Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente
24 de enero de 2017
Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.
El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método simple para medir simultáneamente la absorción de calcio mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial en células vivas utilizando microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo mitocondrial, como cómo las mitocondrias actúan como reservas locales de calcio para regular estrictamente la concentración de calcio intracelular. La principal ventaja de esta técnica es que tanto el calcio mitocondrial como el potencial de membrana mitocondrial se pueden medir específicamente de forma simultánea en células vivas sin necesidad de manipulación genética.
Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del calcio en la patología de la enfermedad mitocondrial, también se puede utilizar para estudiar otras afecciones degenerativas más recientes, cuando la regulación del calcio urinario es crucial. En este procedimiento, cultive las células en placas de cultivo celular de diez centímetros, o matraces de 75 centímetros cuadrados, en medios de cultivo a 37 grados centígrados durante 24 horas. Para recolectar las células, retire los medios por aspiración y lave las células con cinco mililitros de PBS.
Después, retire el PBS por aspiración. A continuación, añade 1,5 mililitros de tripsina EDTA e incuba las células a 37 grados centígrados durante 2 minutos. A continuación, golpee suavemente el plato para eliminar las células.
Volver a suspenderlos en cinco mililitros de medio de cultivo. Después, cuente las células con un hemocitómetro. El día antes de la toma de imágenes confocal, coloque las células con una confluencia del 60 al 70 por ciento en placas o cubreobjetos con cámaras.
Luego incube las células durante la noche a 37 grados centígrados para permitir que las células se adhieran y se recuperen. En este procedimiento, prepare la solución de tinción de registros con TMRM, Fluo 4 AM y surfactante. Retire el medio de cultivo y lave las células con 100 microlitros de PBS.
A continuación, retire el PBS e incube las células en 100 microlitros de solución de tinción de registro durante 45 minutos a temperatura ambiente. A continuación, retire la solución de tinción récord y lave las células con 100 microlitros de HBSS sin calcio para eliminar el exceso de Fluo 4 AM y TMRM. A continuación, prepare la solución de imagen intracelular con digitonina, TMRM y thapsigargina.
A continuación, retire el HPSS sin calcio y añada 300 microlitros de solución de imagen IM a las células. Deje que las células se equilibren a temperatura ambiente durante diez minutos antes de obtener imágenes con las adiciones de cloruro de calcio. Utilice una potencia láser baja de aproximadamente el 5 por ciento para minimizar cualquier daño fotográfico a las células.
Utilice la configuración de los láseres del microscopio para los espectros de excitación y emisión de TMRM y Fluo 4 AM. Utilice una potencia láser baja de aproximadamente el cinco por ciento con alta ganancia para minimizar el fotodaño de las células. A continuación, configure el microscopio para escanear imágenes cada veinticinco segundos. Escanee las celdas durante diez minutos para establecer las lecturas de referencia para las señales TMRM y Fluo 4.
A continuación, detenga el escaneo de la imagen y añada 3 microlitros de solución madre de cloruro de calcio de 40 milimolares directamente a las células en 300 microlitros de solución de imagen IM. Mezclar suavemente con una pipeta. Al agregar solución de calcio a las células, tenga cuidado de no mover el plato en la platina del microscopio.
Continúe escaneando la imagen durante aproximadamente cuatro minutos. Luego, repita las adiciones de cloruro de calcio cada cuatro minutos hasta que se alcancen las señales deseadas de TMRM o Fluo 4, generalmente alrededor de ocho a diez adiciones. Posteriormente, agregue una dilución de 1 a 100 de un milimolar de FCCP directamente a las células para disipar el potencial de membrana interna.
A continuación, tome imágenes de las células durante otros cinco minutos antes de que finalice el experimento. Una vez completadas las imágenes, determine la intensidad de las señales Fluo 4 y TMRM utilizando el software de análisis de imágenes. Para ello, abra la imagen, haga clic en la herramienta de selección y seleccione una región de interés que contenga mitocondrias.
Se pueden seleccionar varias regiones de interés para la medición abriendo Analizar, Herramientas, Administrador de ROI. Haga clic en Agregar para incluir el ROI seleccionado para la medición de intensidad. Repita los pasos anteriores hasta que se hayan agregado todos los ROI al administrador de ROI.
Mida la intensidad fluorescente promedio de las señales TMRM y Fluo 4 para cada región de interés seleccionando la función de medición más múltiple. Asegúrese de que la opción Medir todos los sectores esté seleccionada y que la opción Una fila por sector no esté seleccionada. A continuación, haga clic en Aceptar para obtener una tabla de la intensidad fluorescente media de las señales TMRM y Fluo 4 para cada ROI en cada punto de tiempo.
A continuación, combine los datos para calcular la intensidad media y la desviación estándar de las señales TMRM y Fluo 4. En este experimento, las células 143B fueron precargadas con Fluo 4 AM y TMRM antes de la permeabilización con digitonina. Después de cada adición de cloruro de calcio, la señal TMRM disminuye a medida que la afluencia de iones de calcio a las mitocondrias disipa el potencial de membrana mitocondrial.
Un pequeño potencial de membrana es evidente después de la transición de permeabilidad, ya que la adición de FCCP de 10 micromolares todavía induce un colapso del potencial de membrana. Aquí, la concentración de calcio mitocondrial, indicada por la señal Fluo 4, comienza a aumentar después de la segunda adición de cloruro de calcio cuando el calcio libre en el medio alcanza 0,32 micromolar. Cada adición posterior de cloruro de calcio provocó un aumento progresivo del calcio mitocondrial.
Aquí se muestran las imágenes de mediciones simultáneas del potencial de membrana en el calcio mitocondrial. La señal roja indica TMRM y la señal verde indica Fluo 4. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente dos horas si se realiza correctamente.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los niveles de calcio mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial simultáneamente en microscopía confocal utilizando la adición de calcio exógeno a las células permeabilizadas. No olvide que trabajar con FCCP y digitonina puede ser extremadamente peligroso, y siempre se deben tomar precauciones como el uso de EPP al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un método para medir la captación de calcio mitocondrial y el potencial de membrana en células vivas mediante microscopía confocal. La técnica permite a los investigadores explorar cómo las mitocondrias regulan las concentraciones intracelulares de calcio sin necesidad de manipulación genética.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Neurociencia
- Biología celular
- Investigación mitocondrial
Antecedentes
- Las mitocondrias desempeñan un papel crucial en la señalización del calcio.
- Comprender la función mitocondrial es importante para estudiar diversas enfermedades.
- La regulación del calcio es vital para la salud celular.
- Los métodos actuales a menudo requieren manipulación genética, lo que limita su aplicabilidad.
Objetivo del estudio
- Proporcionar un método sencillo para medir las funciones mitocondriales.
- Investigar el papel de las mitocondrias como almacenes locales de calcio.
- Facilitar la investigación sobre enfermedades mitocondriales y otras afecciones degenerativas.
Métodos Utilizados
- Las células se cultivan en medios apropiados a 37 grados Celsius.
- Las células se recolectan y se lavan con PBS.
- Se utilizan colorantes fluorescentes para medir la captación de calcio y el potencial de membrana.
- Se emplea microscopía confocal para mediciones simultáneas.
Resultados Principales
- El método permite la monitorización en tiempo real de la dinámica del calcio mitocondrial.
- Se logra la medición simultánea del calcio y del potencial de membrana.
- La técnica puede revelar información sobre la patología de las enfermedades mitocondriales.
- Se puede aplicar para estudiar otras condiciones relacionadas con la regulación del calcio.
Conclusiones
- Este método mejora la comprensión de las funciones mitocondriales en células vivas.
- Proporciona una herramienta para investigar el papel de las mitocondrias en la salud y la enfermedad.
- El enfoque es versátil para diversas aplicaciones de investigación en biología celular.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
Este método permite la medición directa de la dinámica del calcio mitocondrial y del potencial de membrana en células vivas, proporcionando datos fundamentales para la validación de dianas en las vías de disfunción mitocondrial. Al cuantificar la transición de permeabilidad inducida por calcio y la pérdida del potencial de membrana, apoya la reducción mecanicista de riesgos en hipótesis terapéuticas relacionadas con el fallo bioenergético. La lectura simultánea aumenta la confianza predictiva en las fases iniciales del descubrimiento, vinculando el flujo de calcio con la salud mitocondrial sin necesidad de manipulación genética.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Examina hipótesis terapéuticas sobre la regulación del calcio mitocondrial como regulador de la homeostasis celular del calcio.
- Valor operativo: Permite la validación funcional de dianas mitocondriales en células vivas mediante lecturas fluorescentes.
- Valor predictivo: Facilita la selección de carteras al identificar compuestos que modulan la transición de permeabilidad inducida por calcio.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Preparación del ensayo: Prepara células permeabilizadas con Fluo-4 AM y TMRM para la detección cuantitativa y simultánea de la captación de calcio y el potencial de membrana.
- Reproducibilidad: Utiliza adiciones secuenciales de cloruro de calcio para generar curvas de respuesta dosis-respuesta destinadas a la determinación del umbral de permeabilidad transitoria.
- Escalabilidad: Compatible con plataformas de microscopía confocal para adaptación a placas de múltiples pocillos y análisis de intensidad basado en regiones de interés (ROI).
Investigación Traslacional y Preclínica
- Relevancia para enfermedades: Modela la sobrecarga mitocondrial de calcio relacionada con la neurodegeneración y las lesiones isquémicas.
- Continuidad traslacional: Relaciona las mediciones agudas de flujo de calcio con la disfunción crónica en modelos preclínicos de enfermedades mitocondriales.
- Avance ajustado al riesgo: Proporciona información para decisiones de continuar o interrumpir basadas en la capacidad de retención de calcio y la estabilidad del potencial de membrana.
Integración de la tubería y flujo de trabajo
El método se encaja dentro del continuo de descubrimiento desde el acoplamiento al objetivo hasta la validación funcional, particularmente para vías que involucran la regulación del calcio mitocondrial y el estrés oxidativo.
- Biología del Descubrimiento: Evalúa cómo las perturbaciones afectan el amortiguamiento del calcio mitocondrial y el acoplamiento del potencial de membrana.
- Selección: Proporciona lecturas fluorescentes cuantitativas que permiten comparar los efectos de compuestos sobre la desolarización inducida por calcio.
- Análisis: Ofrece datos de intensidad media y desviación estándar para las señales de Fluo-4 y TMRM a lo largo de puntos temporales y regiones de interés (ROIs).
- Investigación Traducional: Conecta eventos agudos de transición de permeabilidad con fallos bioenergéticos sostenidos en modelos de enfermedad.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma de ensayo reutilizable para la farmacología de seguridad mitocondrial y la reducción de riesgos de dianas.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Reduce la ambigüedad mecanicista al correlacionar directamente la entrada de calcio con la disipación del potencial de membrana.
- Valor operativo: Estandariza la medición mediante el emparejamiento de colorantes ratiométricos y el desafío secuencial con calcio.
- Valor estratégico: Mejora la eficiencia del capital al identificar deficiencias mitocondriales en una etapa temprana de la optimización de fármacos prometedores.
- Impacto en la cartera: Permite la priorización ajustada al riesgo basada en la capacidad de retención de calcio y en la susceptibilidad a la transición de permeabilidad.
Consideraciones de Implementación
- Requiere experiencia en imágenes de células vivas, carga de colorantes y protocolos de permeabilización.
- Depende de microscopía confocal con ajustes láser adecuados para la excitación/emisión de TMRM y Fluo-4.
- Necesita la estandarización en la preparación de HBSS sin calcio y de la solución para imágenes intracelulares entre diferentes equipos.
- Incluye consideraciones de adaptación para distintos tipos celulares y densidades mitocondriales.
- Comprende limitaciones prácticas, como el riesgo de fototoxicidad por exposición al láser y la fuga de colorante tras la permeabilización.
