Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

El objetivo general de esta tira de prueba inmunocromatográfica con oro coloidal es diferenciar la mioglobina de los cetáceos de la de las focas y otros animales. Este método puede proporcionar un tamizaje rápido y en el lugar para la carne de cetáceo, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. La principal ventaja de esta técnica es que un resultado exitoso puede observarse directamente entre cinco y diez minutos después de homogeneizar 0,3 gramos de músculo, con una especificidad y sensibilidad notables.

Por lo tanto, este método puede proporcionar una detección rápida de carne de cetáceo en el campo. También puede aplicarse a otras carnes, como carne de caballo o de cerdo. Para diseñar péptidos sintéticos destinados a generar anticuerpos monoclonales con reactividad frente a la mioglobina de cetáceos, se analizan las secuencias de aminoácidos de las regiones antigénicas reactivas de la mioglobina de diversos animales.

Comience recuperando de GenBank las secuencias de aminoácidos de mioglobina de atún, pollo, avestruz, mamíferos domésticos, foca y 18 especies de cetáceos. A continuación, alinee las secuencias utilizando el software adecuado. Inicie el Explorador de Alineamiento seleccionando Alinear Editar/Construir Alineamiento en la barra de inicio.

Seleccione Crear nueva alineación y haga clic en Aceptar. Aparecerá un cuadro de diálogo que preguntará: ¿está creando un alineamiento de secuencia de ADN o de proteína? Haga clic en el botón etiquetado como Proteína, seleccione Datos Abrir Recuperar secuencias desde archivo y seleccione el archivo de secuencia. Seleccione el comando de menú Editar Seleccionar todo para seleccionar todos los sitios de cada secuencia en el conjunto de datos con el fin de crear un alineamiento múltiple de secuencias.

Seleccione Alineamiento Alinear por ClustalW en el menú principal. Seleccione BLOSUM como matriz de pesos para proteínas y luego haga clic en el botón Aceptar. El tercer paso consiste en analizar el alineamiento de secuencias.

Enfóquese en cinco sitios reactivos antigénicos y encuentre el fragmento conservado entre los cetáceos. Un asterisco simboliza el consenso en el alineamiento e indica una posición que tiene un residuo único y completamente conservado. Se encontraron dos fragmentos conservados en los cetáceos.

Los fragmentos de secuencia candidatos se sintetizan luego y se utilizan para generar anticuerpos monoclonales. Comience este procedimiento determinando el pH óptimo para la solución de oro coloidal, definido como el pH mínimo que mantiene la mezcla de anticuerpo monoclonal y solución de oro coloidal de color rojo durante dos horas. Añada 0,15 microgramos de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de cinco a nueve.

Para los fines de esta demostración, se ensayaron los valores de pH seis y pH ocho. El pH ocho se consideró el valor óptimo en este paso de optimización. A continuación, determine la concentración óptima del anticuerpo monoclonal añadiendo diversas cantidades de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución coloidal de oro a pH ocho.

La concentración óptima, que en este estudio es de seis microgramos por mililitro, mantendrá el color de la mezcla rojo sin precipitado negro. Basándose en los resultados de los pasos de optimización, agregue 60 microgramos del anticuerpo monoclonal detector purificado gota a gota a 10 mL de solución coloidal de oro. Emulsione suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante diez minutos.

Agregue dos mililitros de una solución de BSA al 5 % en PBS a la mezcla y emulsione suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos para reducir la interferencia de fondo. Centrifugue la mezcla a 10 000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante con el anticuerpo no conjugado y suspenda el precipitado resultante en 4 mL de PBS-T que contenga BSA al 1 % y Tween-20 al 0,1 %.

Repita la centrifugación y la suspensión una o dos veces. Suspenda los precipitados finales en 1 mL de PBS-T y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta su uso. A continuación se muestra un gráfico del diseño de la tira inmunológica.

Las dimensiones del cartón, las almohadillas y la membrana de nitrocelulosa se indican en el texto del protocolo. Para prolongar la vida útil del almacenamiento, las tiras inmunes deben prepararse y ensamblarse en condiciones ambientales de laboratorio con baja humedad. Utilice una micropipeta para agregar la solución de anticuerpo monoclonal marcado con oro coloidal a la almohadilla de conjugado hasta saturarla, y luego seque la almohadilla a 37 grados Celsius durante una hora antes del ensamblaje.

Una vez que la almohadilla de conjugado esté seca, utilice cinta adhesiva de doble cara para pegar primero la membrana de nitrocelulosa sobre el cartón. Mediante una impresora de tiras inmunológicas, distribuya el anticuerpo monoclonal específico para la captura del antígeno y el anticuerpo anti-IgG de ratón rápido en la zona de prueba y la zona de control, respectivamente, sobre la membrana de nitrocelulosa. Mantenga una distancia mayor a cinco milímetros entre las dos zonas.

Luego, pegue la almohadilla de conjugado en un lado de la membrana de nitrocelulosa y la almohadilla absorbente en el otro lado, superponiendo las almohadillas en cada lado aproximadamente dos milímetros. Coloque la almohadilla de muestra sobre la almohadilla de conjugado dos milímetros y péguela en el cartón. Utilice una cortadora de papel para crear tiras de seis milímetros de ancho.

Empaquete las tiras en una bolsa de papel de aluminio con un agente desecante y almacénelas a cuatro grados Celsius hasta su uso. Para preparar una muestra para la prueba de reactividad cruzada, agregue 1 mL de PBS que contenga 0,1 % de BSA a 0,03 gramos de músculo crudo. Y utilice un palillo de bambú o una varilla de molienda para homogenizar la muestra.

Sujete la tira inmunológica por el extremo opuesto al área de prueba y sumerja la parte de la almohadilla de muestra en el espécimen durante cinco a diez minutos. Observe el resultado directamente. Pruebe varias muestras de músculo por triplicado.

La línea de prueba T está diseñada para mostrar una señal positiva cuando ambos anticuerpos monoclonales detectan mioglobina de cetáceos. Dado que la mioglobina de animales no cetáceos solo puede ser detectada por uno de estos dos anticuerpos monoclonales, la línea de prueba muestra un resultado negativo cuando se analizan muestras musculares de otros animales. La línea de control C siempre debe mostrar un resultado positivo porque el anticuerpo rápido anti-IGG de ratón se une al anticuerpo de detección marcado con oro coloidal.

Un resultado negativo en la línea de control indica que la calidad de los materiales en la tira es deficiente. El análisis de sangre mediante Western con sobrenadantes de hibridoma muestra que el anticuerpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una única banda teñida con un peso molecular predicho de aproximadamente 17kDa. La ballena jorobada común muestra una banda comparativamente más débil que las de otros cetáceos.

No se observan bandas para atún, sardina y pollo. Mientras que para cerdo se observa una banda de aproximadamente 50 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante análisis de sangre en punto.

Aunque el análisis sanguíneo por Western con el anticuerpo monoclonal CSF1H13 muestra múltiples bandas inespecíficas para cerdo y atún, CSF1H13 es altamente específico porque reacciona únicamente con cetáceos. Y la foca presenta una banda en el peso molecular predicho de aproximadamente 17 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante el análisis sanguíneo por punto.

Los resultados de ELISA indirecto de extractos musculares de diferentes especies utilizando CGF5H9 purificado muestran señales positivas para vaca, cabra, perro, conejo y cetáceos, una señal positiva débil para cerdo, y señales negativas para atún, pollo y foca. CSF1H13 muestra alta afinidad hacia los cetáceos y las focas. Ambos anticuerpos monoclonales pueden reaccionar fuertemente con las cuatro especies de cetáceos, que pertenecen a diferentes familias, lo que indica su amplia reactividad frente a diversas especies de cetáceos.

La especificidad de la tira inmunológica de oro coloidal se muestra en estos resultados representativos. El uso de muestras de músculo no provenientes de cetáceos da como resultado una única banda en la línea de control. Sin embargo, cuando se utilizan muestras de músculo de cetáceos, las bandas de señal están presentes tanto en la línea de prueba como en la línea de control.

Una vez dominada, la preparación de anticuerpos marcados y la construcción de tiras puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseñar cuidadosamente el péptido. Utilice varios métodos para seleccionar anticuerpos monoclonales adecuados.

Y utilice una coloidal de oro de alta calidad para preparar anticuerpos marcados. Tras seguir estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como el análisis de ADN basado en PCR para responder preguntas adicionales, como la especie de cetáceo y su procedencia. El anticuerpo monoclonal CSF1H13, que es potente y exhibe afinidad únicamente hacia mamíferos marinos, puede emplearse en diversos formatos de ELISA que ofrecen muchas otras oportunidades para estudiar los aspectos biológicos, fisiológicos y químicos de la mioglobina en mamíferos marinos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar anticuerpos monoclonales específicos y aplicarlos posteriormente en una tira de prueba rápida.