La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan In Vitro La maduración de ovocitos en el pez cebra

El objetivo general de este protocolo es llevar a cabo la maduración in vitro de los ovocitos de pez cebra y, si se desea, manipular funcionalmente los productos genéticos maternos, antes de la fecundación. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, relacionadas con la importancia de la contribución materna al embrión. La principal ventaja de esta técnica es el cultivo de ovocitos in vitro, seguido de la fecundación y la producción de embriones viables.

Y, si se desea, permite la manipulación funcional de los productos genéticos maternos que actúan en el embrión temprano inmediatamente después de la fertilización. Para comenzar, de ocho a 10 días antes de la manipulación del cultivo in vitro, use una red de pesca para transferir múltiples conjuntos de un solo pez macho y una sola hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Déjalos en el tanque de apareamiento durante la noche.

Después de permitir que los peces se apareen durante la tarde siguiente, use una red para separar a las hembras que producen huevos durante el apareamiento y colóquelas en un tanque separado. Alimente a estas hembras dos veces al día con una mezcla de alimentos que contenga aproximadamente una cantidad igual de camarones en salmuera y hojuelas de comida para peces. En condiciones estériles, agregue 20 mililitros de L-15 Medium de Leibovitz con l-glutamina, PH 7.0, a un tubo cónico de 50 mililitros.

Luego, use 10 hidróxido de sodio normal para llevarlo a PH 9.0. Agregue 9 mililitros del L-15 Medium a dos tubos cónicos separados de 50 mililitros. Luego, etiquete un tubo DHP y el otro DHP.

En el tubo de DHP, agregue 10 microlitros de DHP, 490 microlitros de DH2O y 500 microlitros de 10% BSA. En el tubo de DHP, agregue 100 microlitros de 10 miligramos por mililitro de gentamicina, 400 microlitros de DH2O y 500 microlitros de 10% BSA. Para llevar a cabo la disección de ovocitos, se debe comenzar por preparar una solución madre de tricaína al 0,2% en DH2O, tamponada a PH 7.0 con un molar tris PH 9.0.

Mantenga esta solución a 4 grados centígrados. De cero a cuatro horas antes del final del ciclo de luz diario en la instalación, en un vaso de precipitados de 250 mililitros, agregue 20 mililitros de solución madre de tricaína al 0,2%, PH 7.0, a 80 mililitros de agua de pescado y mezcle. Es fundamental iniciar el procedimiento dentro de las cuatro horas posteriores al final del ciclo de luz al que están acostumbrados los peces.

De lo contrario, los ovocitos no madurarán adecuadamente. Con una cuchara, recoja los peces sacrificados de la solución de tricaína y enjuáguelos brevemente con agua de pescado. Luego, coloque el pescado sobre una toalla de papel para absorber el exceso de agua.

Use una hoja de afeitar limpia para decapitar al pez sacrificado a la altura de la aleta pectoral. Luego, con unas tijeras de disección, haz una incisión longitudinal en la cara ventral del pez, que se extienda desde el extremo anterior hasta la zona anal. Coloque el pez en una placa de Petri bajo un microscopio de disección con luz incidente.

Luego, usando un par de pinzas de disección, aísle las porciones de ovario y transfiera el tejido a una placa de cultivo de 35 por 10 milímetros, que contiene cuatro mililitros de L-15 Meidum, DHP de Leibovitz. Ahora, con pinzas de disección, disocia suavemente los ovocitos de la masa folicular. Clasifique los cuatro ovocitos en etapa temprana, que tienen un tamaño cercano al máximo y se caracterizan por un citoplasma opaco oscuro y una vesícula germinal fácilmente aparente, o GV, ubicada asimétricamente dentro del ovocito.

Deseche los ovocitos en etapas más tempranas y los huevos maduros translúcidos en la etapa 5. Utilice una pipeta de vidrio para pastos para transferir los cuatro ovocitos en etapa temprana a una segunda placa de cultivo de plástico de 35 por 10 milímetros, que contiene cuatro mililitros de L-15 Medium de Leibovitz, más DHP. Transfiera cantidades mínimas de medio menos DHP al plato, que contiene la solución más DHP.

Si inyecta ARNm, inmediatamente antes de la inyección, use agua de ósmosis inversa de grado de ARN y cloruro de potasio 0.2 molar para diluir el ARNm a una solución final de cloruro de potasio 0.1 molar. Si inyecta morfolinos, o MO, inmediatamente antes de la inyección, diluya los MO a la concentración deseada utilizando agua de ósmosis inversa de grado de ARN y cloruro de potasio 0,2 molar, para lograr una concentración final de cloruro de potasio 0,1 molar. Luego, para llevar a cabo la inyección, sostenga manualmente los ovocitos con pinzas finas y, usando una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio estirada, inyecte aproximadamente un nanolitro en ovocitos de tipo salvaje en etapa cuatro.

Continuar incubando los ovocitos inmaduros e inyectados en medio DHP a 26,5 grados centígrados. Realizar comprobaciones aproximadamente cada 30 minutos para asegurarse de que los ovocitos permanecen intactos y están en una maduración adecuada, pasando a ser progresivamente translúcidos. Utilice una pipeta de pastoreo para extraer los ovocitos lisados.

Y deséchelos en un vaso de precipitados de residuos de laboratorio, para mantener la calidad del medio. Con aproximadamente la mitad del volumen del medio DHP fresco, cambie el medio de cultivo para mantener una solución clara, dependiendo de la cantidad de lisis de ovocitos. Cuando la mayoría de los ovocitos se hayan vuelto translúcidos y tengan una GV que ya no sea aparente, use pinzas extrafinas para hacer un desgarro en la membrana folicular, en una región con mayor espacio entre el ovocito y la membrana.

Retire una parte de la membrana y, mientras sostiene la parte pelada, extraiga el ovocito de la membrana. Otro paso crítico es la extirpación de la membrana folicular. Si esta capa no se elimina por completo, la fertilización y la expansión del corion se verán impedidas.

Transferir los ovocitos desfoliculados en un volumen mínimo de medio, a una placa de Petri con unas gotas de medio DHP de cultivo, y proceder a la fecundación. Cerca del final de la etapa de maduración del ovocito, y antes de la desfolliculación, prepare una solución de esperma utilizando testículos de cinco machos en 500 microlitros de solución de Hank. Añadir de 10 a 50 microlitros de solución espermática a los ovocitos desfoliculados en medio de cultivo DHP.

Luego, espere 10 segundos. Con ayuda de una pipeta, añadir unas gotas de medio E3 a los ovocitos. Espere un minuto y luego use el medio E3 para inundar la placa.

Después de permitir que los embriones fertilizados se desarrollen, use un microscopio de disección con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de escisión para asegurar una fertilización exitosa, como se describió anteriormente para la fertilización y la estadificación. Como se ve por la expresión de GFP, los ovocitos del cultivo in vitro son capaces de producir proteínas a partir de ARNm exógeno a lo largo del desarrollo de los ovocitos en tan solo dos horas. Sin embargo, solo los ovocitos que inician las condiciones de cultivo en la etapa cuatro de la ovogénesis pueden convertirse en ovocitos maduros en la etapa cinco.

En este experimento, el ARNm de aurora B de tipo salvaje inyectado rescata los efectos fenotípicos de una mutación en su gen correspondiente, la isla celular. También se permite que los embriones de un grupo de control se desarrollen para mostrar el fenotipo mutante correspondiente. La inyección de un Morpholino que bloquea la traducción puede fenocopiar con éxito el fenotipo mutante conocido, como lo demuestra la inyección de lrmp-MO en ovocitos, que imita el fenotipo mutante del ciclo fútil de la mutación correspondiente.

codificación del ARNm también se puede inyectar en ovocitos de tipo salvaje o mutantes para visualizar los productos correspondientes dentro del embrión temprano. Por ejemplo, como se ve aquí, la proteína Sass6-mCherry se localiza en focos marcados por el marcador de centrosoma Gamma tubulina. Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en aproximadamente 5 a 6 horas, si se realiza correctamente.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que no se debe apresurar el procedimiento y permitir la maduración adecuada de los ovocitos antes de la desfoliculación y la fertilización. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fijación de embriones, para responder preguntas adicionales. Por ejemplo, el rescate de su gen de interés, o la localización de ARN o proteína.

Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la génesis temprana del embrión exploraran la contribución de los productos genéticos maternos en el pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular funcionalmente los productos genéticos maternos a través de la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra.