Imágenes en tiempo real de la Planta Dinámica superficie celular con Variable de ángulo epifluorescencia Microscopía

El objetivo general de este procedimiento es observar el movimiento de proteínas marcadas con fluorescencia en las superficies de las células vegetales con microscopía de epifluorescencia de ángulo variable. Este recipiente puede ayudarnos a progresar en el campo de la biología celular de las plantas, como la forma en que funcionan las proteínas en las superficies de las células de placa. La principal ventaja de esta técnica es que nos permite visualizar la dinámica en tiempo real de las proteínas fluorescentes de ataque antes de comenzar el procedimiento.

Calibre el centrado y el enfoque láser del microscopio de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, utilice una trayectoria de luz sin lente del objetivo para localizar el centro del techo de la sala de microscopía y marque la posición con un sello de color. A continuación, ilumine el techo con una lente objetivo y mueva la región iluminada a la posición central.

A continuación, enfoque el láser y ajuste la posición del láser en el centro del techo. El centrado y el enfoque del láser son muy importantes para el éxito de la observación con microscopio epiolfativo de ángulo variable o VAEM. Los usuarios deben ser entrenados por un miembro del personal profesional de la empresa de microscopios antes de comenzar un experimento.

Cuando el microscopio esté listo, dispense 30 microlitros de tampón basal en el centro de un portaobjetos de vidrio de 76 por 26 milímetros. A continuación, utilice unas tijeras de disección para extraer una coleadina de una plántula de siete días de edad y haga flotar la coleadina con el lado de observación hacia arriba sobre la gota de tampón basal. A continuación, agregue 30 microlitros de tampón basal en el centro de un tampón de 18 por 18 milímetros.

Cubra el vidrio y voltee el cubreobjetos boca abajo. La tensión superficial suave evitará que la gota caiga, sosteniendo el cubreobjetos con pinzas en un borde. Coloque el borde opuesto en la corredera de vidrio de modo que el tampón quede sobre la entrada de CO.

A continuación, mantenga el borde de la cubierta de vidrio en el portaobjetos. Ajuste la posición de la gota para que quede directamente sobre la muestra de oleína y deje caer el cubreobjetos. Si no hay burbujas de aire, use pañuelos sin pelusa para limpiar el exceso de tampón y transfiera inmediatamente la preparación al microscopio.

Con la iluminación de campo claro, seleccione las celdas para la observación. A continuación, confirme que se puede observar la proteína fluorescente y utilice la iluminación de epifluorescencia para establecer la posición del eje Z en la superficie de la célula. Para realizar VAEM, use la caja del controlador para inclinar el ángulo de entrada del rayo láser.

Poco a poco mientras monitorea la imagen en vivo cuidadosamente. Inicialmente, la imagen aparecerá borrosa. A medida que aumenta el ángulo del láser, la imagen VAEM se volverá menos borrosa, lo que finalmente producirá una imagen clara.

En este punto, deje de aumentar el ángulo del láser. Ahora está bien. Ajuste el ángulo de entrada del láser para obtener una mejor imagen, ajustando los parámetros ópticos y del sensor de imagen según sea necesario.

Luego, usando el software de microscopio comercial, adquiera una película como un archivo de imagen TIFF de varias páginas. Aquí, la película muestra puntos etiquetados con GFP parpadeando en la superficie de las celdas del modelo STA. Para cuantificar el tiempo de residencia GFP etiquetado como DOT usando Fiji, vaya al menú de apertura de archivos y abra el archivo de consejos de varias páginas adquirido.

Utilice la herramienta de selección de línea recta para colocar una línea en el lado de interés. A continuación, utilice el complemento de corte de resolución dinámica de pilas de imágenes para generar una imagen gráfica. A medida que cambia la línea, la imagen del gráfico cambiará dinámicamente.

Guarde la imagen como un archivo TIFF en el menú archivo, guardar como tiff. Luego, para realizar una reducción de ruido, vaya al menú de desenfoque gaussiano de filtros de proceso y aplique un filtro gaussiano a las imágenes del cronógrafo. El parámetro de radio sigma debe ajustarse según sea necesario.

Con la herramienta de umbral de ajuste de imagen, segmente las regiones de señal por umbral y abra el menú analizar mediciones establecidas. A continuación, compruebe el rectángulo delimitador en la ventana de medidas establecidas, seleccionando el número mínimo de píxeles posible. Luego, en el menú analizar, analizar partículas.

Mida el tiempo del punto de interés con respecto al eje Y y verifique los resultados de la visualización y agregue a los cuadros del administrador para ver los valores de los datos. Por último, en el menú de la tabla de resultados, seleccione archivo, guarde como y procese el conjunto de datos de duraciones de imágenes de puntos utilizando el software de análisis adecuado. Aquí, los tiempos de residencia de 185 puntos de patrulla GFP de 12 celdas subsidiarias independientes en la octava edin, medidos por el análisis de gráficos chm, se muestran como se ilustra en el gráfico.

La función de densidad ajustada reveló que la mayoría de los puntos de la patrulla GFP residían en una celda subsidiaria durante entre dos y 10 segundos, con un pico de alrededor de 3,5 segundos. Esto sugiere una exocitosis rápida, endocitosis de las bombas de protones en la superficie de la célula subsidiaria. Después de trabajar en este video, debe tener una buena comprensión de cómo visualizar y cuantificar la dinámica de proteínas de tipo ario en la superficie de las células vegetales utilizando microscopía de epifluorescencia de ángulo variable.