De alto rendimiento CRISPR vector de la construcción y caracterización de las modificaciones del ADN mediante la generación de raíces peludas tomate

El objetivo general de este procedimiento de clonación y transformación es generar de manera eficiente vectores CRISPR y eliminar raíces de tomate mutantes que puedan usarse en estudios genómicos funcionales. Este método es una herramienta útil en el campo de la genómica de plantas porque puede generar una gran cantidad de mutantes knockout que se pueden usar en una variedad de procesos radiculares. La principal ventaja de esta técnica es que el procedimiento de clonación se puede realizar en un solo paso, lo que afianza que los materiales del grupo se pueden obtener en cuestión de semanas.

En primer lugar, diseñe oligonucleótidos de ARN o ARNg para incluir la parte GN19 de los motivos objetivo flanqueados por las secuencias de cinco nucleótidos primos y tres primos 20 necesarios para el ensamblaje del ADN. Digiera de uno a cinco microgramos de plásmido de caznina P201N con la enzima de restricción Spe1 a 37 grados centígrados durante dos horas. Después de purificar el digesto en columna de acuerdo con las instrucciones del fabricante, vuelva a suspender en 15 microlitros de Trs HCL de 10 milimolares.

Cuantificar la cantidad de ADN mediante espectrofotometría UV. Realice una segunda digestión con una enzima de restricción Swa1 a 25 grados centígrados durante dos horas. Verifique de 100 a 200 nanogramos en un gel de agarosa al ocho por ciento para confirmar la digestión completa.

Un plásmido correctamente digerido tendrá una sola banda a 14.313 pares de bases. Para amplificar la PCR de la truncatula, utilice seis ADN promotores y de andamiaje del plásmido lanzadera de ARNg del disco. Utilice el cebador Swa1 y Mtu6F y MTU6R, y el andamio F en el andamio R Spe1, en una polimerasa de alta fidelidad.

Visualice tres aliquats de microlitros de productos de PCR en un gel de agarosa al uno por ciento para confirmar la amplificación. El amplicón MTU6 tiene 377 pares de bases y el amplicón del andamio es de 106 pares de bases. Purifique en columna el resto de los productos de PCR de acuerdo con las instrucciones del fabricante.

Cuantifique por espectrofotometría UV como antes y almacene a menos 20 grados centígrados. A continuación, vuelva a suspender todo el tubo de oligonucleótidos de ARNg a 100 micromolares en agua de laboratorio. Agregue un microlitro de los oligonucleótidos a 500 microlitros de tampón 1xNEB dos punto uno y mezcle bien.

Programe un termociclador con una tapa calentada para que se mantenga a 50 grados centígrados. Combine 100 nanogramos del vector linealizado, 50 nanogramos del promotor MtU6, 12 nanogramos de Scaffold y un microlitro de oligonucleótido de ARNg diluido en agua hasta obtener un volumen final de cinco microlitros. Agregue cinco microlitros de 2X DNA Assembly Mastermix de alta fidelidad.

Mezclar bien y girar. Incubar la reacción durante 60 minutos en el termociclador a 50 grados centígrados. Después de la hora a 50 grados centígrados, coloque la reacción en hielo y luego use dos microlitros para transformar las células competentes de E. Coli utilizando técnicas estándar.

Coloque la transformación en agar LB suplementado con 50 miligramos por mililitro de kanamicina e incube a 37 grados centígrados durante la noche. Cribar las colonias mediante PCR con el cebador StUb3p 218R y 1Sce1R. Diluya un alequat de la reacción de ensamblaje de ADN restante con agua de uno a cinco, y use un microlitro como control positivo para la detección de colonias.

También incluye un nanogramo de plásmido circular P201N casnine como control sin inserto. Después de la amplificación de PCR utilizando los parámetros contenidos en la parte escrita del protocolo, visualice el producto de PCR en un gel de agarosa al uno por ciento. Las inserciones correctas tienen una banda de 725 pares de bases y los vectores sin inserciones tendrán una banda de 310 pares de bases.

Cultive colonias positivas en cultivos líquidos LB Can50 durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, purifique los plásmidos con un kit de purificación de plásmidos de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Después de que Sanger secuenciara los plásmidos purificados con el cebador StuB3P218R, alinee los cromatogramas con el promotor MtU6, el objetivo y las secuencias de andamio para asegurarse de que no se introdujeron errores durante la clonación.

Realice una digestión diagnóstica digiriendo un microgramo de plásmido con EcoR5 y Sti1. Cuando se visualiza en un gel de agarosa de punto cero ocho, se debe ver este golpeteo de bandas. Finalmente, transforme los plásmidos en la cepa ARqua1 de Agrobacterium rhizogenes agregando un microlitro de la preparación del plásmido a 50 microlitros de celdas electrocompetentes y electroporando en una cubeta de un milímetro.

Agregue aproximadamente 500 microlitros de SOC Media y agite a 28 grados centígrados durante dos horas. Luego coloque en placas LB Can50 y crezca a 28 grados centígrados durante dos días. Comience esta sección del procedimiento esterilizando las semillas de tomate en lejía doméstica al 20 por ciento durante 15 minutos con una mezcla constante.

Luego transfiera las semillas a una campana de flujo laminar. Retire la lejía y lave con agua estéril de laboratorio tres veces. Coloque 30 semillas en una caja GA7 que contenga la mitad de MS Media.

Deja germinar durante unos dos días en la oscuridad. Una vez que las semillas hayan germinado, mueva las cajas de GA7 a la luz el día antes de la transformación, saque los cultivos de A. rhizogenes en LB sólido que contenga Can50 y crezca a 28 grados centígrados durante la noche. El día de la transformación, trabaje en la campana de flujo laminar para agregar 25 microlitros de acetosiriinga a 50 mililitros de medio MS y vierta seis mililitros en cada tubo de cultivo.

Use una punta doblada de 200 microlitros para raspar las células de A. rhizogenes de la placa y vuelva a suspenderlas en los seis mililitros de medio líquido MS. Agite el tubo para resuspender completamente las células. Después de resuspender las células de cada vector, tome un mililitro de células y mida la densidad óptica a una longitud de onda fija de 600 nanómetros.

Agregue dos mililitros de medio líquido MS a una placa de Petri con un papel de filtro estéril. Retire los cotiledones de las plántulas y colóquelos sobre el papel de filtro humedecido. Una vez que se hayan recolectado todos los cotiledones, corte el centímetro más distal de los cotiledones, dando como resultado piezas de cotiledón con dos extremos cortados.

Agregue las ex plantas a las soluciones de A. rhizogenes y mezcle. Incubar durante 20 minutos con inversión ocasional. Durante la incubación de A. rhizogenes, agregue un trozo de papel de filtro a una placa de Petri para cada transformación de constructo.

Además, ponga a secar la mitad de los medios sólidos MS sin antibióticos en la campana de flujo laminar. Use pinzas estériles para sacar los cotiledones de la solución de A. rhizogenes y colóquelos en papel de filtro seco. Cubra con una tapa de placa de Petri para asegurarse de que los tejidos no se sequen mientras se procede a la siguiente transformación.

A continuación, seque los cotiledones en el papel de filtro y transfiera el lado abaxial hasta la mitad de los medios MS. Envuelva las placas con cinta quirúrgica y cocultive en la oscuridad a temperatura ambiente durante dos días. Después del co-cultivo, transfiera los cotiledones con el lado abaxial hacia arriba a medio medio MS suplementado.

Envuelva con cinta quirúrgica. Mantenga los cultivos bajo luces fluorescentes a temperatura ambiente con un fotoperíodo de 16 horas. Después de un punto cinco a dos semanas, use pinzas estériles y un bisturí para extirpar las raíces de al menos dos centímetros de largo de los cotiledones y transfiéralas a ticarcillon/ácido de clavulanato y kanamicina suplementadas con medio MS.

Transfiera de diez a 15 raíces a un solo plato. Marque la posición de las puntas de las raíces con un marcador. Envuelva con cinta quirúrgica y manténgalo en la sala de cultivo.

Después de una semana, se ven crecer las raíces transformadas en los medios selectivos. Coseche una submuestra de raíces transformadas para la extracción de ADN utilizando el método de extracción de ADN preferido. Las raíces pilosas se pueden ver emergiendo de los cotiledones 11 días después de la transformación.

Las raíces se seleccionan con ácido de ticacillona/clavulanato y kanamicina suplementada con la mitad de MS Media durante aproximadamente una semana. Las barras grises denotan la posición de las puntas de las raíces en el momento del enchapado. Este es un ejemplo de clonación y secuenciación de productos de PCR para determinar mutaciones en el ADN con dos objetivos genéticos diferentes en cuatro eventos diferentes de raíces pilosas.

El recuadro gris denota la secuencia diana GN20 GG y delta indica el tipo de mutación. El número de clones con la mutación indicada se muestra a la derecha. Este es un ejemplo de un gel de poliacrilamida para determinar mutaciones en el ADN.

Las deleciones grandes y las bandas heterdúplex indican la presencia de mutaciones en el ADN en las secuencias diana. Seis de los 12 eventos independientes fueron puntuados como mutantes, como lo indica el símbolo delta. WT indica el control de tipo salvaje y NT el control sin plantilla.

Una vez dominados, se pueden producir de decenas a cientos de vectores CRISPR en una sola semana y los materiales del grupo trendulado se pueden obtener en cuestión de semanas. Al intentar este procedimiento, es importante eliminar e inhibir el crecimiento de cualquier Agrobacterium residual. El crecimiento excesivo de Agrobacterium inhibirá y matará cualquier material de raíz.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar vectores CRISPR usando el ensamblaje de ADN, y cómo probar esos vectores usando un sistema de modelo de raíz peluda y tomate.