Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es observar el movimiento de proteínas marcadas con fluorescencia en las superficies de células vegetales mediante microscopía de fluorescencia epiconfocal con ángulo variable. Este método puede ayudarnos a avanzar en el campo de la biología celular vegetal, por ejemplo, en comprender cómo funcionan las proteínas en las superficies de las células vegetales. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite visualizar en tiempo real la dinámica de proteínas marcadas con fluorescencia antes de comenzar el procedimiento.

Calibre el centrado y enfoque del láser del microscopio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Luego, utilice una trayectoria de luz libre del objetivo para localizar el centro del techo de la sala de microscopía y marque la posición con un sello de color. A continuación, ilumine el techo con un objetivo y mueva la región iluminada hasta la posición central.

Luego enfoque el láser y ajuste finamente la posición del láser al centro del techo. La centración y el enfoque del láser son muy importantes para una observación exitosa mediante microscopía episcópica de ángulo variable o VAEM. Los usuarios deben ser capacitados por un personal profesional de la empresa del microscopio antes de comenzar un experimento.

Cuando el microscopio esté listo, dispense 30 microlitros de tampón basal en el centro de una placa de vidrio de 76 por 26 milímetros. Luego, use tijeras de disección para retirar un cóleoptilo de una plántula de siete días de edad y coloque el cóleoptilo flotando sobre la gota de tampón basal con la cara de observación hacia arriba. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón basal en el centro de una placa de 18 por 18 milímetros.

Cubra el vidrio y gire el cubreobjetos boca abajo. La tensión superficial suavemente evitará que la gota caiga, sosteniendo el cubreobjetos con pinzas en un borde. Coloque el borde opuesto sobre la portaobjetos de manera que el tampón quede sobre la entrada del co.

Luego, manteniendo el borde del cubreobjetos sobre el portaobjetos, ajuste la posición de la gota para que quede directamente encima de la muestra de oleína y deje caer el cubreobjetos. Si no hay burbujas de aire, utilice tejidos libres de pelusas para eliminar el exceso de tampón y transfiera inmediatamente la preparación al microscopio.

Utilizando iluminación de campo claro, seleccione las células para la observación. A continuación, confirme que la proteína fluorescente pueda ser observada y use la iluminación de fluorescencia epiescopia para ajustar la posición del eje Z en la superficie celular. Para realizar VAEM, utilice la caja de control para inclinar el ángulo de entrada del haz láser.

Gradualmente, mientras se monitorea cuidadosamente la imagen en vivo. Inicialmente, la imagen aparecerá borrosa. A medida que aumenta el ángulo del láser, la imagen VAEM será menos borrosa, produciendo finalmente una imagen nítida.

En este momento, deje de aumentar el ángulo del láser. Ahora está bien. Ajuste finamente el ángulo de entrada del láser para obtener una mejor imagen, modificando los parámetros ópticos y del sensor de imagen según sea necesario.

Luego, utilizando el software comercial del microscopio, adquiera una película como un archivo de imagen TIFF de varias páginas. Aquí, la película muestra puntos marcados con GFP parpadeando sobre la superficie de células modelo STA. Para cuantificar el tiempo de residencia de los puntos marcados con GFP utilizando Fiji, vaya al menú abrir del archivo y abra el archivo TIFF de varias páginas adquirido.

Utilice la herramienta de selección de línea recta para colocar una línea en el lado de interés. A continuación, utilice el complemento de corte dinámico de pilas de imágenes para generar una imagen del gráfico. A medida que la línea cambia, la imagen del gráfico cambiará dinámicamente.

Guarde la imagen como un archivo TIFF en el menú archivo, guardar como TIFF. Luego, para realizar una reducción del ruido, vaya al menú procesar filtros desenfoque gaussiano y aplique un filtro gaussiano a las imágenes cronográficas. El parámetro del radio sigma debe ajustarse según sea necesario.

Utilizando la herramienta de ajuste de umbral de imagen, segmente las regiones de señal mediante umbralización y abra el menú de configuración de mediciones de análisis. A continuación, marque el rectángulo delimitador en la ventana de configuración de mediciones, seleccionando el número mínimo posible de píxeles. Luego, en el menú Analizar, seleccione Analizar partículas.

Mida el tiempo del punto de interés respecto al eje Y y revise los resultados mostrados; luego, agréguelos a los cuadros del administrador para ver los valores de los datos. Finalmente, en el menú de la tabla de resultados, seleccione archivo, guardar como y procese el conjunto de datos de las duraciones de las imágenes de puntos utilizando el software de análisis adecuado. Aquí se muestran los tiempos de residencia de 185 puntos GFP patrol uno provenientes de 12 células subsidiarias independientes en octavo edin, medidos mediante análisis de gráficos chm, como se ilustra en la gráfica.

La función de densidad ajustada reveló que la mayoría de los puntos GFP patrol uno residieron en una célula subsidiaria entre dos y 10 segundos, con un pico de aproximadamente 3,5 segundos. Esto sugiere una exocitosis y endocitosis rápida de las bombas de protones en la superficie de la célula subsidiaria. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar la dinámica de proteínas de tipo ary en la superficie de células vegetales utilizando microscopía de fluorescencia epiconfocal con ángulo variable.