Ensayo de absorción de calcio mitocondrial: un método basado en lectura de placas para medir la absorción de calcio en mitocondrias aisladas

Las mitocondrias absorben el calcio citosólico ya que es esencial para su correcto funcionamiento.

La entrada excesiva de calcio en la matriz mitocondrial (sobrecarga de calcio mitocondrial) desencadena la apertura de un canal de membrana interna, el poro de transición de permeabilidad mitocondrial o MPTP. El poro abierto permite un aumento del flujo de calcio de las mitocondrias, causando disfunción mitocondrial.

Para medir la absorción de calcio mitocondrial, comience con una placa de pocillos múltiples que contenga mitocondrias aisladas suspendidas en un tampón adecuado. Complemente el pozo con piruvato y malato, que son sustratos productores de ATP. Mezclar el contenido del pozo e incubar.

Durante la incubación, el piruvato y el malato se convierten en ATP, energizando las mitocondrias. Agregue una solución que contenga moléculas de colorante fluorescente sensibles al calcio e impermeables a la membrana mitocondrial. Dispense el tampón que contiene calcio a las mitocondrias energizadas.

Controle la fluorescencia de calcio del tinte a medida que las moléculas de tinte se unen al calcio libre en el tampón.

Agregue más iones de calcio para iniciar la afluencia de calcio mitocondrial. El calcio mitocondrial que aumenta gradualmente disminuye los iones de calcio en el tampón, reduciendo la fluorescencia de calcio del colorante.

Una vez que las mitocondrias alcanzan su máxima capacidad de transporte de calcio, la adición adicional de iones de calcio abre los canales MPTP e importa calcio al tampón. El calcio tampón se une a las moléculas de colorante, lo que provoca un aumento de la fluorescencia del calcio del colorante.

Grafique la fluorescencia del colorante en diferentes puntos de tiempo de adición de calcio para monitorear la cinética de la absorción de calcio mitocondrial.

Para iniciar la medición de la absorción de calcio mitocondrial utilizando un lector de placas, programe el lector para que realice una lectura cinética de la fluorescencia verde de calcio-5N cada segundo, durante un tiempo total de 1.000 segundos.

Programe los inyectores de reactivos para dispensar 5 microlitros de solución de cloruro de calcio en varios puntos de tiempo. Luego, cebe los inyectores con la solución de cloruro de calcio que se usará.

A continuación, agregue 200 microgramos de mitocondrias aisladas a un pocillo de una placa de 96 pocillos y agregue el volumen apropiado de tampón de cloruro de potasio para lograr un volumen total de 197 microlitros. Luego, agregue 1 microlitro de piruvato molar, 1 microlitro de malato 500 milimolar y 1 microlitro de caldo verde de calcio 5N de 1 milimolar, y mezcle suavemente pipeteando.

Incube protegido de la luz a temperatura ambiente durante 2 minutos, para que las mitocondrias se energicen. Finalmente, inicie el protocolo cinético preprogramado y controle la fluorescencia verde de calcio-5N.