Mitocondrial de Ca^{2 +} retención capacidad análisis y Ca^{2 +}-activa hinchazón mitocondrial ensayo

Este protocolo tiene por objeto describir un método para examinar la capacidad de retención de Ca^{2 +} y Ca^{2 +}- activa hinchazón de mitocondrias aisladas de SH-SY5Y mitocondrial de células paso a paso.

El objetivo general de este experimento es determinar la capacidad de retención de calcio mitocondrial en la hinchazón mitocondrial inducida por calcio. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de la disfunción mitocondrial, como el metabolismo energético anormal. La principal ventaja de esta técnica es que es muy sencilla y eficaz.

Para empezar, siembre unos tres millones de células SH-SY5Y por placa de cultivo celular de 10 centímetros. Retire el medio y lave las células con aproximadamente un mililitro de PBS helado en una placa de cultivo celular de 10 centímetros tres veces. Agregue un mililitro de PBS helado en la placa de cultivo celular de 10 centímetros y raspe las células adherentes en un nuevo tubo de 1,5 mililitros.

Centrifugar a 800 veces G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Durante la centrifugación, prepare cinco mililitros de tampón de aislamiento mitocondrial, suplementado con 50 microlitros de solución madre de inhibidores de proteasas. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial.

Incuba el tubo de 1,5 mililitros en hielo durante 30 minutos. A continuación, lisar las células suspendidas con un homogeneizador de vidrio, hacia arriba y hacia abajo manualmente sobre hielo. Transfiera el homogeneizado a un tubo de 1,5 mililitros.

A continuación, centrifugar a 1.000 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para eliminar los residuos. Después de la centrifugación, transfiera el sobrenadante a un nuevo tubo de 1,5 mililitros antes de volver a centrifugar como antes. Después de transferir el sobrenadante a un nuevo tubo, centrifugar a 14.000 veces G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.

Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet que contiene mitocondrias con un mililitro de tampón de aislamiento mitocondrial. A continuación, centrifugar la solución durante 15 minutos a 14.000 veces G y cuatro grados centígrados para precipitar las mitocondrias. La pastilla de mitocondrias resultante debe mantenerse en hielo y volver a suspenderse en 50 a 100 microlitros de cloruro de potasio, de acuerdo con el volumen de la pastilla antes de cualquier ensayo.

Por último, utilice cinco microlitros de solución mitocondrial para medir la concentración de proteínas mitocondriales mediante un ensayo estándar de BCA, midiendo OD562 utilizando un lector de placas. Prepare el medio de cloruro de potasio y agregue el tinte fluorescente verde fijador de calcio hasta una concentración final de 0,5 micromolares antes del experimento. Para determinar la capacidad de retención de calcio mitocondrial, primero transfiera un mililitro de mitocondrias aisladas en un medio de cloruro de potasio que contenga 0,5 micromolares de colorante fluorescente verde que se une al calcio a cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Incubar las mitocondrias y el tinte fluorescente verde fijador de calcio en la placa de seis pocillos a temperatura ambiente, protegidos de la luz ambiental durante un minuto. Después de la incubación, agregue cuatro alícuotas de microlitros en la solución de cloruro de calcio de 20 milimolares a cada pocillo de la placa de seis pocillos utilizando la configuración de dispensación automática para introducir 200 nanomoles de calcio por miligramo de proteína mitocondrial. Utilice el espectrómetro fluorescente para controlar los cambios de fluorescencia cada tres segundos durante dos minutos con una longitud de onda de excitación de 506 nanómetros y una longitud de onda de emisión de 531 nanómetros.

La placa está equipada con agitación a 600 rpm durante tres segundos entre lecturas, controlada por software. Agregue una alícuota adicional de cuatro microlitros de solución de cloruro de calcio de 20 milimolares a cada pocillo, luego controle los cambios de fluorescencia cada tres segundos durante dos minutos. Para determinar la inflamación mitocondrial inducida por el calcio, transfiera un mililitro de mitocondrias aisladas en medios de cloruro de potasio a cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Luego, agregue 10 microlitros de solución acuosa de cloruro de calcio de 20 milimolares a la proteína mitocondrial para desencadenar la hinchazón mitocondrial. Usando un lector de microplacas controlado por software, registre la disminución de la absorbancia cada tres segundos durante 10 minutos a 540 nanómetros. Aquí se muestran los resultados representativos de la capacidad de retención de calcio mitocondrial de bongkrekic, un inhibidor del poro de transición de permeabilidad mitocondrial inducido por calcio, o MPTP, apertura de atractilosido, un activador de la apertura MPTP inducida por calcio y un control en blanco.

La capacidad en el tratamiento bongkrekic es mucho mayor que la del grupo atractyloside, como se esperaba. Aquí se muestran los resultados representativos de la hinchazón mitocondrial inducida por calcio de bongkrekic, atractyloside y el control sin tratamiento. La disminución de la absorbancia monitoreada a 540 nanómetros indica las inflamaciones mitocondriales.

Los resultados sugieren que BKA puede inhibir la apertura de MPTP, mientras que ATR puede facilitar la apertura de MPTP. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en cinco horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante recordar mantener todas las soluciones en hielo.