fotografía del soporte de la muestra fabricada con una planta montada. La zona de puntos pueden ser observados por el microscopio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <html> cargar / 55044 / 55044fig3.jpg &quot;/&gt; Figura 3: Configuración de la iluminación de la planta. A) diagrama de circuito esquemático de la lámpara. Pares de LED se pueden activar / desactivar de forma individual para que el rayo direccional. LED: diodo emisor de luz, R: resistencia, T: transistor, JP: cabeza de alfiler. B) El diseño final de la lámpara de iluminación fue dibujado usando un software de PCB (PCB: placa de circuito impreso). Proporcionamos el archivo de diseño de la placa en el material complementario. A continuación, la placa fue fabricado y ensamblado en el taller de máquinas MIBA de nuestro instituto. C) Fotografía del anillo de LED de encendido. Cuatro pares de un rojo y un LED azul están dispuestos en un anillo. D) El rango de tensión se puede ajustar entre 3,5 V y 14,0 V. Las resistencias se utilizaron para llegar a la cantidad de luz que van desde 30-250 mmol / m 2 / s (R1-8: 220 Ohm, R9-12: 1.220 Ohm ). E) El espectro de emisión de la lámpara, GFP y YFP.<html> tp: //ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig3large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig4.jpg" /> Figura 4: Tiempo de grabación de lapso de Arabidopsis thaliana raíces laterales. El 5 días de edad de plántulas expresa un marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) y un reportero nuclear (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) que marca específicamente periciclo células que se convierten en una raíz lateral. Una pila de 217 imágenes (3 micras z-espacio) se capturó cada 15 min para la grabación de 17 h utilizando un objetivo 20X / 0.5. A) cuatro puntos de tiempo de 69 se muestran en una proyección de intensidad máxima. B) se muestran Seis de cada 217 rebanadas individuales de una pila Z de un punto de tiempo. Las barras de escala en A y B representan 100 micras.carga / 55044 / 55044fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/55044/55044fig5.jpg" /> Figura 5: El tiempo de grabación de lapso de Arabidopsis thaliana raíces laterales. El 6 días de edad de plántulas expresa un marcador de membrana (pUBQ10 :: YFP-PIP1; 4) y un reportero nuclear (pGATA23 :: nls-GUS-GFP) que marca específicamente periciclo células que se convierten en una raíz lateral. Una pila de 200 imágenes (1,5 micras z-espacio) se capturó cada 15 min para la grabación de 38 h utilizando un objetivo 40X / 0.75. A) Representación 3D de cuatro puntos de tiempo, los números en la red representan micras, B) sola rebanada a través del plano central de la raíz principal. La barra de escala representa 50 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/55044fig5large.jpg" target="_blank">Por favor</a>clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. Supplemental_File _-_ 3D_Sample_Holder.stl. Se proporciona el archivo de modelo 3D. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-3D_Sample_Holder.stl" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a> Archivo suplementario Anillo Board.brd LED. Se proporciona el archivo de diseño de la placa. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55044/Supplemental_File-LED_Ring_Board.brd" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Este protocolo muestra un método de preparación de muestras de plantas para microscopía de lámina ligera. La configuración se caracteriza por montar la planta verticalmente sobre la superficie de un gel y dejarla crecer en condiciones de brillo controladas. Esto permite la observación a largo plazo del desarrollo de los órganos de la planta en condiciones estandarizadas.

Microscopía de luz Hoja de fluorescencia de las raíces de plantas que crecen en la superficie de un gel

One of the key questions in understanding plant development is how single cells behave in a larger context of the tissue. Therefore, it requires the ...

El objetivo general de este procedimiento es obtener observaciones a largo plazo de un sistema radicular vegetal mediante microscopía de hoja de luz. Para lograrlo, es fundamental contar con un método suave de preparación de muestras, condiciones controladas de cultivo y una técnica de imagen que no altere el desarrollo de la planta, como la microscopía de hoja de luz. Para comenzar, las plantas se cultivan sobre la superficie de una capa delgada de gel de dos milímetros de espesor.El gel con una plántula de Aribidopsis se corta entonces, se recoge y se transfiere al portaobjetos del microscopio. Dentro del microscopio, la planta crece en su posición natural vertical. Las raíces crecen en un medio líquido, mientras que las hojas permanecen en el aire.Un sistema de iluminación ilumina únicamente las hojas. La superficie del agua está cubierta para mantener las raíces en la oscuridad. Una de las principales ventajas de esta técnica frente a los métodos existentes, como incrustar la raíz dentro del gel, es que estamos acostumbrados a cultivar plantas sobre la superficie de un gel.Por lo tanto, podemos mantener exactamente el mismo protocolo de cultivo que antes. Y en segundo lugar, la raíz está en contacto directo con el medio líquido, el cual puede ser reemplazado para tratamientos farmacológicos, por ejemplo. Vierta 30 mililitros de medio MS de fuerza mitad, recién autoclavado y que contenga 1,5 por ciento de fitogel, en una placa de Petri cuadrada para crear una capa de aproximadamente 2 milímetros.Siembre semillas estériles una al lado de la otra con al menos un centímetro de espacio entre ellas. Luego, envuelva la placa con cinta de micro-poro. Cultive la placa en posición vertical en su incubadora de crecimiento durante hasta 10 días.En este experimento, utilizamos plantas de seis días de edad para observar el desarrollo de raíces laterales. Proporcionamos un modelo para imprimir en 3D el portamuestras. Hemos probado diferentes materiales.Las resinas transparentes fueron las más adecuadas en términos de rigidez y resistencia al agua. En el manuscrito se describe detalladamente las dimensiones para mecanizar un portamuestras a partir de un material sólido. Corte el gel alrededor de la planta utilizando un escalpelo.Luego, retire cuidadosamente el bloque de gel sobre el cual está creciendo la planta y transfiéralo con cuidado al portamuestras. Derrita el aggros al 1 por ciento a 80 grados Celsius y enfríelo hasta 33 grados Celsius. Pegue el bloque de gel sobre el portamuestras y fije la planta sobre el gel con cuidado.Utilice un microscopio estereoscópico para verificar la posición de la planta y asegúrese de que la región de interés no esté cubierta por ningún gel. Para evitar que la planta se seque, deslice el portaobjetos sobre la punta de un pipeta de 1,000 microlitros siempre que sea posible. Coloque el portaobjetos sobre una caja de puntas de pipeta y prepare más muestras si es necesario.Nuestro microscopio es un modelo de espín abierto clásico sin modificaciones importantes. Implementamos un sistema de iluminación para el cultivo de plantas dentro del microscopio. Los LED rojos y azules están dispuestos en forma de anillo.Los pares de LED pueden encenderse y apagarse individualmente para proporcionar iluminación direccional. El espectro del sistema de iluminación coincide con el de nuestras cámaras de crecimiento. Casi toda la luz procedente de los LED es bloqueada por el filtro de emisión para GFP.No pudimos detectar ninguna luz dispersa que llegara a la cámara. Por lo tanto, la luz puede mantenerse encendida durante la adquisición de imágenes. La intensidad de la luz puede ajustarse, y varía entre 30 y 250 micromoles por metro cuadrado por segundo.Sujete con tornillos o pegamento el anillo LED en el lado inferior del brazo del portaobjetos giratorio abierto. Vuelva a montarlo en el microscopio y conecte los cables. Monte el sistema de perfusión.Conecte los tubos a la cámara de muestra en una disposición unidireccional. Ajuste la velocidad a un mililitro por minuto. Añada tres cuadrados de milímetro de un papel plástico negro estéril y distribúyalos sobre la superficie del agua.Introduzca la muestra en el microscopio. Verifique que no haya láminas de plástico adheridas al portaobjetos. Cierre la cámara con dos tapas hechas de papel de aluminio negro.Encienda la luz y ajuste la intensidad luminosa. Apague la luz del cuarto e inicie la grabación. Este método permite registrar el crecimiento radicular durante varias horas hasta días, mostrado aquí mediante el crecimiento de una raíz lateral.Las imágenes de un z-stack de un único punto temporal muestran buenas propiedades de sección óptica. Capturamos todo el proceso de formación de raíces laterales en 3D, lo que nos permite estudiar la dinámica de este proceso. Observar una única sección de esta grabación muestra una buena resolución, incluso en las profundidades de la raíz.Después de ver este video, deberías tener una comprensión clara del método de preparación de muestras vegetales para microscopía de hoja de luz. Siguiendo este protocolo, ahora podemos observar la localización intracelular de proteínas o los patrones de expresión génica durante la organogénesis, los tropismos vegetales o la adaptación de las plantas. Esto nos ayudará a comprender la regulación espacio-temporal del desarrollo vegetal.

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Biología

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