Name: Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 43 s
Description: Aprende a medir simultáneamente el calcio mitocondrial y el potencial de membrana en células vivas mediante microscopía confocal. Esta técnica permite estudiar la función mitocondrial sin manipulación genética.

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Se agradece al Dr. Kirstin Elgass y el Dr. Sarah Credo de Monash Micro Imaging para la asistencia técnica, y el Wellcome Trust y el Consejo de Investigación Médica del Reino Unido para el apoyo financiero. MMcK se apoya el Consejo de Investigación Australiano futuro Plan de Becas (FT120100459), la Fundación William Buckland, La fundación de la enfermedad mitocondrial australiano (AMDF), El Instituto de Investigación Médica de Hudson y de la Universidad de Monash. Este trabajo fue apoyado por el Plan de Apoyo a la infraestructura operativa del Gobierno de Victoria.

1. Preparación de las células <ol><li> Se cultivan las células en 10 cm placas de cultivo celular o 75 cm 2 frascos en medios de cultivo [10 ml de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) suplementado con 5% (v / v) de suero bovino fetal (FBS) y 1 x penicilina / estreptomicina (p / s )] a 37 ° C / 5% de CO 2. </li><li> Para cosechar las células, retirar el medio por aspiración, luego se lava con 5 ml de 1x tampón fosfato salino (PBS 1x). Eliminar 1x PBS por aspiración, a continuación, añadir 1,5 ml 0,25% (w / v) de tripsina / 0,25% (w / v) de ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) y se incuba a 37 ° C / 5% de CO2 durante 2 min. Toque plato o frasco suavemente para eliminar las células, a continuación, volver a suspender en medios de cultivo de 5 ml. </li><li> Recuento de células mediante la adición de 12 l de células resuspendidas en un hemocitómetro. </li><li> células de la placa en platos o cubreobjetos con cámaras de imagen confocal. NOTA: Estos tendrán un fondo de plástico o vidrio adecuado que ha sido diseñado para su uso con microscopios invertidos. </li><li> células de la placa por lo THen ~ se consigue 80% de confluencia en el día de obtención de imágenes. Por ejemplo, aproximadamente 2 x 10 4 células de osteosarcoma 143B se pueden sembrar en un pocillo de una una jornada de 8 así porta con cámara antes de exponer. </li><li> Se incuban las células durante la noche a 37 ° C / 5% de CO 2 para permitir que las células se unan y se recuperan. </li></ol> 2. Tampones para TMRM y Fluo-4 Imaging <ol><li> Preparar la solución de registro (RS) que contiene NaCl 156 mM, KCl 3 mM, 2 mM MgSO 4, 1,25 mM KH 2 PO 4, 10 mM D-glucosa, 2 mM CaCl 2 y HEPES 10 mM pH 7,35. RS almacenar en alícuotas a -20 ºC. </li><li> Preparar intracelular Medio (IM) que contiene NaCl 6 mM, KCl 130 mM, 7,8 mM MgCl 2, mM KH 2 PO 4, 0,4 mM CaCl 2, EGTA 2 mM, mM HEDTA 10, malato 2 mM, glutamato 1 mM 2, 2 mM ADP y HEPES 20 mM pH 7,1. 200 mM de soluciones stock de malato, glutamato y ADP se pueden preparar por separado, en alícuotas y se almacenaron a -20 ° C. estos stocks se pueden añadir a la IM justo antes del uso. </li><li> Ca solución de sal tamponada 2+ libre de Hank (HBSS) se puede obtener pre-preparado a partir de proveedores comerciales. Añadir ácido etilenglicol-bis (éter de β-aminoetil) -N, N, N &#39;, N&#39;-tetraacético (EGTA) a una concentración final de 500 mM. </li><li> Preparar una solución madre de 10 mM tetrametilrodamina, éster de metilo, perclorato (TMRM) en 100% de metanol. De esta población, hacer una reserva de trabajo de 2 M en H2O destilada </li><li> Preparar una solución madre de verapamilo 10 mM en 100% de etanol. </li><li> Preparar un 1 mg / ml (p / v) solución madre de éster Fluo-4 acetoximetil (Fluo-4 AM) en dimetilsulfóxido (DMSO). NOTA: Fluo-4 AM es un indicador de calcio que presenta una mayor fluorescencia tras la unión a Ca2 +. Fluo-4 es un análogo de fluo-3, con los dos sustituyentes de cloro reemplazado por átomos de flúor. Esto da como resultado un aumento de la excitación de fluorescencia a 488 nm y los niveles de señal de fluorescencia más altas. losgrupo éster AM resulta en una molécula sin carga Fluo-4 que puede penetrar en las membranas celulares. Una vez dentro de la célula, el éster AM se escinde por las esterasas no específicas, lo que resulta en una forma cargada de Fluo-4 que está atrapado dentro de la célula. </li><li> Preparar una solución madre de 1 mM carbonil cianuro de p-trifluoromethoxyphenylhydrazone (FCCP) en 100% de etanol. </li><li> Preparar una solución madre de 25 mg / ml (w / v) de digitonina en H2O destilada </li><li> Preparar una solución madre de 100 thapsigargin mu M en DMSO. </li><li> Preparar una solución madre de cloruro de calcio 40 mM (CaCl 2) en H2O destilada </li></ol> 3. La tinción de células con TMRM y Fluo-4, AM <ol><li> Preparar la solución RS tinción con 20 nM TMRM, 5 g / ml (w / v) Fluo-4, AM y 0,005% de tensioactivo tal como Pluronic F-127 en RS. NOTA: Este tensioactivo es un poliol no iónico que facilita la solubilización de Fluo-4, AM. Nota: 10 M verapamilo también se puede añadir a inhibit TMRM exportación por el transportador de múltiples fármacos membrana plasmática si se expresa en el tipo celular que se está analizando. </li><li> Retire el medio de cultivo de células con una pipeta y se lava con 100 l de PBS 1x. </li><li> Eliminar 1x PBS mediante una pipeta y se incuba células en solución de tinción RS 250 l durante 45 minutos a temperatura ambiente. NOTA: Una vez que el Fluo-4, AM entra en la célula, el éster AM se escinde por esterasas celulares. Incubando a temperatura ambiente inhibe la actividad de esterasa, permitiendo Fluo-4, AM para entrar en la mitocondria. </li><li> Retire la solución RS tinción mediante una pipeta y lavar las células en 100 l de Ca2 + libre de HBSS para eliminar el exceso de Fluo-4 AM y TMRM. </li><li> Preparar solución de imagen IM con 25 g / ml de digitonina (v / w), 200 nM y 1 TMRM thapsigargin mu M en IM. NOTA: puede ser necesario ajustar para asegurar que la permeabilización de la membrana interna mitocondrial no se produce la concentración de digitonina. Esto se puede determinar empíricamente mediante la evaluación de la intensidadde la señal de TMRM a diferentes concentraciones de digitonina. </li><li> Retire el Ca2 + libre de HBSS mediante una pipeta y añadir 300 l de solución de imagen IM a las células. Deja células que se equilibre a temperatura ambiente durante 10 min. Las células están listas para imágenes con CaCl 2 adiciones. </li></ol> 4. Cell Imaging <ol><li> Introducir la cápsula o cubreobjetos cámaras con células en solución de imágenes IM en un microscopio confocal de barrido láser invertida. </li><li> Utilice el ajuste de los láseres microscopio para detectar la excitación y espectros de emisión de TMRM y Fluo-4. Por ejemplo, utilice 543 nm de He-Ne y 473 líneas de láser de argón nm para excitar TMRM y Fluo-4, respectivamente. Utilice una fuente de láser de baja de aproximadamente 5% para reducir al mínimo cualquier foto-daño a las células. </li><li> Establecer microscopio para escanear imágenes cada 25 segundos. escaneo de células durante 10 minutos para establecer lecturas de referencia para el Fluo-4 señales y TMRM. NOTA: La señal de Fluo-4 puede ser débil o indetectable en la que descansa concent calcioraciones. </li><li> Añadir 3 l de CaCl 2 solución madre 40 mM directamente a las células en 300 l de solución de imágenes IM (una dilución 1: 100) y se mezcla suavemente con una pipeta. Una pausa en la exploración de la imagen, mientras que la adición y mezcla del CaCl2 si es necesario. NOTA: La concentración de iones Ca2 + libre final [Ca 2 +] en la solución de imagen IM puede calcularse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) o quelante 11. Una descripción detallada de cómo calcular la concentración de iones Ca2 + libre final de [Ca2 +] se describe en la sección 6 a continuación. </li><li> Continuar escaneado de imágenes por aproximadamente 4 minutos, y luego repetir CaCl 2 adiciones cada 4 minutos hasta que la TMRM deseado o Fluo-4 señales se alcanzan, por lo general alrededor de 8 a 10 adiciones. </li><li> Con una pipeta, añadir una dilución 1: 100 de FCCP 1 mM (c definitivaoncentración de 10 mM) directamente a las células para disipar ΔΨ m. celdas de imagen para otros 5 minutos. El experimento ha finalizado. </li></ol> Análisis 5. Imagen <ol><li> Una vez que se haya completado la imagen, determinar la intensidad de las señales de Fluo-4 y TMRM utilizando el software de análisis de imágenes, por ejemplo, software ImageJ con el plugin Bio-formatos (Descargar &#39;bioformats_package.jar&#39; de http://downloads.openmicroscopy.org/bio -formats / y guardarlo en el &quot;C: archivos de programa ImageJ plugins &#39;carpeta). </li><li> Abra el archivo de imagen (por ejemplo, un archivo de .oif) en ImageJ. Haga clic en la herramienta de selección y seleccionar una región de interés (ROI) que contiene mitocondrias. Utilice la señal de TMRM inicial para seleccionar el retorno de la inversión. </li><li> Abrir &#39;Análisis&gt; Herramientas&gt; Administrador de retorno de la inversión &quot;, haga clic en Añadir para incluir el ROI seleccionada para la medición de la intensidad. Varias regiones de interés pueden ser seleccionados en una sola imagen para la medición. Repita los pasos anteriores hasta que todos ROIs se han agregado al Administrador de retorno de la inversión. </li><li> Haga clic en &quot;Más&gt; Medida de múltiples &#39;, asegúrese de que« medida de todas las divisiones&#39; se selecciona y que &#39;una fila por rebanada&#39; no está seleccionada, haga clic en &#39;Aceptar&#39; para obtener una tabla de intensidad de fluorescencia media de las TMRM y Fluo-4 señales para cada ROI en cada punto de tiempo. </li><li> Utilizar los datos de todas las regiones de interés para calcular las intensidades promedio y desviación estándar para la TMRM y Fluo-4 señales. </li></ol> 6. Cálculo de la Concentración final libre de iones Ca2 + [Ca2 +] <ol><li> La concentración de iones Ca2 + libre de [Ca 2 +] en la solución de imagen IM puede determinarse utilizando software como Maxchelator WEBMAXC EXTENDIDO ( <a href="http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html">http://www.stanford.edu/%7Ecpatton/maxc.html</a> ) o quelante 11. Por ejemplo, establecer las variables en WEBMAXC amplía del modo siguiente: Temperatura = 24 ° C, pH = 7.1, La fuerza iónica = 0,162, EGTA = 0,002 M, HEDTA = 0,01 M, Ca 2+ = 0,0004 M y Mg 2+ = 0,0078 M. Esto resulta en una concentración de iones de Ca2 + libre final de [Ca2 +] de 62 nM . Tenga en cuenta que estos programas no pueden tener en cuenta todas las variables, tales como la pureza del reactivo, la precisión de las mediciones y la determinación del pH. El método más preciso para determinar la concentración de Ca2 + libre es el uso de un electrodo selectivo de Ca 2+ calibrada. </li></ol>

<ol><li>Szabadkai, G., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+the+hub+of+cellular+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: the hub of cellular Ca2+ signaling.</a> Physiology. 23, 84-94 (2008).</li>
<li>Jacobson, J., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interplay+between+mitochondria+and+cellular+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Interplay between mitochondria and cellular calcium signalling.</a> Mol. Cell. Biochem. 256-257, 209-218 (2004).</li>
<li>Bhosale, G., Sharpe, J. A., Sundier, S. Y., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+as+a+mediator+of+cell+energy+demand+and+a+trigger+to+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.+Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling as a mediator of cell energy demand and a trigger to cell.</a> Ann. N. Y. Acad. Sci. 1350, 107-116 (2015).</li>
<li>Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+calcium-dependent+neuronal+death+and+neurodegenerative+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Pflugers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondria calcium-dependent neuronal death and neurodegenerative disease.</a> Pflugers Arch. 464, 111-121 (2012).</li>
<li>Drummond, R. M., Mix, T. C., Tuft, R. A., Walsh, J. V., Fay, F. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+Ca2%2B+homeostasis+during+Ca2%2B+influx+and+Ca2%2B+release+in+gastric+myocytes+from+Bufo+marinus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial Ca2+ homeostasis during Ca2+ influx and Ca2+ release in gastric myocytes from Bufo marinus.</a> J. Physiol. 522, 375-390 (2000).</li>
<li>Hajnoczky, G., Robb-Gaspers, L. D., Seitz, M. B., Thomas, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decoding+of+cytosolic+calcium+oscillations+in+the+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Decoding of cytosolic calcium oscillations in the mitochondria.</a> Cell. 82, 415-424 (1995).</li>
<li>Davidson, S. M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22057570">Imaging mitochondrial calcium signalling with fluorescent probes and single or two photon confocal microscopy.</a> Methods Mol. Biol. 810, 219-234 (2012).</li>
<li>Pozzan, T., Rudolf, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19100709">Measurements of mitochondrial calcium in vivo.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1787, 1317-1323 (2009).</li>
<li>Rizzuto, R., Simpson, A. W., Brini, M., Pozzan, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+changes+of+mitochondrial+Ca2%2B+revealed+by+specifically+targeted+recombinant+aequorin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Rapid changes of mitochondrial Ca2+ revealed by specifically targeted recombinant aequorin.</a> Nature. 358, 325-327 (1992).</li>
<li>Pitter, J. G., Maechler, P., Wollheim, C. B., Spat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+respond+to+Ca2%2B+already+in+the+submicromolar+range%3A+correlation+with+redox+state%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondria respond to Ca2+ already in the submicromolar range: correlation with redox state.</a> Cell Calcium. 31, 97-104 (2002).</li>
<li>Schoenmakers, T. J., Visser, G. J., Flik, G., Theuvenet, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHELATOR%3A+an+improved+method+for+computing+metal+ion+concentrations+in+physiological+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22BioTechniques%22%5BJournal%5D)">CHELATOR: an improved method for computing metal ion concentrations in physiological solutions.</a> BioTechniques. 12, 870-879 (1992).</li>
<li>McKenzie, M., Duchen, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+Cellular+Bioenergetics+Causes+Mitochondrial+Calcium+Handling+Defects+in+MT-ND5+Mutant+Cybrids%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Impaired Cellular Bioenergetics Causes Mitochondrial Calcium Handling Defects in MT-ND5 Mutant Cybrids.</a> PLoS One. 11, e0154371(2016).</li>
<li>Berridge, M. J., Lipp, P., Bootman, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+versatility+and+universality+of+calcium+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Mol.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The versatility and universality of calcium signalling.</a> Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 1, 11-21 (2000).</li>
<li>Homolya, L., Hollo, Z., Germann, U. A., Pastan, I., Gottesman, M. M., Sarkadi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+cellular+indicators+are+extruded+by+the+multidrug+resistance+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Fluorescent cellular indicators are extruded by the multidrug resistance protein.</a> J. Biol. Chem. 268, 21493-21496 (1993).</li>
<li>Fujimoto, K., Chen, Y., Polonsky, K. S., Dorn, G. W. 2nd <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+cyclophilin+D+and+the+mitochondrial+permeability+transition+enhances+beta-cell+survival+and+prevents+diabetes+in+Pdx1+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting cyclophilin D and the mitochondrial permeability transition enhances beta-cell survival and prevents diabetes in Pdx1 deficiency.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107, 10214-10219 (2010).</li>
<li>Rao, V. K., Carlson, E. A., Yan, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+permeability+transition+pore+is+a+potential+drug+target+for+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim.+Biophys.+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial permeability transition pore is a potential drug target for neurodegeneration.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1842, 1267-1272 (2014).</li>
</ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

El calcio juega un papel fundamental en muchos procesos celulares, incluyendo la contracción muscular, la señalización neuronal y la proliferación celular 13. Los aumentos en las concentraciones de calcio de células se asocian a menudo con la demanda de energía, con el calcio capaz de estimular directamente la fosforilación oxidativa mitocondrial para aumentar la generación de ATP 3. Por tanto, es esencial que tengamos la capacidad de controlar con eficacia la acumulación ...

Las mitocondrias juegan un papel importante en la regulación de la concentración intracelular de Ca2 +, actuando como locales Ca 2 + buffers 1. Ca 2+ entra en la mitocondria a través de la uniporter Ca2 +, un proceso impulsado por el gradiente electroquímico que existe a través de la membrana interna mitocondrial (ΔΨ m) 2. Una vez dentro de la matriz mitocondrial, Ca 2+ puede activar la fosforilación oxidativa mediante la estimulación de tres deshidrogenasas limitantes de la velocidad del ciclo del ácido cítrico 3. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial. Si la concentración de Ca2 + dentro de las mitocondrias se vuelve muy alta, la transición de permeabilidad mitocondrial puede ser iniciado, dando lugar a la disipación de ΔΨ m, la cessation de la fosforilación oxidativa y la inducción de la muerte celular vías 4 de señalización. El importante papel que las mitocondrias desempeñan en el búfer espacial de calcio celular hace que la supervisión precisa de calcio mitocondrial crítica. Se han establecido varios métodos para controlar de calcio mitocondrial, incluyendo el uso de colorantes a base de rodamina. Uno de estos colorantes, Rhod-2, AM, es muy eficaz en la partición a la mitocondria para medir los niveles de Ca2 + mitocondrial 5, 6. Sin embargo, se debe tener cuidado ya que algunos de colorante se acumulará en otros orgánulos, tales como liposomas, o permanecer en el citosol de la célula. Sin embargo, los análisis posteriores se pueden emplear para distinguir estas señales a los de la mitocondria 7. Otra técnica para controlar de calcio mitocondrial utiliza reportero fluorescente construye 8 </s<html> arriba&gt;. El beneficio de estas sondas codificados genéticamente es que pueden ser dirigidos específicamente a la mitocondria mediante el uso de péptidos endógenos N-terminal, por ejemplo, la señal de direccionamiento N-terminal de la subunidad VIII de la COX humano. Este sistema se ha empleado para generar una sonda aequorina mitocondrial de orientación que ha demostrado ser extremadamente útil para la investigación mitocondrial de señalización 9 de calcio. El principal inconveniente de estas sondas codificados genéticamente es que necesitan para ser introducido en las células por la expresión transitoria (que no es factible para ciertos tipos de células y pueden producir resultados variables) o mediante la creación de sistemas de expresión estables (que está consumiendo tiempo). Para evitar los problemas descritos anteriormente, hemos desarrollado un nuevo protocolo para medir mitocondrial de Ca2 + y ΔΨ m simultáneamente. Este protocolo se basa en un método descrito previamente que añade calcio exógeno a células permeabilizadass = &quot;xref&quot;&gt; 10. Nuestro protocolo tiene tres ventajas principales con respecto a otros métodos: en primer lugar, utilizamos Fluo-4 AM y TMRM para supervisar Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m, dos colorantes que tienen propiedades espectrales muy distintas; En segundo lugar, las células se permeabilizaron de modo que la señal de Fluo-4 solamente está detectando mitocondrial Ca 2 + y Ca2 + no localiza en otros orgánulos o el citosol de la célula; y en tercer lugar, el uso de Fluo-4 para detectar Ca 2 + mitocondrial permite la tinción celular rápido y simple, anulando cualquier problema de transfección de células o de transformación que existen si el uso de sondas codificados genéticamente.

<table><tbody><tr><td>Medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM)</td><td>ThermoFisher</td><td>10566016</td><td></td></tr><tr><td>suero fetal bovino (FBS)</td><td>ThermoFisher</td><td></td> 16000044 <td></td></tr><tr><td>1x solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>100x penicilina/estreptomicina (p/s)</td><td>ThermoFisher</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % de tripsina/0,25 % de EDTA</td><td>ThermoFisher</td><td></td><td></td>25200056</tr><tr><td>cubreobjetos de 8 pocillos</td><td>ibidi</td><td>80826</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793566</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795488</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746495</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>HEDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8126&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1000</td><td></td></tr><tr><td>glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1626</td><td></td></tr><tr><td>ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5285</td><td></td></tr><tr><td>Ca2+ libre Hank' s solución salina tamponada (HBSS)&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>tetrametilrodamina, éster metílico, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>Verapamilo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-4 acetoximetimetil éster (Fluo-4, AM)</td><td>ThermoFisher</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>dimetilsulfóxido (DMSO)</td><td>ThermoFisher</td><td>D12345</td><td></td></tr><tr><td>cianuro de carbonilo p-trifluorometoxifenilhidrazona (FCCP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C2920</td><td></td></tr><tr><td>digitonina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>thapsigargin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9033</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127&nbsp;</td><td>ThermoFisher</td><td>P3000MP&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>hematitómetro</td><td>VWR</td><td>631-0925</td><td></td></tr><tr><td>placas de cultivo celular de 10 cm</td><td>Corning</td><td>COR430167</td><td></td></tr><tr><td>matraces de cultivo celular de 75 cm2</td><td>Corning</td><td>COR430641</td><td></td></tr></tbody></table>

medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Simultaneous Measurement of Mitochondrial Calcium and Mitochondrial Membrane Potential in Live Cells by Fluorescent Microscopy

Aparte de su papel esencial en la generación de ATP, las mitocondrias también actúan como amortiguadores de calcio locales para regular fuertemente la concentración intracelular de Ca2 + (Ca2 +). Para hacer esto, mitocondrias utilizan el potencial electroquímico a través de su membrana interna (ΔΨ m) para secuestrar Ca 2 +. La afluencia de Ca2 + en la mitocondria estimula tres deshidrogenasas que limitan la velocidad del ciclo del ácido cítrico, el aumento de la transferencia de electrones a través de la fosforilación oxidativa (fosforilación oxidativa) complejos. Esta estimulación mantiene ΔΨ m, que se disipa temporalmente como los iones de calcio positivos cruzar la membrana interna mitocondrial en la matriz mitocondrial. Se describe aquí un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas mediante microscopía confocal. Por permeabilización de las células, Ca 2 + mitocondrial puedemedirse utilizando el Ca 2 + indicador fluorescente Fluo-4 AM, con la medición de ΔΨ m usando el colorante fluorescente tetrametilrodamina, éster metílico, el perclorato (TMRM). El beneficio de este sistema es que hay muy poco solapamiento espectral entre los colorantes fluorescentes, lo que permite una medición precisa de Ca 2 + mitocondrial y ΔΨ m simultáneamente. Uso de la adición secuencial de Ca 2+ alícuotas, Ca 2 + mitocondrial captación pueden ser monitoreados, y la concentración a la que Ca2 + induce la transición de la permeabilidad de la membrana mitocondrial y la pérdida de ΔΨ m determinado.

Hemos utilizado este protocolo para examinar los efectos de una mutación de MT-ND5 en la capacidad de las mitocondrias de células 143B para amortiguar los aumentos en el calcio 12. En el ejemplo que se muestra aquí, las células 143B de control se cargaron con TMRM y Fluo-4 AM antes de permeabilización con digitonina. Después de 5 min de formación de imágenes, ocho adiciones secuenciales de un 1: se hicieron dilución 100 de 40 mM CaCl 2 exógenos...

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Apart from their essential role in generating ATP, mitochondria also act as local calcium (Ca2+) buffers to tightly regulate intracellular Ca2+ ...

El objetivo general de este procedimiento es proporcionar un método sencillo para medir simultáneamente la captación de calcio mitocondrial y el potencial de membrana mitocondrial en células vivas mediante microscopía confocal. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo mitocondrial, como la forma en que las mitocondrias actúan como almacenes locales de calcio para regular estrictamente la concentración intracelular de calcio. La principal ventaja de esta técnica es que tanto el calcio mitocondrial como el potencial de membrana mitocondrial pueden medirse específicamente y simultáneamente en células vivas sin necesidad de manipulación genética.Aunque este método puede proporcionar información sobre la regulación del calcio en la patología de enfermedades mitocondriales, también puede utilizarse para estudiar otras afecciones degenerativas más recientes, cuando la regulación del calcio en orina es crucial. En este procedimiento, cultive las células en placas de cultivo celular de diez centímetros o en matraces de 75 centímetros cuadrados, en medio de cultivo a 37 grados Celsius durante 24 horas. Para recolectar las células, retire el medio por aspiración y lave

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Se presenta un método para aislar rápida (microsegundos) eventos de calcio de los flujos más lentos en las células vivas mediante microscopía confocal de barrido láser. El método mide las fluctuaciones de intensidad de fluorescencia de los indicadores de calcio por los escáneres de la línea de la grabación de varios cientos de píxeles en una celda. Análisis del histograma nos permite aislar las escalas de tiempo de los flujos de calcio diferentes.

La medición de flujos rápidos de calcio en los cardiomiocitos

Fusión mitocondrial se midió mediante el seguimiento de la equilibración de photoconverted matriz orientada GFP través de la red mitocondrial en el tiempo. Hasta ahora, sólo una célula podría ser sometido a un análisis cinético hora larga a la vez. Se presenta un método que mide simultáneamente varias celdas, y acelera así el proceso de recopilación de datos.

Una más rápida, de alta resolución, APMt-GFP-ensayo basado en la fusión mitocondrial Adquisición de datos cinéticos de varias celdas en paralelo mediante microscopía confocal

Este video describe un ensayo basado en un lector de placas para medir la absorción de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas. El ensayo analiza la señal de fluorescencia de un colorante fluorescente sensible al calcio para estudiar la cinética de la absorción de calcio mitocondrial y la sobrecarga de calcio.

Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

Ensayo de afluencia de calcio para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas

El video muestra la medición simultánea de los niveles de calcio intracelular y los cambios en el potencial de membrana en las células endoteliales de los segmentos de la arteria cerebral del ratón. El tubo endotelial aislado se carga con un indicador de calcio fluorescente y se trata con un fármaco que induce la liberación de calcio intracelular, lo que da lugar a un cambio en el potencial de membrana. La fluorescencia del indicador permite la medición de los niveles de calcio, y se inserta un...

Medición simultánea del calcio intracelular y del potencial de membrana en el endotelio cerebral de un ratón

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

Demostrado aquí son protocolos para el aislamiento (1) recién endoteliales cerebrales intactos "tubos" y mediciones (2) simultáneas de calcio endotelial y la membrana potencial durante la hiperpolarización derivados del endotelio. Además, estos métodos permiten ajuste farmacológico de calcio de la célula endotelial y señalización eléctrica como variables experimentales individuales o interactivas.

Medidas simultáneas de calcio intracelular y el potencial de membrana en el endotelio Cerebral de ratón recién aislado e intacto

Esta técnica describe un flujo de trabajo efectivo para visualizar y medir cuantitativamente el potencial de la membrana mitocondrial y los niveles de superóxido dentro de las células HeLa utilizando imágenes en vivo basadas en fluorescencia.

Cuantificación basada en fluorescencia del potencial de membrana mitocondrial y los niveles de superóxido utilizando imágenes en vivo en células HeLa

Aprende a medir simultáneamente el calcio mitocondrial y el potencial de membrana en células vivas mediante microscopía confocal. Esta técnica permite estudiar la función mitocondrial sin manipulación genética.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

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