Name: Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Aprende a analizar la capacidad de retención de Ca²⁺ y el hinchazón mitocondrial inducida por calcio en mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y. Este método simple permite estudiar la disfunción mitocondrial.

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Este estudio fue apoyado por subvenciones de concesión del destacado científico de Shandong (JQ201421) y concesión de NSFC (81371226).

1. aislamiento de mitocondrias
Nota: Todas las soluciones y equipos deben preenfriados a 0 - 4 ° C y mantener en hielo.
<ol><li>Semillas aproximadamente 3 x 106 SH-SY5Y células por placa de cultivo celular de 10 cm. Células en cultivo en alta glucosa Dulbecco de modificado medio de Eagle con 10% suero fetal bovino, penicilina (100 U/mL)-estreptomicina (100 μg/mL). Mantener a 37 ° C en una incubadora con 5% CO2 durante la noche. Nota: al menos 1-2 x 107 SH-SY5Y células se necesitan para cada ensayo de aislamiento.</li>
	<li>Quite el medio y lavar las células con aproximadamente 1 mL de PBS frío de hielo en una placa de cultivo celular de 10 cm 3 veces.</li>
	<li>Agregar nuevo 1 mL de PBS frío de hielo en la placa de cultivo celular de 10 cm y raspar las células adherentes en un nuevo tubo de 1,5 mL. Centrifugar a 800 x g por 10 min a 4 ° C.</li>
	<li>Durante la centrifugación, preparar 5 mL de tampón de aislamiento mitocondrial (250 mM sacarosa, 10 mM HEPES (ácido 4 (n-2-hidroxietilpiperazina-N'-2-ácido-(2-hydroxyethyl)-1-piperazina), 10 mM KCl, 1.5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) suplementado con 50 μL de la acción de los inhibidores de la proteasa solución (concentración x 100; 1 tableta libre de EDTA disuelto en 500 μl de ddH2O).</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial. Incubar el tubo de 1,5 mL en hielo durante 30 minutos.</li>
	<li>Lyse las células suspendidas con un homogeneizador de vidrio (15-25 golpes) hacia arriba y hacia abajo manualmente en el hielo. Nota: Asegúrese de que no hay burbujas cuando las células están homogeneizadas. Contar las células intactas y núcleos desnudos por microscopio visualmente y confirmar que > se ha producido rotura de la célula de 90%.</li>
	<li>Transferir el homogeneizado en un tubo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min a 4 ° C para eliminar los desechos (núcleos y células intactas restantes).</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo de 1.5 mL y centrifugar a 1.000 x g durante 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo y centrifugar a 14.000 g x 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Quite el sobrenadante y resuspender el precipitado que contiene mitocondrias con 1 mL de tampón de aislamiento mitocondrial.</li>
	<li>Centrifugue la solución durante 15 min a 14.000 x g 4 ° C para precipitar las mitocondrias.</li>
	<li>El sedimento resultante de las mitocondrias debe mantenerse en hielo y resuspendió en 50-100 μL KCl media (125 mM KCl, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, 5 mM de glutamato, malato de 5 mM y la rotenona μM 2, pH 7.4) según el volumen de pellets antes de cualquier culo Ay.</li>
	<li>Utilice 5 μL de solución mitocondrial para medir la concentración de proteína mitocondrial por análisis estándar de BCA, OD562 de medición usando un lector de placa13.</li>
</ol>2. determinación de la capacidad de retención de mitocondrial Ca2 +
<ol><li>Preparar los medios de comunicación de KCl y añadir el Ca2 +-atar el tinte verde fluorescente a una concentración final de 0,5 μM antes del experimento.</li>
	<li>Transferir 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl que contiene 0,5 μM Ca2 +-atar bien el tinte fluorescente verde en cada placa de 6 pozos.</li>
	<li>Incubar las mitocondrias y el Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde en la placa de la pozo 6 a temperatura ambiente protegido de la luz ambiental para 1 minuto 4 Añadir alícuotas μL de una solución de CaCl2 (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 de 20 mM 20 mM HEPES, 5 mM glutamato, malato de 5 mM, pH 7,4) a cada placa de 6 pozos bien con el automático dispense ajuste para introducir la proteína mitocondrial de Ca2 +/mg de 200 nmol.</li>
	<li>Usar un espectrómetro de fluorescencia para supervisar los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 min con una longitud de onda de excitación de 506 nm y una longitud de onda de emisión de 531 nm. La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante 3 s entre lecturas controlado por software (figura 1).</li>
	<li>Añadir una alícuota adicional de 4 μL de solución de CaCl2 de 20 mM a cada pocillo y monitoreo de los cambios de fluorescencia cada 3 s durante 2 minutos Repita este paso hasta que la fluorescencia aumenta con el tiempo. Nota: Las mitocondrias son desafiadas con la Ca agregado2 + indicada la grabación mayor fluorescencia. Cuando se abre el mPTP, la fluorescencia aumenta con el tiempo.</li>
	<li>Interpretar la cantidad total de Ca2 + añadido hasta que el mPTP se abre como el Ca2 + capacidad de retención de.</li>
</ol>3. determinación de Ca 2 +-inducida hinchazón mitocondrial
<ol><li>Preparar los medios de comunicación de KCl antes del experimento.<ol>
<li>Transfiera 1 mL de mitocondrias aisladas (0,4 mg/mL) en medio de KCl en cada placa de 6 pozos bien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Añadir 10 μL de solución acuosa de CaCl2 (proteína mitocondrial de 500 nmol/mg) de 20 mM en proteína mitocondrial para desencadenar la hinchazón mitocondrial.</li>
	<li>Registrar la disminución de absorbancia a 540 nm cada 3 s en un lector de microplacas controlado por el software durante 10 minutos (figura 2). Los cambios de fluorescencia son causados por un flujo de solutos a través de la membrana interna mitocondrial. Nota: La disminución absorbancia a 540 nm corresponde a las mitocondrias hinchadas. Si el lector no observa una disminución en la absorbancia, un mayor intervalo de lectura o tiempo de lectura puede ser adoptado.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. sol supervisó los experimentos. Li Wei realizó los experimentos. Chen Zhang y X. el sol escribió el libro.

Aquí, hemos descrito un protocolo sencillo y eficaz para el mitocondrial Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa ensayo hinchazón mitocondrial.
Para el aislamiento mitocondrial, asegúrese de que todos los materiales y tubos son de hielo, especialmente cuando las células de homogeneización. 0.25% tripsina-EDTA puede utilizarse también para separar las células desde el plato durante 5 minutos a 37 ° C. Después de 15-25 golpes, es necesario observar la membrana cel...

Las mitocondrias son los principales órganos celulares que producen casi el 95% de la ATP que se utiliza en las células de mamífero por fosforilación oxidativa. Se informó que el secuestrado concentración micromolar de Ca2 + por las mitocondrias, la presencia de ADP y fosfato inorgánico puede utilizarse para fosforilan ADP síntesis ATP1. Cuando la concentración citosólica Ca2 + por encima de un umbral, las mitocondrias pueden absorción de Ca2 + rápidamente y eflujo poco a poco. Así pues, el funcionamiento de la mitocondria puede afluencia el aumento citosólico Ca2 +. Irrelevante para la participación en la fosforilación oxidativa, la mitocondrial Ca2 + también tomar parte en las señales de calcio citosólico y activar el mecanismo de apoptosis mitocondrial al inducir la apertura de la mPTP en el interior mitocondrial membrana2. Ha sido ampliamente reconocida que elevación anormal de Ca intracelular2 + puede inducir inflamación masiva mitocondrial por la apertura del mPTP3. Así, este protocolo tiene como objetivo evaluar la función mitocondrial mediante la cuantificación de la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-trigged hinchazón mitocondrial.
Capacidad de retención de CA2 + es la medida de la capacidad de las mitocondrias de calcio citosólico de absorción. Las mitocondrias pueden búfer el calcio libre citosólico y regulan procesos celulares dependientes de calcio por la absorción de calcio en forma de precipitados inactivos. Deterioro capacidad de Ca2 + retención ocurre en fenómenos de estrés asociados con limitación de energía e incluso neurodegenerativas enfermedades4,5. Permeabilized digitonin células o mitocondrias aisladas se pueden utilizar para identificar la capacidad retención de Ca2 + , y la elevada capacidad para acumular Ca2 + por mitocondrias aisladas con el glutamato adicional y malato no es afectada por la Aislamiento mitocondrial procedimiento6. Debe utilizarse una cantidad pretitulada de digitonin a permeabilizar las membranas del plasma de diferentes tipos de células. La sal de hexapotassium de Ca2 +-enlace colorante fluorescente verde, un Ca2 +-indicador excitable luz visible célula impermeant sensible, ha sido ampliamente utilizado7. CA2 +-encuadernación verde colorante fluorescente es un indicador de baja afinidad y se utiliza para mostrar que intracelular libre Ca2 + las concentraciones siguen aumentando durante prolongado (5 min) estímulos8. Este método fue menos sensible que la técnica de filtros radiactivos pero fue simplificado grandemente. El adicional Ca2 + eleva la fluorescencia verde de calcio y la absorción de Ca2 + por mitocondrias devuelve la fluorescencia a línea de fondo. Se hicieron adiciones secuenciales de Ca2 + hasta que la mitocondria no absorción extramitochondrial Ca2 + 9. Un lector de microplacas de fluorescencia puede utilizarse para informar continuamente la fluorescencia verde de calcio.
Después de la acumulación de Ca2 + , mitocondrias despolarizado, liberan Ca2 + en el medio y comenzaron a hincharse. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. La microscopia electrónica y la disminución ligera absorbancia a 540 nm puede usarse para medir la Ca2 +-activa de10,hinchazón mitocondrial11. Volumen de las mitocondrias puede determinarse directamente adelante ángulo dispersión ligera12, donde disminuye la absorbancia refleja inflamación pasiva de la matriz mitocondrial.
Aquí ilustramos la metodología para examinar la mitocondrial Ca2 + capacidad de la retención y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>Línea celular SH-SY5Y</td><td>ATCC (El Centro Global de Recursos Biológicos)</td><td>Número ATCC: CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Verde de calcio-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+ colorante fluorescente de unión</td></tr><tr><td>a la unión Inhibidores completos de la proteasa</td> Roche <td>Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de vidrio</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutamato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>rotenona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan Instrumentos flash</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco de alta glucosa' s medio Eagle modificado</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L de glucosa, L-glutamina, sin piruvato de sodio</td></tr><tr><td>suero fetal bovino</td><td>Hypona</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>penicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>estreptomicina</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>BCA kit de ensayo</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>plato de cultivo celular de 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitocondrial de ca2 + retención capacidad análisis y ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

La producción de ATP por fosforilación oxidativa es la función principal de las mitocondrias. Las mitocondrias en los eucariotas superiores también participarán en citosólica Ca2 + buffering, y la producción de ATP en mitocondrial puede estar mediada por intramitochondrial gratis Ca2 + concentración. Capacidad de retención de CA2 + puede considerarse como la capacidad de las mitocondrias para retener el calcio en la matriz mitocondrial. Acumulación intracelular Ca2 + lleva a la permeabilidad de la membrana mitocondrial interna, como la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial (mPTP), que conduce a la salida de moléculas con un molecular peso menos de 1.5 kDa. CA2 +-activa las mitocondrias hinchazón se utiliza para indicar la apertura del mPTP. Aquí, Describimos dos ensayos para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial en las mitocondrias aisladas. Después de ciertas cantidades de Ca2 + se ha añadido, todos los pasos pueden ser completados en un día y registrados por un lector de microplacas. Por lo tanto, pueden adoptarse estos dos análisis simples y eficaces para evaluar el Ca2 +-relacionadas con las funciones mitocondriales.

Representante resultados de capacidad de retención de Ca2 + : Los resultados se expresaron como valores de fluorescencia. Con los pulsos adicionales de Ca2 + (200 nmols/mg proteína mitocondrial), la fluorescencia aumentada por el doble por encima de la línea de fondo con la apertura del mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibidor de la Ca2 +-inducida por mPTP apertura o 1 μM atractyloside (ATR), un activador de la Ca2 +-inducida por m...

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca2 + y Ca2 +- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

Mitocondrial de Ca2 + retención capacidad análisis y Ca2 +-activa hinchazón mitocondrial ensayo

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

El objetivo general de este experimento es determinar la capacidad de retención de calcio mitocondrial en la hinchazón mitocondrial inducida por calcio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la disfunción mitocondrial, como el metabolismo energético anormal. La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla y eficaz.Para comenzar, siembre aproximadamente tres millones de células SH-SY5Y por placa de cultivo celular de 10 centímetros. Retire el medio y lave las células con aproximadamente un mililitro de PBS frío en hielo en una placa de cultivo celular de 10 centímetros, tres veces. Añada un mililitro de PBS frío en hielo a la placa de cultivo celular de 10 centímetros y raspe las células adherentes hacia un nuevo tubo de 1,5 mililitros.Centrifugar a 800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados Celsius. Durante la centrifugación, preparar cinco mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial, suplementado con 50 microlitros de solución stock de inhibidor de proteasas. Eliminar el sobrenadante y re-suspender el precipitado con un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial.Incube el tubo de 1,5 mililitros en hielo durante 30 minutos. A continuación, lise las células en suspensión con un homogenizador de vidrio, moviendo manualmente hacia arriba y hacia abajo sobre hielo. Transfiera el homogenato a un tubo de 1,5 mililitros.Luego, centrifugue a 1.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius para eliminar los residuos. Tras la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mL antes de centrifugar nuevamente como antes. Después de transferir el sobrenadante a un tubo nuevo, centrifugue a 14.000 ×g durante 15 minutos a cuatro grados Celsius.Elimine el sobrenadante y re-suspenda el precipitado que contiene mitocondrias con un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial. Luego, centrifugue la solución durante 15 minutos a 14.000 × g y 4 °C para precipitar las mitocondrias. El precipitado de mitocondrias resultante debe mantenerse en hielo y re-suspenderse en 50 a 100 microlitros de medio de cloruro de potasio, según el volumen del precipitado, antes de cualquier ensayo.Finalmente, utilice cinco microlitros de la solución mitocondrial para medir la concentración de proteína mitocondrial mediante un ensayo BCA estándar, midiendo la DO562 utilizando un lector de placas. Prepare el medio de cloruro de potasio y añada el colorante verde fluorescente que se une al calcio hasta una concentración final de 0,5 micromolar antes del experimento. Para determinar la capacidad de retención de calcio mitocondrial, primero transfiera un mililitro de mitocondrias aisladas en medio de cloruro de potasio que contiene 0,5 micromolar de colorante verde fluorescente que se une al calcio a cada pocillo de una placa de seis pocillos.Incube las mitocondrias y el colorante verde fluorescente de unión al calcio en la placa de seis pocillos a temperatura ambiente, protegido de la luz ambiental durante un minuto. Tras la incubación, agregue alícuotas de cuatro microlitros de la solución de cloruro de calcio 20 milimolar a cada pocillo de la placa de seis pocillos utilizando la configuración de dispensación automática para introducir 200 nanomoles de calcio por miligramo de proteína mitocondrial. Utilice el espectrómetro de fluorescencia para monitorear los cambios de fluorescencia cada tres segundos durante dos minutos con una longitud de onda de excitación de 506 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 531 nanómetros.La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante tres segundos entre lecturas, controlada por software. Añada un alícuota adicional de cuatro microlitros de solución de cloruro de calcio 20 milimolar a cada pocillo, luego monitoree los cambios de fluorescencia cada tres segundos durante dos minutos. Para determinar la hinchazón mitocondrial inducida por calcio, transfiera un mililitro de mitocondrias aisladas en medio de cloruro de potasio a cada pocillo de una placa de seis pocillos.Luego, agregue 10 microlitros de una solución acuosa de cloruro de calcio 20 milimolar a la proteína mitocondrial para inducir la hinchazón mitocondrial. Utilizando un lector de microplacas controlado por software, registre la disminución de la absorbancia cada tres segundos durante 10 minutos a 540 nanómetros. Aquí se muestran resultados representativos de la capacidad de retención de calcio mitocondrial de la bongkrekina, un inhibidor del poro de transición de permeabilidad mitocondrial inducido por calcio, o MPTP, la apertura de la atractilósido, un activador de la apertura del MPTP inducida por calcio, y un control en blanco.La capacidad en el tratamiento con ácido bongkrékico es mucho mayor que en el grupo con atractilosido, como se esperaba. Aquí se muestran resultados representativos de la hinchazón mitocondrial inducida por calcio con ácido bongkrékico, atractilosido y el control sin tratamiento. La disminución de la absorbancia medida a 540 nanómetros indica las hinchazones mitocondriales.Los resultados sugieren que BKA puede inhibir la apertura del MPTP, mientras que ATR puede facilitar la apertura del MPTP. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en cinco horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las soluciones en hielo.

mitochondrial-ca2-retention-capacity-assay-ca2-triggered

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

Este protocolo describe un método para la medición en tiempo real de los flujos de calcio mitocondrial de imagen fluorescente. El método se aprovecha de una circular permutaciones YFP basada en sensor de calcio de doble excitación radiométrica (radiométrica pericam-mt) expresa selectivamente en las mitocondrias.

Seguimiento de los cambios dinámicos en niveles de calcio mitocondrial de la apoptosis mediante un sensor de calcio genéticamente codificados

Un protocolo espectrofluorométrico para la medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad mitocondrial en el corazón de ratón mitocondrias aisladas se presenta aquí. El ensayo involucra la medición simultánea de las mitocondrias...

Multi-parámetro de medición de la apertura del poro de transición de permeabilidad en el corazón del ratón mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en un lector de placas para medir la absorción de calcio mitocondrial en mitocondrias aisladas. El ensayo analiza la señal de fluorescencia de un colorante fluorescente sensible al calcio para estudiar la cinética de la absorción de calcio mitocondrial y la sobrecarga de calcio.

Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

Este video describe un ensayo basado en imágenes de microscopía confocal para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas. El ensayo utiliza el colorante fluorescente sensible al calcio Rhod-2/AM para medir el calcio mitocondrial en células cultivadas permeabilizadas.

Ensayo de afluencia de calcio para medir la absorción de calcio mitocondrial en células cultivadas

Este video muestra el procedimiento para evaluar la capacidad de retención de calcio mitocondrial mediante el monitoreo de cambios en tiempo real en la fluorescencia a medida que las mitocondrias absorben calcio. Este ensayo es útil para estudiar la función mitocondrial y los procesos relacionados con el calcio, incluida la apoptosis y las enfermedades neurodegenerativas.

Determinación de la capacidad de retención de calcio de mitocondrias aisladas

Las mitocondrias pueden utilizar el potencial electroquímico a través de su membrana interna (Δ Ψm) para secuestrar calcio (Ca2 +), lo que les permite dar forma Ca 2+ citosólico de señalización dentro de la célula. Se describe un método para medir simultáneamente las mitocondrias Ca 2+ absorción y ΔΨ m en células vivas utilizando colorantes fluorescentes y microscopía confocal.

Medición simultánea de calcio mitocondrial y mitocondrial potencial de membrana en células vivas por microscopía fluorescente

Aquí, presentamos dos protocolos para la medición de mitocondrial Ca2 + afluencia en mitocondrias aisladas y células cultivadas. Para mitocondrias aisladas, detallamos una placa base de lector Ca2 + importación de ensayo utilizando el Ca2 + sensible tinte verde-5N de calcio. Para las células cultivadas, se describe un método de microscopia confocal con el Ca2 + tinte Rhod-2/AM.

Análisis de la afluencia del calcio mitocondrial en las mitocondrias aisladas y células cultivadas

En este trabajo, describimos un protocolo modificado para probar el flujo del sustrato respiratorio mitocondrial utilizando perfringolisina O recombinante en combinación con respirometría basada en microplacas. Con este protocolo, mostramos cómo la metformina afecta la respiración mitocondrial de dos líneas celulares tumorales diferentes.

Medición del flujo de sustrato mitocondrial en células perfrendolisaminas o-permeabilizadas recombinantes

Este proctocol tiene como objetivo proporcionar un método para imágenes de Ca2+ mitocondrial in vitro e in vivo en astrocitos y neuronas.

Obtención de imágenes de ca2+ mitocondrial en astrocitos y neuronas utilizando indicadores de Ca2+ codificados genéticamente (GECI)

Este protocolo describe un ensayo comparativo, utilizando actividades complejas mitocondriales CI+CIII y CII+CIII en presencia o ausencia de Na+, para estudiar la existencia de grupos funcionales de CoQ parcialmente segmentados.

La sensibilidad de la membrana mitocondrial interna al Na+ revela grupos de CoQ funcionales parcialmente segmentados

Aquí, presentamos una compilación de ensayos para medir directamente la función mitocondrial en células de mamíferos independientemente de su capacidad para consumir oxígeno molecular.

Ensayos independientes del oxígeno para medir la función mitocondrial en mamíferos

Aprende a analizar la capacidad de retención de Ca²⁺ y el hinchazón mitocondrial inducida por calcio en mitocondrias aisladas de células SH-SY5Y. Este método simple permite estudiar la disfunción mitocondrial.

Mitocondrial de Ca^{2 +} retención capacidad análisis y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial ensayo

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