Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

El objetivo general de esta tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal es diferenciar la mioglobina de los cetáceos de la de las focas y otros animales. Este método puede proporcionar un cribado rápido e in situ de la carne de cetáceos, restringiendo así su comercio y consumo ilegales. La principal ventaja de esta técnica es que se puede observar un resultado exitoso directamente en cinco a diez minutos después de homogeneizar 03 gramos de músculo, con una especificidad y sensibilidad sobresalientes.

Por lo tanto, este método puede proporcionar una detección rápida de carne de cetáceo en el campo. También se puede aplicar a otras carnes como la carne de caballo o cerdo. Con el fin de diseñar péptidos sintéticos para la generación de anticuerpos monoclonales con reactividad hacia la mioglobina de cetáceos, se analizan las secuencias de aminoácidos de las regiones reactivas antigénicas de mioglobina de diversos animales.

Comience recuperando de GenBank las secuencias de aminoácidos de la mioglobina del atún, el pollo, el avestruz, los mamíferos domésticos, la foca y 18 especies de cetáceos. A continuación, alinee las secuencias utilizando el software adecuado. Inicie el Explorador de alineación seleccionando Alinear, Editar/Construir alineación en la barra de inicio.

Seleccione Crear nueva alineación y haga clic en Aceptar. Aparecerá un cuadro de diálogo preguntando, ¿está construyendo una alineación de secuencia de ADN o proteína? Haga clic en el botón con la etiqueta Proteína, seleccione Abrir datos Recuperar secuencias de archivo y seleccione archivo de secuencia. Seleccione el comando de menú Editar Seleccionar todo para seleccionar todos los emplazamientos de cada secuencia del conjunto de datos para crear una alineación de secuencia múltiple.

Seleccione Alineación Alinear por ClustalW en el menú principal. Seleccione BLOSUM como matriz de peso de proteína y, a continuación, haga clic en el botón Aceptar. El tercer paso es analizar la alineación de la secuencia.

Concéntrese en cinco sitios antigénicos reactivos y encuentre el fragmento conservado entre los cetáceos. Un asterisco simboliza el consenso en la alineación e indica una posición que tiene un único residuo totalmente conservado. Se encontraron dos fragmentos conservados en cetáceos.

A continuación, se sintetizan fragmentos de secuencia candidatos y se utilizan para generar anticuerpos monoclonales. Comience este procedimiento determinando el pH óptimo para la solución de oro coloidal, definido como el pH mínimo que mantiene el anticuerpo monoclonal y la mezcla de solución de oro coloidal de color rojo durante dos horas. Añadir 0,15 microgramos de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución de oro coloidal con valores de pH que varían de cinco a nueve.

A los efectos de esta demostración, se ensayan pH seis y pH ocho, y se consideró que el pH ocho era el óptimo en este paso de optimización. A continuación, determine la concentración óptima del anticuerpo monoclonal añadiendo varias cantidades de anticuerpo monoclonal de detección purificado a 100 microlitros de solución de oro coloidal a pH ocho.

La concentración óptima, que es de seis microgramos por mililitro en este estudio, mantendrá el color de la mezcla rojo sin precipitado negro. En función de los resultados de los pasos de optimización, agregue 60 microgramos de anticuerpo monoclonal de detección purificado gota a gota a 10 ml de solución de oro coloidal. Emulsionar la mezcla suavemente a temperatura ambiente durante diez minutos.

Agregue dos mililitros de una solución de BSA al 5% en PBS a la mezcla y emulsione suavemente a temperatura ambiente durante 15 minutos para reducir la interferencia de fondo. Centrifugar la mezcla a 10.000 veces g durante 30 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, retire con cuidado el sobrenadante con anticuerpo no conjugado y suspenda el pellet resultante en 4 ml de PBS-T que contiene 1 % de BSA y 0,1 % de Tween-20.

Repita la centrifugación y la suspensión una o dos veces. Suspender los precipitados finales en 1mL de PBS-T y almacenar a cuatro grados centígrados hasta su uso. Aquí se muestra un gráfico del diseño de la tira inmunológica.

Las dimensiones del cartón, las almohadillas y la membrana de nitrocelulosa se enumeran en el texto del protocolo. Para prolongar la vida útil del almacenamiento, las tiras inmunes deben prepararse y ensamblarse en condiciones ambientales de laboratorio de baja humedad. Utilice una micropipeta para añadir la solución de anticuerpos monoclonales marcados con oro coloidal a la almohadilla conjugada para saturarla y, a continuación, seque la almohadilla a 37 grados centígrados durante una hora antes de montarla.

Una vez que la almohadilla conjugada esté seca, use cinta adhesiva de doble cara para pegar primero la membrana de nitrocelulosa sobre el cartón. Utilizando una impresora de inmunostrip, distribuya el anticuerpo monoclonal capturador de antígeno específico y el IGG rápido anti-ratón en la zona de prueba y la zona de control, respectivamente, en la membrana de nitrocelulosa. Mantenga una distancia de más de cinco milímetros entre las dos zonas.

Luego pegue la almohadilla conjugada en un lado de la membrana de nitrocelulosa y la almohadilla absorbente en el otro lado, superponiendo las almohadillas de cada lado por unos dos milímetros. Coloque la almohadilla de muestra sobre la almohadilla conjugada por dos milímetros y péguela en el cartón. Usa un cortador de papel para crear tiras de seis milímetros de ancho.

Empaque las tiras en una bolsa de papel de aluminio con desecante y guárdelas a cuatro grados centígrados hasta su uso. Para preparar una muestra para la prueba de reactividad cruzada, agregue 1 ml de PBS que contenga 0.1% de BSA a 0.03 gramos de músculo bruto. Y use un palo de bambú o una varilla de molienda para homogeneizar la muestra.

Sostenga la tira inmune por el extremo opuesto al área de prueba y sumerja la parte de la almohadilla de muestra en la muestra durante cinco a diez minutos. Observa el resultado directamente. Pruebe varias muestras de músculo por triplicado.

La línea de prueba T está diseñada para mostrar una señal positiva cuando ambos anticuerpos monoclonales detectan mioglobina de cetáceos. Debido a que la mioglobina de animales no cetáceos solo puede ser detectada por uno de estos dos anticuerpos monoclonales, la línea de prueba muestra un resultado negativo cuando se analizan muestras de músculo de otros animales. La línea de control C siempre debe mostrar un resultado positivo porque el IGG anti-ratón rápido se une al anticuerpo de detección marcado con oro coloidal.

Un resultado fallido en la línea de control indica que la calidad de los materiales en la tira es mala. El análisis de sangre occidental con sobrenadantes de hibridoma muestra que el anticuerpo monoclonal CGF5H9 detecta cetáceos y otros mamíferos como una sola banda teñida con un peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. La ballena minke común muestra una banda comparativamente más débil que las bandas de otros cetáceos.

Las bandas están ausentes para el atún, la foca y el pollo. Mientras que para el cerdo se observa una banda de unos 50 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante análisis de sangre en puntos.

Aunque el análisis de sangre occidental que utiliza el anticuerpo monoclonal CSF1H13 muestra múltiples bandas inespecíficas para el cerdo y el atún, CSF1H13 es muy específico porque solo reacciona con los cetáceos. Y el sello tiene una banda con un peso molecular previsto de aproximadamente 17 kDa. Se obtienen resultados idénticos mediante análisis de sangre en puntos.

Los resultados del ELISA indirecto de extractos musculares de diferentes especies utilizando CGF5H9 purificado demuestran señales positivas para vacas, cabras, perros, conejos y cetáceos, una señal positiva débil para el cerdo y señales negativas para el atún, el pollo y la foca. CSF1H13 muestra una gran afinidad hacia los cetáceos y las focas. Ambos anticuerpos monoclonales pueden reaccionar fuertemente con las cuatro especies de cetáceos que pertenecen a diferentes familias, lo que indica su amplia reactividad a diversas especies de cetáceos.

La especificidad de la tira de oro coloidal inmune se muestra en estos resultados representativos. El uso de muestras de músculo no cetáceo da como resultado una sola banda en la línea de control. Sin embargo, cuando se utilizan muestras de músculo de cetáceo, las bandas de señal están presentes tanto en la línea de prueba como en la línea de control.

Una vez dominado, la preparación de los anticuerpos marcados y esta construcción de tiras se puede hacer en cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar diseñar el péptido con cuidado. Utilizar varios métodos para la detección de anticuerpos monoclonales adecuados.

Y use una alta calidad de oro coloidal para preparar anticuerpos marcados. Siguiendo estos procedimientos, se pueden realizar otros métodos, como el análisis de ADN basado en PCR, para responder preguntas adicionales, como la especie de cetáceo y de dónde proviene. El CSF1H13 anticuerpo monoclonal, que es fuerte y muestra una afinidad solo hacia los mamíferos marinos, se puede emplear en varios formatos de ELISA que ofrecen muchas otras oportunidades para estudiar los aspectos biológicos, fisiológicos y químicos de la mioglobina en los mamíferos marinos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo desarrollar anticuerpos monoclonales específicos y posteriormente aplicarlos en tiras reactivas rápidas.