Name: Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 48 s
Description: Aprende a desarrollar una tira de prueba inmunocromatográfica con oro coloidal para detectar mioglobina de cetáceos. Este método permite un cribado rápido en campo para prevenir el comercio ilegal de carne de ballena con alta especificidad.

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Agradecemos a los colegas de la Sociedad de Cetáceos de Taiwán, el Centro de Investigación de Biología Marina y Cetáceos de la Universidad Nacional Cheng Kung, el Parque Oceánico Farglory y el Centro de Diagnóstico de Enfermedades Animales de la Universidad Nacional de Chiayi por la recolección de muestras. Este proyecto fue financiado por una subvención del Consejo de Agricultura de Taiwán (100AS-02.1-FB99) a WCY.

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El uso de un péptido sintético conjugado con la proteína portadora es notablemente más eficaz en comparación con su proteína afín. Para una técnica basada en sándwich, debido a que el MAB se desarrolla utilizando epítopos con ubicaciones relativas conocidas, los dos anticuerpos monoclonales en este estudio no pueden interferir con la interacción de cada uno con el epítopo del antígeno diana. Además, la reactividad entre la proteína nativa y el anticuerpo de ratones inmunizados con el conjugado de péptido sintético puede...

Históricamente, la carne de cetáceo se ha consumido en muchas partes del mundo y este consumo continúa hoy en día1. Debido al nivel trófico de los cetáceos, se sabe que hay altos niveles de mercurio y otras toxinas en su carne2. Por lo tanto, el consumo de carne de cetáceo podría generar un problema de salud no solo para los grupos de alto riesgo, como las mujeres embarazadas, sino también para la población en general3. Además, la contaminación de la carne de cetáceo con patógenos zoonóticos o potencialmente zoonóticos también puede ocurrir durante su procesamiento y almacenamiento4. Es difícil, incluso para los agentes experimentados, identificar las carnes de cetáceos solo por su apariencia. Por lo tanto, se requiere un método científico confiable de identificación para diferenciar la carne de cetáceo de otras carnes. Esto ayudaría a limitar el consumo de carne de cetáceo.
Los métodos actuales de identificación de especies incluyen técnicas moleculares y métodos inmunológicos. Las técnicas moleculares, como la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y la secuenciación del ADN, pueden utilizarse para identificar muestras no solo de carne cruda5 y muestras descompuestas6, sino también de alimentos procesados como salchichas cocidas y piensos7,8. Los métodos inmunológicos, como el ensayo de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA), se aplican comúnmente en la producción de alimentos para detectar el contenido de carne de, por ejemplo, cerdo9, carne de res10 y bagre11. El análisis de ADN basado en PCR para la identificación de carne de cetáceoestá disponible 12 y ha ayudado a prevenir el comercio internacional ilegal de carne de cetáceo en Japón, Corea del Sur, Filipinas, Taiwán, Hong Kong, Rusia, Noruega y Estados Unidos1. Estos métodos son efectivos y confiables, pero pueden tardar horas o días en completarse e implicar pasos laboriosos. La identificación de las carnes de cetáceos suele basarse en técnicas moleculares y actualmente no se dispone de ningún método inmunológico. Para las agencias reguladoras, es muy deseable desarrollar una técnica confiable y rápida que pueda usarse en el campo para identificar carnes de cetáceos. 
Las tiras inmunocromatográficas se utilizan como herramientas de detección con la ventaja de producir resultados rápidos a través de un protocolo simple que es adecuado para su uso en el campo. Los principios de la tira inmunocromatográfica y el ELISA son muy similares, e incluyen anticuerpos, antígenos y marcadores. En el desarrollo de las tiras inmunocromatográficas se han utilizado muchas etiquetas diferentes, como el oro coloidal, el carbono y el látex. En la actualidad, este método es comúnmente utilizado para la detección de antibióticos, toxinas, bacterias y virus13, pero raramente se utiliza para la identificación de proteínas en la carne14,15. En este trabajo proponemos un inmunoensayo enzimático cromatográfico de flujo lateral para la detección rápida de mioglobina (Mb) de cetáceos.

<table><tbody><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato</td><td>AMRESCO</td><td>J373</td><td></td></tr><tr><td>Proteína G HP SpinTrap&nbsp;</td><td>GE&nbsp; Healthcare</td><td>28-9031-34 Columna de</td><td>centrifugación que contiene proteína G Sepharose</td></tr><tr><td>IsoStrip Kit de isotipado de anticuerpos monoclonales</td><td>de ratón Roche</td><td>11493027001</td><td>Tiras de isotipado, prerrecubiertas con anticuerpos anti-Ig de ratón específicos de subclases y cadenas ligeras</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3935</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de nitrocelulosa</td><td>Anticuerpo Whatman</td><td>Z613630</td><td></td></tr><tr><td> solución de bloqueo&nbsp;</td><td>LTK BioLaboratories</td><td></td><td>Para minimizar las interacciones de unión inespecíficas de IgG inespecífica en las muestras</td></tr><tr><td>de sustrato de fosfatasa BCIP/NBT&nbsp;</td><td>KPL</td><td>50-81-00</td><td></td></tr><tr><td>Detector de proteínas HRP Microwell Kit, Anti-Ratón</td><td>KPL</td><td>54-62-18</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Immunoplate MaxiSorp Placa ELISA</td><td>Thermo&nbsp; Fisher Scientific</td><td>EW-01928-08</td><td></td></tr><tr><td>Multiskan&nbsp; Lector EX ELISA&nbsp;</td><td>Termo&nbsp; Electrón&nbsp; Corporation</td><td>51118170</td><td></td></tr><tr><td>Solución de oro coloidal (40 nm)&nbsp;</td><td>REGA biotecnología Inc.</td><td></td><td>40-50 nm es apropiado para immunostrip</td></tr>, <tr><td>albúmina sérica bovina,</td><td>Gibco</td><td>15561-020</td><td></td></tr><tr><td>Impresora de prueba rápida immno-strip</td>, <td>REGA biotechnology Inc.</td><td>AGISMART RP-1000&nbsp;</td><td>Solo apto para la producción a pequeña escala de inmunotiras con fines de investigación y desarrollo</td></tr><tr><td>Componentes de la tira (membranas NC, almohadillas de muestra (vidrio #33, S& S), almohadillas conjugadas (#16S, S& S) y almohadillas absorbentes (CF6, Whatman))</td><td>REGA biotechnology Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freund' s adyuvante e incompleto Freund' s adyuvante&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5881, F5506</td><td>Se utiliza para producir emulsiones de agua en aceite de inmunógenos</td></tr><tr><td>Acrilamida, tampón de gel, persulfato de amonio (APS), tetrametiletilendiamina (TEMED)&nbsp;</td><td>Protech</td><td></td><td>Preparación de gel para SDS-PAGE</td></tr><tr><td>Coomassie azul brillante R-250</td><td>Bio-Rad</td><td>1610436</td><td>Tinción de proteínas en geles SDS-PAGE</td></tr><tr>,<td>tampón de muestra Laemmli y &beta;-mercaptoetanol</td><td>Bio-Rad</td><td>1610737, 1610710</td><td>Diluir muestras de proteínas antes de cargarlas en geles SDS-PAGE</td></tr></tbody></table>

desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de cetáceos mioglobina

Development of a Colloidal Gold-based Immunochromatographic Test Strip for Detection of Cetacean Myoglobin

Este protocolo describe el desarrollo de una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich que se puede utilizar para diferenciar la mioglobina (Mb) de los cetáceos de la de las focas y otros animales. La franja permite un cribado rápido y sobre el terreno de la carne de cetáceos, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. Se desarrollaron dos anticuerpos monoclonales (mAb) con reactividad frente al Mb de cetáceos. Se analizaron las secuencias de aminoácidos de las regiones reactivas antigénicas Mb de varios animales con el fin de diseñar dos péptidos sintéticos (un péptido general y un péptido específico) y posteriormente elevar los mAbs (subclase IgG1). Los mAbs se seleccionaron a partir de hibridomas cribados por ELISA indirecto, Western blot y dot blot. CGF5H9 fue específico para los Mbs de conejos, perros, cerdos, vacas, cabras y cetáceos, mientras que mostró una afinidad débil o nula con los Mbs de pollos, atunes y focas. CSF1H13 pueden atar a focas y cetáceos con fuerte afinidad, pero no mostraron afinidad con otros animales. En este estudio se utilizaron muestras de cetáceos de cuatro familias (Balaenopteridae, Delphinidae, Phocoenidae y Kogiidae), y los resultados indicaron que estos dos mAbs tienen una amplia capacidad de unión a Mbs de diferentes cetáceos. Estos mAbs se aplicaron en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal tipo sándwich. CGF5H9, que reconoce muchas especies, fue marcado con oro coloidal y se utilizó como anticuerpo de detección. CSF1H13, que se recubrió en la zona de ensayo, detectó la presencia de cetáceos y focas Mbs. Se analizaron por triplicado muestras de músculo de atún, pollo, foca, cinco especies de mamíferos terrestres y 15 especies de cetáceos. Todas las muestras de cetáceos mostraron resultados positivos y todas las demás muestras mostraron resultados negativos.

Características de anticuerpos monoclonales Hemos desarrollado dos IgG 1 mAb (CGF5H9 y CSF1H13) que reconocen dos péptidos sintéticos (MKASEDLKKHGNTVLC y AIIHVLHSRHPAEFGC), respectivamente, de los cetáceos Mb, y éstos se utilizaron para construir una tira de prueba inmunocromatográfica de oro coloidal de tipo sándwich para la detección rápida de Mb de cetáceos. Figura 2 muestra que CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sola banda teñi...

Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

This protocol describes the development of a colloidal gold immunochromatographic test strip based on the sandwich format that can be used to ...

El objetivo general de esta tira de prueba inmunocromatográfica con oro coloidal es diferenciar la mioglobina de los cetáceos de la de las focas y otros animales. Este método puede proporcionar un tamizaje rápido y en el lugar para la carne de cetáceo, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. La principal ventaja de esta técnica es que un resultado exitoso puede observarse directamente entre cinco y diez minutos después de homogeneizar 0,3 gramos de músculo, con una especificidad y sensibilidad notables.Por lo tanto, este método puede proporcionar una detección rápida de carne de cetáceo en el campo. También puede aplicarse a otras carnes, como carne de caballo o de cerdo. Para diseñar péptidos sintéticos destinados a generar anticuerpos monoclonales con reactividad frente a la mioglobina de cetáceos, se analizan las secuencias de aminoácidos de las regiones antigénicas reactivas de la mioglobina de diversos animales.Comience recuperando de GenBank las secuencias de aminoácidos de mioglobina de atún, pollo, avestruz, mamíferos domésticos, foca y 18 especies de cetáceos. A continuación, alinee las secuencias utilizando el software adecuado. Inicie el Explorador de Alineamiento seleccionando Alinear Editar/Construir Alineamiento en la barra de inicio.Seleccione Crear nueva alineación y haga clic en Aceptar. Aparecerá un cuadro de diálogo que preguntará: ¿está creando un alineamiento de secuencia de ADN o de proteína? Haga clic en el botón etiquetado como Proteína, seleccione Datos Abrir Recuperar secuencias desde archivo y seleccione el archivo de secuencia. Seleccione el comando de menú Editar Seleccionar todo para seleccionar todos los sitios de cada secuencia en el conjunto de datos con el fin de crear un alineamiento múltiple de secuencias.Seleccione Alineamiento Alinear por ClustalW en el menú principal. Seleccione BLOSUM como matriz de pesos para proteínas y luego haga clic en el botón Aceptar. El tercer paso consiste en analizar el alineamiento de secuencias.Enfóquese en cinco sitios reactivos antigénicos y encuentre el fragmento conservado entre los cetáceos. Un asterisco simboliza el consenso en el alineamiento e indica una posición que tiene un residuo único y completamente conservado. Se encontraron dos fragmentos conservados en los cetáceos.Los fragmentos de secuencia candidatos se sintetizan luego y se utilizan para generar anticuerpos monoclonales. Comience este procedimiento determinando el pH óptimo para la solución de oro coloidal, definido como el pH mínimo que mantiene la mezcla de anticuerpo monoclonal y solución de oro coloidal de color rojo durante dos horas. Añada 0,15 microgramos de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de cinco a nueve.Para los fines de esta demostración, se ensayaron los valores de pH seis y pH ocho. El pH ocho se consideró el valor óptimo en este paso de optimización. A continuación, determine la concentración óptima del anticuerpo monoclonal añadiendo diversas cantidades de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución coloidal de oro a pH ocho.La concentración óptima, que en este estudio es de seis microgramos por mililitro, mantendrá el color de la mezcla rojo sin precipitado negro. Basándose en los resultados de los pasos de optimización, agregue 60 microgramos del anticuerpo monoclonal detector purificado gota a gota a 10 mL de solución coloidal de oro. Emulsione suavemente la mezcla a temperatura ambiente durante diez minutos.Agregue dos mililitros de una solución de BSA al 5 % en PBS a la mezcla y emulsione suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos para reducir la interferencia de fondo. Centrifugue la mezcla a 10 000 ×g durante 30 minutos a cuatro grados Celsius. Después de la centrifugación, retire cuidadosamente el sobrenadante con el anticuerpo no conjugado y suspenda el precipitado resultante en 4 mL de PBS-T que contenga BSA al 1 % y Tween-20 al 0,1 %.Repita la centrifugación y la suspensión una o dos veces. Suspenda los precipitados finales en 1 mL de PBS-T y almacénelos a cuatro grados Celsius hasta su uso. A continuación se muestra un gráfico del diseño de la tira inmunológica.Las dimensiones del cartón, las almohadillas y la membrana de nitrocelulosa se indican en el texto del protocolo. Para prolongar la vida útil del almacenamiento, las tiras inmunes deben prepararse y ensamblarse en condiciones ambientales de laboratorio con baja humedad. Utilice una micropipeta para agregar la solución de anticuerpo monoclonal marcado con oro coloidal a la almohadilla de conjugado hasta saturarla, y luego seque la almohadilla a 37 grados Celsius durante una hora antes del ensamblaje.Una vez que la almohadilla de conjugado esté seca, utilice cinta adhesiva de doble cara para pegar primero la membrana de nitrocelulosa sobre el cartón. Mediante una impresora de tiras inmunológicas, distribuya el anticuerpo monoclonal específico para la captura del antígeno y el anticuerpo anti-IgG de ratón rápido en la zona de prueba y la zona de control, respectivamente, sobre la membrana de nitrocelulosa. Mantenga una distancia mayor a cinco milímetros entre las dos zonas.Luego, pegue la almohadilla de conjugado en un lado de la membrana de nitrocelulosa y la almohadilla absorbente en el otro lado, superponiendo las almohadillas en cada lado aproximadamente dos milímetros. Coloque la almohadilla de muestra sobre la almohadilla de conjugado dos milímetros y péguela en el cartón. Utilice una cortadora de papel para crear tiras de seis milímetros de ancho.Empaquete las tiras en una bolsa de papel de aluminio con un agente desecante y almacénelas a cuatro grados Celsius hasta su uso. Para preparar una muestra para la prueba de reactividad cruzada, agregue 1 mL de PBS que contenga 0,1 % de BSA a 0,03 gramos de músculo crudo. Y utilice un palillo de bambú o una varilla de molienda para homogenizar la muestra.Sujete la tira inmunológica por el extremo opuesto al área de prueba y sumerja la parte de la almohadilla de muestra en el espécimen durante cinco a diez minutos. Observe el resultado directamente. Pruebe varias muestras de músculo por triplicado.La línea de prueba T está diseñada para mostrar una señal positiva cuando ambos anticuerpos monoclonales detectan mioglobina de cetáceos. Dado que la mioglobina de animales no cetáceos solo puede ser detectada por uno de estos dos anticuerpos monoclonales, la línea de prueba muestra un resultado negativo cuando se analizan muestras musculares de otros animales. La línea de control C siempre debe mostrar un resultado positivo porque el anticuerpo rápido anti-IGG de ratón se une al anticuerpo de detección marcado con oro coloidal.Un resultado negativo en la línea de control indica que la calidad de los materiales en la tira es deficiente. El análisis de sangre mediante Western con sobrenadantes de hibridoma muestra que el anticuerpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una única banda teñida con un peso molecular predicho de aproximadamente 17kDa. La ballena jorobada común muestra una banda comparativamente más débil que las de otros cetáceos.No se observan bandas para atún, sardina y pollo. Mientras que para cerdo se observa una banda de aproximadamente 50 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante análisis de sangre en punto.Aunque el análisis sanguíneo por Western con el anticuerpo monoclonal CSF1H13 muestra múltiples bandas inespecíficas para cerdo y atún, CSF1H13 es altamente específico porque reacciona únicamente con cetáceos. Y la foca presenta una banda en el peso molecular predicho de aproximadamente 17 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante el análisis sanguíneo por punto.Los resultados de ELISA indirecto de extractos musculares de diferentes especies utilizando CGF5H9 purificado muestran señales positivas para vaca, cabra, perro, conejo y cetáceos, una señal positiva débil para cerdo, y señales negativas para atún, pollo y foca. CSF1H13 muestra alta afinidad hacia los cetáceos y las focas. Ambos anticuerpos monoclonales pueden reaccionar fuertemente con las cuatro especies de cetáceos, que pertenecen a diferentes familias, lo que indica su amplia reactividad frente a diversas especies de cetáceos.La especificidad de la tira inmunológica de oro coloidal se muestra en estos resultados representativos. El uso de muestras de músculo no provenientes de cetáceos da como resultado una única banda en la línea de control. Sin embargo, cuando se utilizan muestras de músculo de cetáceos, las bandas de señal están presentes tanto en la línea de prueba como en la línea de control.Una vez dominada, la preparación de anticuerpos marcados y la construcción de tiras puede realizarse en cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseñar cuidadosamente el péptido. Utilice varios métodos para seleccionar anticuerpos monoclonales adecuados.Y utilice una coloidal de oro de alta calidad para preparar anticuerpos marcados. Tras seguir estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos como el análisis de ADN basado en PCR para responder preguntas adicionales, como la especie de cetáceo y su procedencia. El anticuerpo monoclonal CSF1H13, que es potente y exhibe afinidad únicamente hacia mamíferos marinos, puede emplearse en diversos formatos de ELISA que ofrecen muchas otras oportunidades para estudiar los aspectos biológicos, fisiológicos y químicos de la mioglobina en mamíferos marinos.Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar anticuerpos monoclonales específicos y aplicarlos posteriormente en una tira de prueba rápida.

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En este video, demostramos la inmunotinción con oro de biomarcadores localizados dentro de la región lumínica de secciones exosomales ultrafinas. Esta técnica permite el diagnóstico precoz de enfermedades mediante la visualización de las moléculas diana dentro de los exosomas secretados por las células enfermas.

Inmunotinción con oro de secciones exosómicas: una técnica para visualizar marcadores de diagnóstico en la luz exosomal

En este video, describimos el método de inmunoensayo directo basado en espectroscopia Raman para detectar antígenos objetivo específicos. Los anticuerpos, que se adsorben en la superficie de las nanopartículas de oro unidas a las sondas Raman, interactúan con los antígenos objetivo y producen un espectro Raman específico, que posteriormente se detecta.

Un inmunoensayo directo basado en espectroscopia Raman para detectar un antígeno específico

Este video muestra un protocolo de inmunoensayo de electroforesis capilar para detectar un biomarcador de proteínas asociado con la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) a partir de plaquetas de la sangre humana. La confirmación de la presencia de la proteína biomarcador de ELA se logra mediante la separación basada en el tamaño de las proteínas plaquetarias seguida de una detección quimioluminiscente.

Un inmunoensayo de electroforesis capilar para la detección de biomarcadores de proteínas

Biomarcadores de medición en muestras biológicas complejas es cada vez guían la toma de decisiones clínicas. Se describe un método altamente sensible para medir simultáneamente la miosina cardíaca proteína de unión-C, creatina quinasa MB, troponina I cardiaca y en muestras de suero de pacientes con infarto de miocardio y los sujetos de control sanos.

Un método de cuantificación sensible y específica para la determinación de suero miosina cardíaca proteína de unión-C por inmunoensayo electroquimioluminiscencia

Se proporciona un protocolo para seleccionar aptámeros de conmutación de estructura para objetivos de moléculas pequeñas basado en un método de selección de perlas magnéticas de rigurosidad sintonizable. Los aptámeros seleccionados con propiedades de cambio de estructura son beneficiosos para los ensayos que requieren un cambio conformacional para señalar la presencia de un objetivo, como el ensayo de nanopartículas de oro descrito.

Un método para la selección de aptámeros Estructura de conmutación Aplicado a una de nanopartículas de oro ensayo colorimétrico

El diseño y desarrollo de un ensayo colorimétrico de nanopartículas aptámero-oro para la detección de moléculas pequeñas para aplicaciones en-el-campo se examinó. Además, una aplicación colorimétrico smart-dispositivo (app) fue validado y se estableció el almacenamiento a largo plazo del ensayo para uso en el campo.

Diseño y Desarrollo de aptámeros y oro nanopartículas basados ​​en ensayos colorimétricos para aplicaciones en-el-campo

Las sondas ópticas basadas en nanopartículas han sido diseñadas como un vehículo para la detección de antígenos utilizando espectroscopía Raman y UV-Vis. Aquí describimos un protocolo para preparar dichas sondas para un inmunoensayo de espectroscopía UV-Vis/Raman de tal manera que incorporen futuras capacidades de multiplexación.

La fabricación de un UV-Vis y espectroscopia Raman Plataforma de Inmunoensayo

Se presenta un protocolo para localizar Ag en tejidos de hígado y riñón cetáceos por autometallography. Además, un nuevo ensayo, llamado el análisis histológico cetáceo de Ag (CHAA) es desarrollado para estimar las concentraciones de Ag en los tejidos.

Uso de Autometallography para localizar y plata semi-cuantificar en cetáceos tejidos

Membrane-based lateral flow immunochromatographic strips (ICSs) are useful tools for low-cost self-diagnosis and have been efficiently applied to toxin, ...

Desarrollo de una tira inmunocromatográfica de flujo lateral para la detección rápida y cuantitativa de compuestos de moléculas pequeñas

Describimos una plataforma de inmunoensayo recientemente desarrollada basada en los principios de la biología sintética libre de células y la técnica dot-blot para la detección personalizable de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales.

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Aprende a desarrollar una tira de prueba inmunocromatográfica con oro coloidal para detectar mioglobina de cetáceos. Este método permite un cribado rápido en campo para prevenir el comercio ilegal de carne de ballena con alta especificidad.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

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