Imágenes simultáneas en vivo de múltiples embriones de insectos en microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámaras de muestra

Los microscopios de fluorescencia de hoja de luz basados en cámara de muestra están diseñados para un alto contenido en lugar de un alto rendimiento. Por lo tanto, los ensayos de imagen en vivo deben realizarse secuencialmente y, por lo tanto, deben verse menos afectados por la variación ambiental. Nuestro soporte de telaraña permite el apilamiento y la obtención simultánea de imágenes de múltiples embriones, eliminando la variación ambiental y aumentando el rendimiento.

El montaje de embriones en el soporte de telarañas requiere cierta delicadeza. Un vídeo explicativo es ideal para ilustrar la secuencia de los numerosos gestos cortos de conducta. Para la calibración del microscopio de fluorescencia basado en cámara de muestras de lámina de luz.

Primero, relicuar una alícuota de agarosa en un mezclador calentador de bloque seco a 80 grados centígrados. Deje que la agarosa derretida se enfríe a 35 grados centígrados y transfiera 50 microlitros de la agarosa a un tubo de reacción de 1,5 mililitros. Mezcle 0,5 microlitros de solución de microesferas fluorescentes con la agarosa a 1.400 revoluciones por minuto durante un minuto y llene el orificio ranurado del soporte de telarañas con 10 microlitros de la mezcla de solución de microesferas fluorescentes de agarosa.

Aspire la mayor cantidad de agarosa posible hasta que solo quede una película delgada de agarosa y deje que la agarosa se solidifique durante 30 a 60 segundos. Llene la cámara de muestras con agua del grifo esterilizada en autoclave e inserte lentamente el soporte de telarañas en la cámara de muestras. Mueva el orificio ranurado frente a la lente de detección y gire el soporte a una posición de 45 grados en relación con los ejes de iluminación y detección.

El soporte de telaraña no debe ser visible en el canal de luz de transmisión. Cambie al canal de fluorescencia apropiado y ajuste la potencia del láser y el tiempo de exposición, de modo que las microesferas fluorescentes proporcionen una señal adecuada. Especifique un volumen de visión que cubra completamente la película de agarosa ahora orientada transversalmente y calcule la resolución axial máxima posible para la combinación respectiva de iluminación y lente de detección para definir el espaciado Z.

A continuación, registre una pila Z de prueba tridimensional de las microesferas fluorescentes y compare las proyecciones máximas X, Y y Z con la tabla de calibración. Si las microesferas aparecen borrosas, borrosas y/o distorsionadas. Ajuste las posiciones de las lentes de iluminación y/o detección.

Para la descorionación del embrión, agregue ocho mililitros de agua del grifo esterilizada en autoclave en los pocillos A1, A2, A3 y B3 de una placa de seis pocillos por línea. Luego, agregue siete mililitros de agua del grifo esterilizada en autoclave y un mililitro de solución de hipoclorito de sodio en los pozos B1 y B2. Coloque la primera placa bajo un microscopio estereoscópico e inserte el primer embrión que contiene el filtro de células en el pocillo A1.

Lavar los embriones con una agitación suave durante 30 a 60 segundos, antes de mover el colador al pocillo B1. Agite el plato vigorosamente durante 30 segundos, antes de transferir el colador al pozo A2. Lave los embriones durante un minuto con una agitación suave y mueva el colador hacia el pozo B2 para agitar vigorosamente hasta que la mayoría de los embriones estén completamente descorionados.

A continuación, transfiera el filtro al pocillo A3 durante un minuto de lavado suave, antes de almacenar el colador de embriones decorionados en el pocillo B3 hasta que los embriones de otras líneas hayan sido tratados como se ha demostrado. Para montar los embriones en el soporte de telarañas, relicuar otra alícuota de agarosa como se ha demostrado. Cuando la agarosa se haya enfriado, coloque el soporte de telaraña debajo del microscopio estereoscópico y agregue 10 microlitros de agarosa en el orificio ranurado.

Utilice la punta de la pipeta para esparcir la agarosa sobre el orificio ranurado, antes de aspirar la mayor cantidad de agarosa posible hasta que solo quede una fina película de agarosa. Cuando la agarosa se haya solidificado, use un pincel para recoger y transferir cuidadosamente los embriones a la película de agarosa. Colóquelos a lo largo del eje largo del orificio ranurado con sus ejes antero-posteriores alineados con el eje largo del orificio ranurado.

Para estabilizar los embriones, pipetee cuidadosamente uno o dos microlitros de agarosa en el espacio entre los embriones y la película de agarosa. Cuando la agarosa se haya solidificado, inserte lentamente el soporte de telaraña con los embriones montados en la cámara de muestras llena de tampón de imagen. Para obtener imágenes de los embriones, confirme que el soporte de telaraña esté en una posición de 45 grados en relación con los ejes de iluminación y detección y en el canal de luz de transmisión, mueva el embrión al centro del campo de visión.

El soporte de telaraña no debe ser visible. A continuación, mueva el embrión con la etapa de micro traducción en Z hasta que el plano medio del embrión se superponga con el plano focal y el contorno aparezca nítido. Sin cambiar al canal de fluorescencia, mueva el embrión 250 micras en ambas direcciones para especificar el volumen de la vista.

Si se requieren imágenes a lo largo de múltiples direcciones, gire el embrión de manera adecuada, enfoque el embrión y especifique el volumen de la vista como se acaba de demostrar. Luego, repita este procedimiento para todos los demás embriones montados. Cuando se haya especificado el volumen de vista para todos los embriones, defina el canal de fluorescencia y los parámetros de lapso de tiempo e inicie el proceso de imagen.

Para ensayos que duran varios días, considere cubrir la abertura de la cámara de muestras al menos parcialmente para reducir la evaporación. Una vez finalizado el ensayo de diagnóstico por imágenes, retire con cuidado el soporte de telarañas de la cámara de muestras y utilice un pincel pequeño para separar los embriones de la película de agarosa y colocarlos en un portaobjetos de microscopio debidamente etiquetado. Coloque el portaobjetos en un plato de recuperación para la incubación en las condiciones de cría estándar adecuadas.

A medida que se acerca el momento de la eclosión, revise las placas de recuperación con frecuencia y transfiera las larvas eclosionadas a pocillos individuales de una placa de 24 pocillos. Llene los pozos hasta la mitad con el medio de crecimiento apropiado, luego incube las larvas en las condiciones de cría estándar adecuadas. Cuando los individuos observados alcancen la edad adulta, proporcione parejas de apareamiento adecuadas y verifique si hay progenie después de varios días.

En este video, se puede observar la dinámica de la señal fluorescente de tres embriones derivados de diferentes líneas transgénicas de Drosophila durante un período de aproximadamente un día. Se esperaba un patrón de fluorescencia similar, ya que todas las líneas expresaban EGFP nuclear localizado bajo el control de promotores presumiblemente ubicuos y constituyentemente activos. Sin embargo, los resultados comparativos de imágenes en vivo revelaron fuertes diferencias espacio-temporales en los patrones de expresión que no fueron efectos secundarios debidos a la varianza ambiental.

En este análisis de tres embriones de Tribolium portadores del mismo transgén a cuestas. Los resultados comparativos de imágenes en vivo del proceso de cierre de la ventana serosa durante la gastrulación sugieren que la segunda sublínea proporciona una señal general notablemente más fuerte que las otras dos sublíneas. Como indican estos datos, el contexto genómico también puede tener una fuerte influencia en el nivel de expresión de los transgenes en Tribolium.

Nuestro enfoque es muy adecuado para analizar los fenotipos knockdown y knockout, ya que permite obtener imágenes simultáneas de embriones de control de tipo salvaje. Nuestro protocolo también se puede utilizar para comparar la morfogénesis de dos o más especies de insectos. Y así, obtener una visión más profunda de la evolución del desarrollo.