Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

El objetivo general de este procedimiento es monitorear los cambios en la concentración de calcio mitocondrial en células vivas. Esto se logra seccionando primero las células con la proteína indicadora de calcio peram métrica, que se dirige a la matriz mitocondrial, uno o dos días después de la transfección. El microscopio de fluorescencia y el software están configurados para la obtención de imágenes de células vivas.

A continuación, se adquieren imágenes de células que expresan peram de proporción métrica tras la adición de un agonista movilizador de calcio. El paso final del procedimiento es el análisis cuantitativo de las imágenes adquiridas. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran cambios dinámicos en la concentración de calcio mitocondrial a través de la microscopía de fluorescencia de células vivas que expresan una proteína indicadora de calcio de proporción métrica.

La principal ventaja de esta técnica sobre los métodos existentes, como la medición de los niveles de calcio mediante indicadores de calcio sintéticos, es que la proporción métrica de peram está codificada genéticamente y, por lo tanto, puede dirigirse a las mitocondrias o a cualquier otro órgano de interés. Hola, soy el Dr. Ascar, un postdoctorado en el laboratorio del Dr. Benning, y hoy demostraré el procedimiento. Para comenzar el protocolo de células helo de la placa la noche anterior, la transfección en hojas de cubierta de vidrio estéril colocadas en una placa de cultivo estándar de seis pocillos a una densidad que será de aproximadamente el 70% de la fluidez para la transfección al día siguiente. Al día siguiente prepare los complejos de DNA Lipectomy 2000 según las instrucciones del fabricante con cuatro microgramos de vector de expresión mitocondrial peram métrico, y 10 microlitros de lipectomía 2000 diluidos en 0,5 mililitros de óptimo para cada pocillo a transfectar.

A continuación, reemplace el medio de cultivo D-M-E-M-F-B-S HELOC en cada pocillo con 1,5 mililitros del mismo medio sin antibióticos. Agregue la solución de LIPECTOMÍA a la solución de ADN y mezcle suavemente después de que se hayan formado los complejos. Añadir la solución de lipectomía de ADN gota a gota a cada pocillo a transfectar mezclando meciendo suavemente la placa e incubar durante cuatro horas en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados, 5% de dióxido de carbono después de la incubación.

Reemplace el medio con D-M-E-M-F-B-S que contenga antibióticos. Permita que las células expresen peram métrico durante uno o dos días antes de obtener imágenes con fórceps. Coloque suavemente un cubreobjetos con células HELOC en una cámara de imágenes adecuada con solución de imágenes.

Monte la cámara de imágenes en una platina de microscopio invertida. A continuación, utilice un objetivo de inmersión en aceite de 40 x o más y una longitud de onda de 380 nanómetros. Para encontrar un área de interés que contenga una o más celdas que expresen una relación métrica, se utilizan 380 nanómetros para identificar las celdas como métrica de relación.

Peram es menos resistente al fotoblanqueo en esta longitud de onda. Una vez que se haya identificado un área de interés, configure el software para la excitación dual a 495 y 380 nanómetros. A continuación, adquiera imágenes secuencialmente excitándolas alternativamente a 495 y 380 nanómetros.

Adquiera imágenes de los niveles basales de calcio durante al menos 30 segundos antes de la aplicación del agonista. A continuación, aplique el agonista movilizador de calcio a través de un aparato de profusión, teniendo en cuenta el tiempo de adición para cada agonista, los tiempos de exposición y los intervalos de adquisición deben optimizarse para evitar el fotoblanqueo y al mismo tiempo permitir una resolución temporal suficiente. Una vez finalizado el experimento, las imágenes se pueden analizar sin conexión.

Para comenzar el análisis, seleccione una región de interés dentro de un área vacía del campo para restar la fluorescencia de fondo si es necesario. A continuación, exporte las mediciones de la relación 4 95 3 80 de la región de interés a Excel o a un software gráfico similar. Este panel de imágenes muestra la localización subcelular de la relación métrica peram y las mitocondrias.

A la izquierda hay una imagen de células vivas de células helo que expresan una relación métrica peram. En el centro está la tinción fluorescente de las mitocondrias y el colorante selectivo MIT tracker rojo CMX Ross. Y finalmente, a la derecha, la imagen combinada que se muestra aquí es una serie de imágenes pseudocolor de 4 95, 3 80 nanómetros de proporción de cuatro células helo que expresan una proporción métrica de peram en las mitocondrias tratadas con 10 micromolares A TP, y la cuantificación de los cambios en los niveles de calcio mitocondrial de esas cuatro células anteriores se muestra aquí en esta imagen de una célula hela que expresa una proporción de peram métrica en las mitocondrias.

La heterogeneidad de la respuesta al calcio en las mitocondrias individuales, así como la fragmentación significativa de las mitocondrias, es evidente tras 60 minutos de tratamiento con esporas de estor de 0,5 micromolares. Algunas mitocondrias tienen aumentos oscilatorios de calcio que se muestran con la flecha blanca, mientras que otras no muestran cambios significativos en el nivel de calcio que se muestra con una flecha amarilla. Este gráfico revela el cambio en los niveles globales de calcio mitocondrial en una sola célula helo después de la inducción de la apoptosis durante 120 minutos con esporina stor de 0,5 micromolares.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo medir los cambios dinámicos en los niveles de calcio mitocondrial en respuesta a varios tli utilizando la proteína R de calcio medicada con peram, que se dirige selectivamente a la matriz mitocondrial.