Name: La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan In Vitro La maduración de ovocitos en el pez cebra (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 39 s
Description: Aprende a realizar la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra para manipular productos génicos maternos antes de la fertilización. Este método permite estudiar contribuciones maternas en el desarrollo embrionario temprano.

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Nos gustaría dar las gracias a los miembros del laboratorio y los peces personal directivo instalación Pelegrí, que jugaron un papel decisivo en la facilitación de este proyecto. El apoyo a este proyecto fue proporcionada por el NIH R56 GM065303 del NIH y 2 T32 GM007133 a ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 y 2 NIH T32 GM007133 a CCE, y los NIH RO1 GM065303 a FP

Todos pez cebra fueron manejadas en estricta conformidad con las buenas prácticas de los animales, según lo definido por los órganos de carácter nacional y / o local de los animales pertinentes, y todos los animales de trabajo fue aprobado por el comité correspondiente (Universidad de Wisconsin-Madison número aseguramiento A3368-01). Los animales se mantuvieron en condiciones estándar a 26,5 ° C. 1. Preselección de las hembras NOTA: Los oocitos en las hembras adultas típicamente abarcan una gama de etapas de desarrollo, a partir de la etapa I a V (Figura 2). Purgar las hembras de ovocitos preexistentes a través de un apareamiento natural con éxito aumenta la sincronización de puesta en escena de los ovocitos, como ovocitos recién en desarrollo aparecen como una cohorte 3, 14. Dentro de unos 8 días post-purga, la mayoría de los oocitos están en etapa IV temprano, lo cual es óptimo para la iniciación de la maduración in vitro. Tal sincronización aumenta el rendimiento de tha ovocitost puede pasar por el proceso completo de la maduración in vitro, lo que facilita la manipulación experimental. Ver descripciones previas 13 para más detalles sobre la configuración de los peces en los apareamientos pareados y en la composición del agua de pescado (aquí, 14 g de sal de mar y 150 g de NaHCO 3 por 1.000 l de agua de ósmosis inversa, pH 6.5 a 8.5 (intervalo preferido: 6,8 -7.5) y una conductividad de 180-360! S). Ver Brand et al. 13 para las recetas adicionales. <ol><li> De ocho a diez días antes de la manipulación de cultivo in vitro, utilizan una red de pesca para transferir un solo un solo pez macho y hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Par de varios conjuntos. Dejarlos en la noche a la mañana tanque de apareamiento. Deje que se aparean durante la tarde y por la tarde del día siguiente. </li><li> Utilice una red de pesca para separar las hembras que producen huevos durante el apareamiento y colocarlos en un tanque separado. Alimentar a estos hembras dos veces al día con una mezcla de alimentos containing aproximadamente una cantidad igual de camarón de salmuera y alimentos en escamas de pescado. La cantidad de comida debería ser suficiente para proporcionar aproximadamente 20 min, pero no más, de tiempo de alimentación. </li></ol> 2. Preparación de la maduración Medium NOTA: Preparar medio de maduración en el día del experimento la maduración in vitro, dentro de 1 h de la eliminación de los ovocitos de la hembra (véase la sección 3). <ol><li> Añadir 20 ml de medio L-15 de Leibovitz con L-glutamina, pH 7,0, a un tubo cónico de 50 ml en condiciones estériles. Llevar a pH 9,0 con NaOH 10 N. </li><li> Añadir 9 ml de medio L-15 de Leibovitz, pH 9,0, a 2 tubos cónicos de 50 ml separados. Label 1 tubo &quot;+ DHP&quot; y el otro &quot;-DHP.&quot; </li><li> En el tubo de + DHP, añadir 10 l de 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), 490 l de dH 2 O, y 500 l de 10% de albúmina de suero bovino (BSA). </li><li> En el tubo de -DHP, añadir 100 l de 10 mg / ml de gentamicina, 40081; L de dH 2 O, y 500 l de 10% de BSA. </li></ol> 3. La disección de los ovocitos y la iniciación del cultivo in vitro NOTA: El experimento de cultivo in vitro se lleva a cabo con hembras preseleccionados 8-10 días después de que se liberan los huevos a través de apareamiento natural. Usar medio de maduración hecho el mismo día (véase la sección 2). Ovocitos maduros apropiadamente si la disección se inicia cerca del final del ciclo diurno de pescado (determinado en el laboratorio mediante iluminación artificial pre-establecido en la instalación de pescado) 13, posiblemente procesos que ocurren a través de apareamiento natural imitando. Esto implica que la mayoría de los pasos en el protocolo deben llevarse a cabo en la noche si los peces se alojaron en una instalación con un ciclo de luz estándar (por ejemplo, a partir de la etapa 3.2 a 18:00 en una instalación con un período de luz 08 a.m.-10 p.m.), aunque otros trabajo periodos de tiempo son posibles con un ciclo de luz apropiadamente desplazado en el tiempo. <ol><li> Preparar una solución de tricaína de stock 0,2% en dH 2 O, tamponada a pH 7,0 con 1 M Tris, pH 9,0, y mantener esta solución a 4 ° C. Esto puede ser preparado de antemano. </li><li> Iniciar la h experimento 0-4 antes del final del ciclo diario de luz en la instalación. En un vaso de precipitados de 250 ml, añadir 20 ml de 0,2% de solución de tricaína Stock, pH 7,0, a 80 ml de agua pescado y mezclar. </li><li> La transferencia de las hembras pre-seleccionado para la solución tricaína y la eutanasia por la sobreexposición. Deja las hembras en la solución tricaína durante 15 minutos después del cese de movimiento gill. </li><li> Con una cuchara, recoger los peces sacrificados de la solución tricaína y enjuagar brevemente en agua los peces. Coloque el pescado en una toalla de papel para absorber el exceso de agua. </li><li> Utilice una hoja de afeitar limpia para decapitar a los peces sacrificados en el plano de la aleta pectoral. Usando tijeras de disección, hacer una incisión longitudinal en el lado ventral de los peces, que se extiende desde el extremo anterior de la zona anal. </li><li&gt; Colocar el pescado en una placa de Petri con un microscopio de disección con luz incidente. El uso de un par de fórceps de disección, transferir porciones de ovario a una placa de cultivo mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. NOTA: Los ovarios, que contienen los ovocitos en desarrollo, aparecerán como estructuras opacas y clumpy dentro de la cavidad interna del cuerpo. </li><li> Con unas pinzas de disección, disociar suavemente los ovocitos foliculares de las masas. Ordenar la primera etapa IV ovocitos (Figura 2B; anteriores a la ruptura GV, en tamaño casi máxima y se caracteriza por un citoplasma oscuro, opaco y un fácilmente evidente GV situado asimétricamente dentro del ovocito). Desechar los oocitos en las etapas anteriores (Figura 2A) y, huevos etapa V maduras translúcidos (similares a los de la Figura 2C, pero presente en los ovarios antes del tratamiento DHP). NOTA: Los ovocitos se seleccionan para la maduración en la etapa IV temprano, la etapa más temprana que resulta en madura, oocyt etapa Ves después de las condiciones de cultivo in vitro (Figura 2C y D) 3. Debido a ovocitos en estadio IV están produciendo activamente los productos, la manipulación en esta etapa permite la expresión de productos exógenos a través de la inyección de ARN o para la reducción de la función de genes a través de OMs introducidas. </li><li> Usar una pipeta Pasteur de vidrio para transferir los ovocitos primeros estadio IV a una segunda placa de cultivo de plástico mm 35 x 10 que contenía 4 ml de medio L-15 de Leibovitz + DHP. Transferencia de cantidades mínimas de medio -DHP al plato que contiene la solución + DHP. </li></ol> 4. La microinyección de ovocitos NOTA: etapa Aislado IV ovocitos sometidos a la maduración in vitro se pueden microinyectaron para introducir reactivos para la manipulación funcional o expresión de la proteína etiquetada. La microinyección de reactivos, tales como mRNA y Mos (ver sección 4), se lleva a cabo típicamente cuando los oocitos están experimentando in vitro maturación en medio + DHP, antes de defolliculation. Si se desea, con el fin de permitir más tiempo para llevar a cabo las manipulaciones antes de la maduración de ovocitos, las inyecciones pueden también llevarse a cabo en medio -DHP, antes de la maduración, durante al menos 2 h. Posteriormente, pueden ser transferidos a medio + DHP. <ol><li> Preparar los ARNm utilizando un kit de expresión estándar. Mantenerlos a -80 ° C como una 100-500 pg / l de stock para inyección a una concentración final de 50-500 pg / l (200 pg / l se recomienda) en agua RNA-grado. Preparar OMs a una concentración de 4 ng / l en agua de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Inyectarlos a concentraciones finales de 2 ng / l (o según se determina empíricamente). NOTA: Las inyecciones se llevan a cabo típicamente en un medio + DHP antes de defolliculation (véase la nota en la sección 5). </li><li> Si la inyección de ARNm, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la ARNm utilizando agua-ósmosis inversa de ARN-grado y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl.</li><li> Si la inyección de MOS, inmediatamente antes de la inyección, se diluye la OMs a la concentración deseada con agua-ósmosis inversa y 0,2 M KCl para conseguir una solución final de 0,1 M KCl. </li><li> Mantener manualmente ovocitos con unas pinzas finas e inyectar aproximadamente 1 nL en de tipo salvaje ovocitos etapa IV con una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio desmenuzado. <ol><li> Preparar las agujas de vidrio tirando de tubos capilares de vidrio calentada, la carga de la solución a inyectar, y romper la punta de la aguja con un fórceps, tal como se describe anteriormente en protocolos de inyección estándar en embriones de pez cebra primeros 15. Nota: Es útil si la aguja tiene una conicidad gradual en lugar de un abrupto uno; Esto permite más flexibilidad en términos de la ubicación de la rotura en la punta de la aguja y también ayuda a evitar daños en el embrión inyectado. Usando la misma aguja y la solución como para las inyecciones de embrión, ajustar el volumen inyectado por pre-determinar elajustes de presión microinyector que producen el volumen deseado. Estos ajustes pueden ser determinados por-mock inyectar en una gota de aceite mineral sobre un portaobjetos de calibración platina del microscopio (0,01 mm) y el ajuste de la configuración de micro inyector para obtener el diámetro deseado en el bolo de solución inyectada, como se ha descrito previamente 15. </li></ol></li></ol> 5. La maduración de ovocitos y Defolliculation NOTA: Durante la maduración de ovocitos, los ovocitos serán cada vez más transparente, lo que permite la evaluación de las condiciones de cultivo exitosas. <ol><li> Continuar la incubación de la inmaduro (y, si es apropiado, inyectado) ovocitos en medio + DHP en 26,5 ° C, comprobando periódicamente (cada 30 min) para asegurar que los oocitos permanecen intactas y son sometidos a maduración adecuada al convertirse en progresivamente translúcido (véase la figura 2C) . <ol><li> Eliminar cualquier ovocitos de lisis con una pipeta Pasteur y desecharlosen un vaso de precipitados de residuos de laboratorio para mantener la calidad del medio. Cambiar el medio de cultivo con aproximadamente una mitad de volumen de fresco + medio DHP para mantener una solución clara, dependiendo de la cantidad de lisis de oocitos. </li><li> Dejar que la maduración in vitro de proceder hasta que una mayoría de los ovocitos ser translúcido y tienen un GV que ya no es aparente (aproximadamente 2 h en el tratamiento DHP, ver Figura 2C, en comparación con D). Verlas bajo un microscopio de disección con óptica de luz transmitida. </li></ol></li><li> Retire la membrana folicular más exterior de cada ovocito madurado. El uso de fórceps extrafinos para hacer un desgarro en la membrana folicular en una región con un mayor espacio entre el ovocito y la membrana. Despegar una porción de la membrana y rodar el ovocito fuera de la membrana mientras mantiene pulsada la parte pelada. NOTA: La membrana coriónica subyacente típicamente se mantendrá en estrecha asociación con el huevo durante este proceso; después de acto de huevoivation, se expande para formar una capa protectora para el embrión. </li><li> La transferencia de los ovocitos desfolicularon en un volumen mínimo de medio (normalmente, la transferencia de unos 5-10 ovocitos maduros en menos de 20! L) a una placa de Petri con unas pocas gotas de cultivo (+ DHP) medio y proceder a la fertilización. </li></ol> 6. La fertilización in vitro de oocitos cultivados NOTA: La solución de esperma en hielo, preparado a continuación, mantendrá su potencia durante aproximadamente 2 h. <ol><li> Preparar una solución de esperma cerca del final de la etapa de maduración de ovocitos y antes de defolliculation utilizando testículos de cinco machos en 500 l de solución de Hanks, como se ha descrito previamente 16, 17. </li><li> Añadir 10-50 l de solución de esperma a los ovocitos desfolicularon en medio de cultivo + DHP. Espere 10 s. </li><li> Con una pipeta, añadir unas gotas de embriones (E3) medio de los ovocitos. Espere 1 min y luego inundar el plcomió con medio E3. NOTA: La composición del medio de E3 es el siguiente: NaCl 5 mM, KCl 0,17 mM, 0,33 mM de CaCl2, 0,33 mM MgSO4, y 1-5% de azul de metileno 13. </li><li> Repetir los pasos 5.3, 6.2, y 6.3 para obtener un mayor número de embriones fertilizados. </li><li> Permita que los embriones fertilizados se desarrollen. Utilice un microscopio de disección con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de escisión para garantizar la fertilización con éxito, como se describe anteriormente para la fertilización 17 y puesta en escena 18. </li></ol>

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Los autores no tienen intereses financieros en competencia.

El protocolo anterior es para la manipulación de productos génicos antes de la fertilización, lo que permite el estudio de los productos génicos maternos en el embrión de pez cebra temprano. Estudios anteriores han sido capaces de madurar los ovocitos in vitro 4; este protocolo se modificó para permitir la fertilización subsiguiente in vitro de ovocitos 8 madurado. Esto a su vez permite la inyección de reactivos para la manipulación funcional y visualización de los productos de herencia materna en el embrión temprano 3. Los embriones resultantes de este método pueden ser viables y pueden sobrevivir a convertirse en adultos fértiles. En experimentos preliminares, aproximadamente la mitad de los embriones fertilizados derivados de este procedimiento eran viables en el día 5 de desarrollo, tal como se evaluó por la inflación vejiga natatoria en esa etapa, alrededor de la mitad de los cuales se convirtió, adultos fértiles (observaciones no publicadas) sanos. Hay un numeropasos de críticos a considerar en el protocolo. Los ovocitos en la etapa apropiada para iniciar la maduración (a principios de la etapa IV) puede ser enriquecido si la hembra se ha acoplado recientemente, pero no antes de 8 dpp. El uso de pescado que no se han apareado recientemente podría resultar en la degeneración huevos 14, que no serán sometidos a maduración. Hembras apareadas en menos de 8 días tendrán una mayoría de los huevos en la etapa III o menos, y por lo tanto, los huevos no maduran correctamente in vitro. Ovarios en las hembras que se aparearon 8 días antes tendrán una fracción óptima de los ovocitos a principios de la etapa IV. Estos pueden ser reconocidos por su opacidad y la presencia de la GV en una posición excéntrica (Figura 2B). Determinación etapa de ovocitos también puede ser ayudado por la medida del tamaño, con los ovocitos colocan en un portaobjetos de micrómetro graduado bajo un microscopio y se compararon con las directrices de estadificación estándar (Tabla 1). Sin embargo, los oocitos IV etapa temprana tienen un tamaño casi máxima en comparación con madurarovocitos (reconocidos por su relativa transparencia y la ausencia de una GV; Figura 2C) y se reconocen fácilmente, como se describió anteriormente, que evita generalmente la necesidad de una medición directa del tamaño de los ovocitos. La maduración in vitro debe comenzar dentro de varias horas de la final del ciclo de la luz del día a la que se aclimataron los donantes de ovocitos femeninos. Ovocitos no maduran correctamente, se refleja en las tasas de fertilización pobres, si se cultivan durante el período de la mañana del ciclo de luz. La razón de la dependencia circadiano del método de la maduración de ovocitos in vitro no se entiende pero probablemente refleja sesgos circadianos subyacentes en in vivo la maduración del óvulo que implican ciclismo la expresión génica durante la ovogénesis 21. Una causa común de ovocitos que fallan a someterse éxito en la maduración in vitro, a pesar de estadificación ovocito adecuado es que el DHP ha expirado. la hormona DHP expira generalmente después de un año, y para asegurar el efectoive la maduración, el lote de trabajo debe ser sustituido dentro de 9 meses de uso. La inyección de ovocitos es otro paso crítico cuando el propósito del método es la manipulación funcional de los productos maternas. Este procedimiento tiene requisitos que difieren de aquellos para las inyecciones estándar en el huevo fertilizado en 0-30 MPF. Un factor clave en la inyección de ovocitos es la necesidad de llevar a cabo las inyecciones en condiciones que no conducen a la activación prematura de huevo, como en medio L-15 de Leibovitz 22, 23. Porque están incrustadas en los ovarios, oocitos con vencimiento también plantean retos particulares a la inyección. El protocolo anterior sugiere primera disociar ovocitos de los ovarios y manteniendo cada disociado ovocito por separado con fórceps mientras se inyecta. Esta técnica ha funcionado bien y permite ovocitos de preclasificación en la fase adecuada con una manipulación mínima. Los métodos alternativos también pueden ser utilizados, talescomo: i) la colocación de los ovocitos en la inyección estándar artesas de agarosa 15, donde las paredes verticales del soporte de la cubeta el ovocito durante la inyección (en este método alternativo, los oocitos necesitan ser transferida a placas de inyección mientras mantienen en medio de maduración in vitro) y ii ) permitiendo que los ovocitos a permanecer unidos a la masa ovárica, que puede ser sostenido con el fórceps durante la inyección para evitar el contacto con el ovocito inyectado (en este enfoque, los oocitos deben ser disociados después de la inyección tanto para facilitar la exposición DHP y para permitir su defolliculation , sí esencial para la fertilización in vitro). A pesar de este desafío específico, los ovocitos en etapa IV puede ser penetrado fácilmente con una aguja de inyección, probablemente porque la membrana coriónica en esta etapa no está completamente desarrollado 9. Una limitación del protocolo de maduración actual es que en condiciones de maduración in vitro que promueven el desarrollo adecuado de ovocitosno puede ser creada cuando la maduración de ovocitos se inicia en las primeras etapas de la etapa IV. Los ovocitos se convierten en competentes para responder a DHP por sometidos a maduración cuando alcanzan un diámetro de 520 micras, que se produce durante la etapa III (vitelogénesis, que corresponde a la gama de 340 a 690-m) 9. Sin embargo, el cultivo de la etapa III ovocitos resultados en oocitos que no son competentes para la fecundación 3. Sólo ovocitos cuyo cultivo in vitro se inicia en la etapa IV (Figura 2B) puede convertirse en, ovocitos etapa V maduros (Figura 2C y D). Esto puede estar relacionado con el hecho de que la etapa III es esencial para la vitelogénesis y ovocito crecimiento 9. Por lo tanto, el procedimiento de maduración de ovocitos in vitro en presentado en este artículo sólo se debe utilizar con una población de partida de la etapa IV ovocitos (B), y no con los oocitos en las etapas anteriores (etapas I - III; Figur e <strong&gt; 2A). Por la misma razón, este procedimiento está limitado a genes que se expresan en la etapa IV o posterior. La manipulación funcional de genes cuyos productos están expresadas anteriormente puede en lugar de tener que depender de métodos genéticos (véase más adelante). Las mejoras a los métodos de cultivo in vitro de maduración pueden en el futuro permitir la iniciación de cultivo de ovocitos en etapas anteriores, ampliando así el poder del enfoque de la maduración in vitro. Otra limitación en el método presentado es que defolliculation, que es esencial para las etapas ulteriores que implican la fertilización, es actualmente un paso limitante de la velocidad en el procedimiento. La membrana folicular es una capa transparente que rodea el ovocito en desarrollo, y la eliminación puede ser tedioso. Si esta membrana no se elimina por completo, el huevo no será plenamente activado y fertilizado. Esto se hace evidente por el hecho de que el corion para expandir y el desarrollo de irregularmente colocado, surco-como structures (pseudocleavages), típico de los embriones fertilizados 11. Métodos defolliculation enzimáticos tales como colagenasa, como se usa en Xenopus, se han intentado. Sin embargo, en nuestras manos, esta técnica no ha tenido éxito, y por lo tanto depender de defolliculation manual. Debido defolliculation manual es laborioso y consume mucho tiempo, es difícil obtener grandes lotes de huevos fertilizados después de la maduración in vitro de ovocitos. Debido a la limitación temporal impuesta por defolliculation manual, que actualmente fertilizamos unos pocos, los huevos maduros desfolicularon a la vez, en lotes pequeños de 5-10 huevos. La incorporación de defolliculation enzimática con este procedimiento aumentaría probablemente de manera significativa su rendimiento y la facilidad de uso general. Aunque los embriones producidos después de la fertilización de ovocitos -matured in vitro pueden convertirse en adultos viables, observamos que después de la fertilización in vitro, una fracción de los embriones hacer<html> No dividir normalmente o en el momento oportuno. Actualmente estamos seleccionando para líneas cuya propagación incluye rondas de maduración in vitro de ovocitos en, que pueden resultar en patrones más robustas de desarrollo en embriones derivados a través de este método. El procedimiento ha permitido para el rescate claro o visualización de la localización de proteínas para un número de mutaciones 24, 25. Sin embargo, para algunos genes, la regulación de la expresión del producto puede ser crucial, por lo que los productos expresados por el ARNm inyectado puede conducir a resultados variables 26. También es importante ser consciente de todos los controles (por ejemplo, embriones inyectados con reactivos que tienen propiedades similares a los utilizados en el experimento sin embargo se prevé que no producir un efecto, como OMs de control o ARN que codifican para las proteínas inertes solamente, tales como GFP), como la variabilidad subyacente puede llevar a conclusiones incorrectas. nt &quot;&gt; Un enfoque implica manipulación in vitro, seguido de la fertilización es particularmente útil en el caso de productos maternalmente depositados, donde el método estándar de la inyección de ARN, OMs, o proteína en el huevo fertilizado puede no reducir efectivamente productos ya acumulados en el huevo. otros métodos desarrollados recientemente, tales como la generación de CRISPR-mutante, también son eficaces en la generación de condiciones de mutantes de los genes expresados por vía materna 26. Sin embargo, este método requiere el crecimiento de varias generaciones de pescado. la técnica de la maduración de ovocitos in vitro permite la manipulación funcional rápida a estudiar la función de los genes expresados ​​por vía materna, incluyendo el rescate y phenocopy de mutaciones materno-efecto, así como la expresión de ARN y proteínas en el embrión temprano.

Durante el desarrollo animal, los depósitos madre productos génicos (por ejemplo, ARN, proteínas, y otras biomoléculas) en el huevo; estos productos son importantes para los procesos celulares tempranos inmediatamente después de la fertilización 1, 2. La manipulación de la expresión y función de los productos materna es típicamente ineficaces cuando se utiliza un enfoque estándar para la inyección de los reactivos en huevos fertilizados 3. Esto es porque la mayoría de los ARN y proteínas son producidas por el ovocito durante la ovogénesis, lo que los productos maternas precargados ya están presentes en el huevo maduro. Tales productos preexistentes son impermeables a la caída funcional, con agentes de genes de orientación, tales como oligos antisentido de morfolino (MOS), porque OMs se dirigen a los ARNm, no la proteína preexistente ya presente en el huevo en la fertilización. Además, muchos procesos embrionarios tempranos ocurren demasiado pronto después de la fertilización que se influenced por los productos de proteínas derivadas de ARN se inyecta en el huevo fertilizado, que el ARN no puede producir suficientemente rápido como para influir en los primeros eventos de la embriogénesis. Por la misma razón, etiquetado fusiones de proteínas expresadas a través de una inyección de ARNm en el óvulo fertilizado no se pueden producir en el tiempo para la visualización durante su papel activo en el embrión temprano. La inyección en ovocitos maduros extruidos antes de la activación del huevo es posible, pero se asocia con problemas técnicos similares: dichos huevos maduros se ya pre-cargado con proteína materna, y no se convertirá en traslación activo (es decir, producir la proteína de las transcripciones exógenos) hasta después de huevo activación. Por estas razones, la manipulación de los productos de los genes maternos que actúan en la embriogénesis temprana por lo general tiene que ser llevado a cabo durante la ovogénesis en el ovocito maduro. Como un enfoque para superar estos obstáculos, en los métodos de maduración in vitro, que permiten la maduración de OOCytes de la etapa IV a la formación del huevo, se han establecido en el pez cebra. Los primeros métodos permiten la maduración in vitro, pero los huevos maduros resultantes no eran competentes para la fertilización 4. Posteriormente, la manipulación de las condiciones de cultivo de neutro a pH 9,0, imitando el pH alcalino del fluido de ovario encontrado en especies de peces 5, 6, permitido para la fertilización fiable in vitro (FIV) después de la maduración in vitro 7, 8. De hecho, en vitro ovocitos -matured pueden producir embriones viables que sobreviven a la edad adulta y que son fértiles 3, 8. Este método mejorado se ha adaptado adicionalmente para incluir la manipulación funcional de genes maternos, la expresión de proteínas etiquetadas durante la ovogénesis pez cebra través de la expresión exógena, y MO mediada funcional derribar en esteraetapa urante IV ovocitos 3 (figura 1). Ovogénesis pez cebra presenta una serie de etapas características que conducen a la formación de ovocitos maduros 9 (véase la Tabla 1 para una guía rápida de las diversas etapas en la ovogénesis). En pocas palabras, el desarrollo de los ovocitos se inicia por los ovocitos en estadio I y está detenido en la etapa diplotena de la profase I de la meiosis. Estos ovocitos se someten a crecimiento a través de la transcripción activo (iniciado durante los estadios IA y IB), la formación de alvéolos corticales (también conocido como gránulos corticales, iniciadas durante la etapa II), y la vitelogénesis (iniciado durante la etapa III). crecimiento de los ovocitos se completa durante la etapa IV, cuando meiosis I hojas de vida, lo que resulta en el desmontaje del núcleo de ovocitos, referido como la vesícula germinal (GV). Posteriormente, la meiosis es detenido de nuevo en la metafase II. La finalización de crecimiento de los ovocitos y detención meiótica durante la etapa IV conduce a una etapa de madurez V por ejemplo,g 9. La eliminación de la membrana folicular se produce durante la liberación del ovocito en el lumen del ovario 10 y es esencial para la fertilización y la activación del huevo apropiado. Una vez que los huevos son extruidos de la madre durante el apareamiento natural, que se activan. En el pez cebra, la exposición a agua es suficiente para la activación del huevo completo, independientemente de la presencia de espermatozoides 11. En condiciones in vitro permiten actualmente para la maduración de ovocitos de etapa temprana IV-que puede ser reconocido por su tamaño (690-730 m), la presencia de un gran GV en una posición asimétrica, y un aspecto totalmente opaco debido a la acumulación de proteínas de la yema (Figura 2B): para el huevo etapa V madura, caracterizado por un GV totalmente desmontada y una apariencia translúcida debido a la yema de procesamiento de la proteína 12 (Figura 2C). En este enfoque, los ovarios enteros contovocitos aining en diferentes etapas de desarrollo se retiran de las hembras. Los ovocitos se les permite desarrollar en 17α-20β-dihidroxi-4 pregnen-3-ona (DHP), un eficaz hormona maduración inductor de 8. Durante este período, los ovocitos de maduración se pueden manipular a través de la inyección de expresión (por ejemplo, capsulado, in vitro -transcribed mRNAs) o agentes inversa genética (por ejemplo, MOS). La capa folicular no arroja espontáneamente hacia el final del período de maduración, por lo que se debe retirar manualmente. Después de defolliculation, la fertilización in vitro se consigue mediante la activación de la activación del huevo a través de la exposición de los huevos a agua (presente en medio embrionario (E3)) 13 y una solución de esperma. Los zigotos resultantes experimentan un desarrollo embrionario y permiten la evaluación de la capacidad de los tratamientos para manipular la función del gen de la madre y para la visualización y análisis de los productos etiquetados maternas ( <strong&gt; Figura 3).

<table><tbody><tr><td>Cajas de apareamiento de pez cebra</td><td>Aqua Schwarz</td><td>SpawningBox1</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S3264</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>MgSO2-7H2O</td><td>Sigma</td><td>63138</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO2</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Western Chemical</td><td>Tricaine-D (MS 222)</td><td>Aprobado por la FDA (ANADA 200-226)</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Sigma</td><td>77-86-1</td><td>para preparar 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>920-1</td><td>para preparar 1 M Tris pH 9.0</td></tr><tr><td>Red de pesca (malla fina) (4 - 5 in)</td><td>PennPlax</td><td>(ThatFishThatPlace # 212370)</td><td>disponible en ThatFishThatPlace</td></tr><tr><td>Cuchara</td><td></td><td></td> de plástico <td>disponible en la mayoría de las tiendas estándar</td></tr><tr><td>Tijeras de disección</td><td>Fine Science Tools</td><td>14091-09</td><td></td></tr><tr><td>Pinza de disección</td><td>Dumont</td><td>SS</td><td>disponible en Fine Science Tools</td></tr><tr><td>Estereoscopio de disección (con fuente de luz transmitida)</td><td>Nikon</td><td>SMZ645</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Fuente de luz reflectante (brazos LED)</td><td>Fostec</td><td>KL1600 LED</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Placas de Petri de 10 cm de diámetro</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf 1,5 mL</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Cubo</td><td></td><td></td> <td>de hielocualquier fabricante</td></tr><tr><td>Espátula estrecha</td><td>Fisher</td><td>14-374</td><td></td></tr><tr><td>Placa de vidrio de depresión</td><td>Corning Inc</td><td>722085 (Fisher cat. Nº 13-748B)</td><td>disponible en Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Toallas de papel de</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Kimberly-Clark</td><td>06-666-11</td><td>disponible en Fisher</td></tr><tr><td>Scientific Timer cronómetro</td><td></td><td></td><td>de cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Botella de lavado</td><td>Thermo Scientific</td><td>24020500</td><td>disponible en Fisher</td></tr><tr><td>Scientific vasos de precipitados, 250 mL (2)</td><td>Corning Inc. </td><td>1000250</td><td>disponible en Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Leibovitz'z L-15 medio</td><td>Thermofisher</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>NaOH&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>221465</td><td>para el pH</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP)</td><td>Sigma</td><td>P6285</td><td></td></tr><tr><td>gentamicina</td><td>Sigma</td><td>G1272</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de inyección</td><td>Eppendorf</td><td>FemtoJet</td><td>o equivalente</td></tr><tr><td>Tubo capilar para agujas de inyección</td><td>FHC</td><td>30-30-1</td><td>o equivalente, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID con fibra, 100 mm</td></tr><tr><td>Extractor de aguja</td><td>Sutter Instruments</td><td>Modelo P-87</td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Micropipetor (1 - 20 &micro; Gama L) con puntas</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Micropipetor (20 - 200 y micro; Gama L) con puntas</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Micropipetor (100 - 1000 y micro; Gama L) con puntas</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Tubos cónicos 15 mL</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Tubos cónicos 50 mL cualquier</td><td></td><td></td><td>fabricante</td></tr><tr><td>pipeta de plástico 10 mL con bombilla</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>pipeta de plástico 20 mL con bombilla</td><td></td><td></td><td>cualquier fabricante</td></tr><tr><td>Etapa de microscopio Portaobjetos de calibración 0,01 mm</td><td>AmScope</td><td>MR095</td><td>o </td></tr><tr><td>Reactivos equivalentes para agua de pescado:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean Salt Drs</td><td>. Foster & Smith</td><td>&nbsp; CD-116528</td><td></td></tr><tr><td>Bicarbonato de sodio (cultivo celular probado)</td><td>Sigma</td><td>S5761-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Reactivos para E3 medio:</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2, dihidratado</td><td>Sigma</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4, heptahidrato</td><td>Sigma</td><td>63138-250G</td><td></td></tr><tr><td>Azul de metileno</td><td>Sigma</td><td>M9140-25G</td><td></td></tr><tr><td>Alimento para peces:</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Camarones en salmuera congelados Camarones</td> en <td>salmuera directos</td><td>FBSFKG50</td><td></td></tr><tr><td>Copos de Tetramin</td><td>Drs. Foster & Herrero</td><td>16623</td><td></td></tr></tbody></table>

la manipulación de genes maternos funcional de productos que utilizan<em&gt; in vitro</em&gt; la maduración de ovocitos en el pez cebra

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

eventos celulares que tienen lugar durante las primeras etapas del desarrollo embrionario de los animales son conducidos por los productos de genes derivados de la madre depositados en el oocito en desarrollo. Debido a que estos eventos se basan en productos maternas que normalmente actúan muy poco después de la fertilización, que preexisten en el interior del huevo, los enfoques estándar para la expresión y la reducción funcional que implican la inyección de reactivos en el óvulo fertilizado no suelen ser efectivas. En su lugar, estas manipulaciones deben realizarse durante la ovogénesis, antes o durante la acumulación de productos maternos. Este artículo describe en detalle un protocolo para la maduración in vitro de oocitos inmaduros de pez cebra y su posterior fertilización in vitro, produciendo embriones viables que sobreviven a la edad adulta. Este método permite la manipulación funcional de los productos maternas durante la ovogénesis, tales como la expresión de productos para el rescate fenotípico y visualización constructo etiquetado, así como unaS La reducción de la función de genes a través de agentes de genética inversa.

Para determinar si el procedimiento descrito anteriormente tiene éxito, los embriones pueden ser observados durante las etapas de escisión para confirmar la aparición del patrón de escisión temprana-embrionario estereotipada 18, así como a las 24 h después de la fertilización (hpf) para confirmar el correcto desarrollo del plan básico del cuerpo. Este procedimiento permite la manipulación de productos maternos para estudios funcionales a través de la inyección de los reactivos, tales como ARNm y Mos, durante el desarrollo de ovocitos. La manipulación de productos maternos para estudios funcionales: codificación de ARNm para de tipo salvaje y productos mutados se puede inyectar en oocitos madurados in vitro para probar el efecto de la manipulación de la función de genes materna durante la meiosis y las primeras etapas embrionarias. Por ejemplo, los embriones de tipo salvaje pueden ser inyectados con wimRNA de tipo ld para poner a prueba el efecto de la sobreexpresión del producto, o con el ARN mutante a prueba para potenciales (por ejemplo, de ganancia de función y antimorphic) efectos dominantes en estos procesos. Los ovocitos en cultivo in vitro son capaces de producir la proteína a partir de ARNm exógeno en todo el desarrollo de oocitos, como se muestra por la expresión de GFP a partir del ARNm inyectado, aunque sólo ovocitos que inician condiciones de cultivo en la etapa IV de la ovogénesis pueden desarrollar en oocitos de fase V maduros (Figura 2B -2D, consulta Nair et al. 3). La expresión del producto de tipo salvaje a través de mRNA inyectado también es instrumental para el rescate de mutaciones materno-efecto para confirmar la identidad de genes durante la clonación posicional 3, 24. En este caso, el ARNm de tipo salvaje se inyecta en ovocitos de hembras mutantes homocigotos para probar si los productos de tipo salvaje pueden rescatar el fenotipo mutante. Este rescate genético se ilustra en &lt;strong&gt; Figura 3A-3C, la inyección AurB mRNA se muestra para rescatar a los efectos fenotípicos de una mutación en su correspondiente gen, isla celular (CEI) (Figura 3A-3C). Los embriones de un grupo de control también se les permite desarrollar para mostrar el fenotipo mutante correspondiente 3. ARN mutantes también se puede inyectar en oocitos de mutantes para probar si el producto mutado retiene la función parcial mediante la comparación de la medida de rescate a la causada por el producto de tipo salvaje. La expresión de proteína a partir del ARNm inyectado en oocitos en desarrollo parece ocurrir con poca o ninguna demora. Expresión de GFP fuerte se observa dentro de 2 h de la inyección del ARNm correspondiente, independientemente de la etapa de desarrollo del oocito 3 (Figura 2B-2D; ver también Nair et al. 3). Los productos tales como: mCherrySAS6 y Birc5b (Motley): GFP se puede observar inmediatamente después de la fecundación y durante el primer ciclo celular embrionario 3, 25. La inyección de ARNm durante la ovogénesis también conduce a la producción de la proteína que, independientemente de la fracción de etiquetado fusionado, es funcional inmediatamente después de la fertilización, como se muestra en el caso de productos maternos para la isla celular / aurB 3, ciclo fútil / LRMP 24, y Motley / bir5b 25. Traducción de bloqueo de OM también tienen un efecto inmediato después de la fecundación, como se muestra por ciclo fútil / LRMP 3 y en etapas posteriores de la embriogénesis, como en el caso de la misión imposible / dhx16 3. Splice de bloqueo de MOS, cuando se inyectan en oocitos de maduración, no puede tener un efecto sobre la función materna, probablemente ya presentes transcripciones maternas maduras debido en ovocitos en estadio IV &lt;sup class = &quot;xref&quot;&gt; 3. Generación de morphants: Cuando se utiliza un MO correspondiente a un gen con una mutación ya identificados-, se espera que el fenotipo morphant para imitar el fenotipo mutante. Morphants se comparan con los embriones no inyectados y para los inyectados con un estándar, control MO. La inyección de un morfolino traducción de bloqueo puede phenocopy éxito el conocido fenotipo mutante 3, como se muestra por la inyección de LRMP MO en oocitos, que imita el fenotipo mutante de la mutación correspondiente, inútil ciclo (Figura 3D-F). La especificidad de OMs se puede determinar a través de los mismos métodos utilizados al inyectar OMs en embriones (revisado anteriormente) 19, 20. Expresión de proteínas de fusión marcadas con fluorescencia: ARNm que codifica productos génicos de interés fusionada a las proteínas fluorescentes (por ejemplo, GFP y mCherry) también se puede inyectar en ya sea de tipo salvaje o ovocitos mutantes para visualizar los productos correspondientes en el embrión temprano (es decir, lo que refleja un patrón de localización subcelular; Figura 3G y 3H). los ARNm que codifican las fusiones similares, pero que implican el alelo mutante pueden expresarse de manera similar para probar si la mutación afecta a cualquier potenciales localizaciones subcelulares. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig1.jpg" /> Figura 1: In Vitro maduración de ovocitos. Diagrama esquemático que muestra las diversas etapas implicadas en la maduración in vitro de ovocitos en. Las hembras adultas son pre-seleccionados para la puesta de huevos 8 días antes del procedimiento, a depurarlos de huevos que ya han madurado y a ProMote desarrollo de nuevos ovocitos. Los ovarios, que contiene los ovocitos en desarrollo, se retiran de las hembras y se transfieren a un medio que contiene el DHP hormona para inducir la maduración de ovocitos in vitro. Después de la eliminación de las hembras e inmediatamente antes de o durante la maduración de ovocitos, los ovocitos pueden ser inyectados con productos de ARN y otros reactivos para la manipulación funcional de factores maternos. Ovocitos maduros se desfolicularon manualmente y fertilizados in vitro con una solución de esperma para producir, embriones viables fertilizados. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig2.jpg" /> Figura 2: In Vitro maduración de ovocitos y expresión de productos a partir del ARNm inyectado. (A) Los oocitos en las etapas I-III, observados en los ovarios dehembras 4 días post-purga (dpp). (B) los ovocitos en la etapa IV, se observa en los ovarios de las hembras 8 dpp. La vesícula germinal (GV, punta de flecha) es claramente visible y ocupa una posición excéntrica. La etapa III ovocitos en (A) también presentan una GV fácilmente evidente, pero se encuentra centrado en el ovocito. Ovocitos en estadio IV en (B) tienen un tamaño que es casi máxima en comparación con la de oocitos maduros en (C). (C y D) los ovocitos en la etapa V (madurar los ovocitos) después de 2 h en condiciones de maduración in vitro iniciadas en la etapa IV, como en (B), e inyectados durante la maduración con GFP-codificación, in vitro ARNm transcrito (C, la luz visible solamente; D, superposición de la luz visible y de fluorescencia GFP). El GV ya no es aparente en ovocitos V de la etapa, que también son menos opaco de ovocitos en estadio IV. Los oocitos inyectados expresan la proteína GFP (D). Defolliculation de ovocitos en estadio IV maduros es described en la sección de protocolo. Barra de escala = 300 m. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55213/55213fig3.jpg" /> Figura 3: manipulación y visualización de los productos maternos a través de In Vitro maduración de ovocitos. (A - C) Rescate del fenotipo materno-efecto causado por una mutación en isla celular / Aurora B a través de la inyección de tipo salvaje aurB ARNm en estadio IV CEI ovocitos / aurB. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 65 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-ß-catenina para resaltar las membranas (verde), anticuerpos anti-alfa-tubulina para indicar los microtúbulos (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (A) la acumulación de β-catenina en embriones de tipo salvaje, indicativa de maduración surco normal. (B) A cei / aurB embrión de un CEI / aurB etapa IV ovocitos sin inyectar muestra surcos parciales, rudimentarios que no acumulan β-catenina. (C) A cei rescatado / aurB embrión a partir de un oocito cei / aurB inyectado con el tipo salvaje aurB mRNA que muestra robusto acumulación β-catenina en los surcos. (D - F) fenocopia de la materno-efecto causado por una mutación en ciclo fútil / LRMP de la inyección de LRMP morfolino en etapa IV ovocitos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 70 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para indicar centrosomas (rojo) y DAPI para designar ADN (azul). (D) En los embriones de tipo salvaje, cada uno asociados núcleo con γ-tubulina, un marcador para el material centrosomal. (E) En materno-efecto mutantes FUE, la fusión pronuclear falla, lo que resulta en dos a tres parches de etiquetas de ADN correspondientes a no fusionadas pro-núcleos de los padres y el cuerpo polar para meiosis II. (F) En morphants LRMP, donde se inhibe la función LRMP materna, los núcleos de manera similar fallan para dividir y, además, fallan en la unión con γ-tubulina. (G y H) Visualización de producto producido por vía materna en el embrión temprano. proteína Sass6-mCherry partir de ARNm exógeno inyecta en etapa IV ovocitos se localiza en los centriolos. imágenes fusionadas que muestran vistas animales de 40 blastodiscs fijos MPF, visualizados con anticuerpos anti-gamma-tubulina para resaltar centrosomas (verde), fluorescencia mCherry para indicar Sass6 (rojo), y DAPI para designar ADN (azul). (G) proteína expresada Sass6-mCherry localiza a focos etiquetado por el centrosoma marcadores γ-tubulina en los sitios que flanquean el núcleo (flechas). (H </strong&gt;) La misma imagen, mostrando sólo Sass6-mCherry y DAPI para mayor claridad. Los embriones en (G y H) son fijos, pero la fluorescencia de los productos expresados, tales como fusiones mCherry, también pueden ser observados en embriones vivos (no mostrados). Barra de escala = 100 m de AF y 10 micras en G y H. Todos los paneles se reprodujeron, con autorización, de Nair et al 3. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55213/55213fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Etapas de Ovogénesis </td><td> Diámetro de ovocitos (m) </td><td> Hito clave (s) </td></tr><tr><td> 1A - Prefollicle </td><td> 7 a 20 </td><td> Iniciación de la transcripción activa, la acumulación de nucleolos </td></tr><tr><td> 1B - Folículo </strong&gt; </td><td> 20 a 140 </td><td> Descondensación de los cromosomas </td></tr><tr><td> II - alveolo cortical </td><td> 140-340 </td><td> la producción de alvéolos corticales </td></tr><tr><td> III - La vitelogénesis </td><td> 340-690 </td><td> Oscurecimiento de ooplasma por la acumulación de yema de la proteína precursora y lípidos </td></tr><tr><td> Early IV - maduración de ovocitos </td><td> 690-730 (rango inferior) </td><td> localización asimétrica de vesícula germinal </td></tr><tr><td> Early IV - maduración de ovocitos </td><td> 690-730 (rango superior) </td><td> vesícula germinal desaparece, la detención en metafase II </td></tr><tr><td> V - ovocito maduro </td><td> ~ 750 </td><td> Ooplasma / yema se hace translúcida </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Señales de desarrollo de los ovocitos en Zebrapescado.

Un protocolo optimizado para la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra utilizados para la manipulación de los productos génicos maternos se presenta aquí.

La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de ovocitos en el pez cebra

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

El objetivo general de este protocolo es llevar a cabo la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra y, si se desea, manipular funcionalmente los productos génicos maternos antes de la fertilización. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología del desarrollo, relacionadas con la importancia de la contribución materna al embrión. La principal ventaja de esta técnica es la posibilidad de cultivar ovocitos in vitro, seguido de la fertilización y la producción de embriones viables.Y, si se desea, permite la manipulación funcional de los productos génicos maternos que actúan en el embrión temprano inmediatamente después de la fertilización. Para comenzar, ocho a diez días antes de la manipulación mediante cultivo in vitro, utilice una red para transferir varios pares formados por un pez macho y un pez hembra de la cepa deseada a un tanque de apareamiento. Deje los peces en el tanque de apareamiento durante la noche.Después de permitir que los peces se reproduzcan hasta la tarde siguiente, use una red para separar a las hembras que produzcan huevos durante el apareamiento y colóquelas en un tanque aparte. Alimente a estas hembras dos veces al día con una mezcla de alimento que contenga aproximadamente una cantidad igual de camarones de salmuera y escamas de alimento para peces. En condiciones estériles, agregue 20 mililitros de medio Leibovitz L-15 con l-glutamina, pH 7.0, a un tubo cónico de 50 mililitros.Luego, utilice 10 de hidróxido de sodio normal para ajustarlo a pH 9,0. Añada 9 mililitros del medio L-15 a dos tubos cónicos separados de 50 mililitros. A continuación, etiquete un tubo como DHP y el otro como DHP.En el tubo de DHP, agregue 10 microlitros de DHP, 490 microlitros de DH2O y 500 microlitros de BSA al 10 %. En el tubo de DHP, agregue 100 microlitros de gentamicina al 10 miligramos por mililitro, 400 microlitros de DH2O y 500 microlitros de BSA al 10 %. Para realizar la disección de ovocitos, comience preparando una solución stock de tricaina al 0,2 % en DH2O, tamponada a pH 7,0 con tris 1 molar a pH 9,0.Mantenga esta solución a 4 grados Celsius. De cero a cuatro horas antes del final del ciclo de luz diaria en el establecimiento, en un vaso de precipitados de 250 mililitros, agregue 20 mililitros de la solución stock de tricaina al 0,2 %, pH 7,0, a 80 mililitros de agua para peces y mezcle. Es fundamental iniciar el procedimiento dentro de las cuatro horas posteriores al final del ciclo de luz diurna al que están acostumbrados los peces.De lo contrario, los ovocitos no madurarán adecuadamente. Con una cuchara, recolecte los peces sacrificados de la solución de tricaina y enjuáguelos brevemente con agua para peces. Luego, coloque los peces sobre una toalla de papel para absorber el exceso de agua.Utilice una cuchilla limpia para decapitar el pez sacrificado a la altura de la aleta pectoral. Luego, con tijeras de disección, realice una incisión longitudinal en el lado ventral del pez, extendiéndose desde el extremo anterior hasta la zona anal. Coloque el pez en una placa de Petri bajo un microscopio estereoscópico con luz incidente.Luego, utilizando un par de pinzas de disección, aísle porciones del ovario y transfiera el tejido a una placa de cultivo de 35 por 10 milímetros, que contenga cuatro mililitros de medio Leibovitz L-15, DHP. Ahora, con las pinzas de disección, disocie suavemente los ovocitos de la masa folicular. Seleccione los ovocitos en estadio temprano cuatro, que se encuentran casi en tamaño máximo y se caracterizan por un citoplasma oscuro y opaco, y una vesícula germinativa, o GV, claramente visible, ubicada de forma asimétrica dentro del ovocito.Deseche los ovocitos en estadios tempranos y los huevos maduros translúcidos en estadio 5. Utilice una pipeta de Pasteur de vidrio para transferir los ovocitos en estadio temprano cuatro a un segundo plato de cultivo plástico de 35 por 10 milímetros, que contenga cuatro mililitros del medio de Leibovitz L-15, más DHP. Transfiera cantidades mínimas del medio sin DHP al plato que contiene la solución con DHP.Si se inyecta ARNm, inmediatamente antes de la inyección, utilice agua de ósmosis inversa de grado para ARN y cloruro de potasio 0,2 molar para diluir el ARNm hasta una solución final de cloruro de potasio 0,1 molar. Si se inyectan Morpholinos, o MOs, inmediatamente antes de la inyección, diluya los MOs hasta la concentración deseada utilizando agua de ósmosis inversa de grado para ARN y cloruro de potasio 0,2 molar, para obtener una concentración final de cloruro de potasio 0,1 molar. Luego, para realizar la inyección, sostenga manualmente los ovocitos con pinzas finas y, utilizando una aguja hecha con una pipeta capilar de vidrio estirada, inyecte aproximadamente un nanolitro en ovocitos de tipo salvaje en la etapa cuatro.Continúe incubando los ovocitos inmaduros e inyectados en medio DHP a 26,5 grados Celsius. Revise aproximadamente cada 30 minutos para asegurarse de que los ovocitos permanezcan íntegros y estén experimentando una maduración adecuada, volviéndose progresivamente translúcidos. Utilice una pipeta Pasteur para eliminar los ovocitos que estén lisándose.Y deséchelos en un vaso de precipitados para residuos de laboratorio, para mantener la calidad del medio. Con aproximadamente la mitad del volumen de medio DHP fresco, cambie el medio de cultivo para mantener una solución clara, según la cantidad de lisis de ovocitos. Cuando la mayoría de los ovocitos se hayan vuelto translúcidos y tengan un núcleo germinal (GV) que ya no sea visible, use pinzas extrafinas para hacer un desgarro en la membrana folicular, en una región con mayor espacio entre el ovocito y la membrana.Desprenda una porción de la membrana y, mientras sostiene la porción desprendida, enrolle el ovocito fuera de la membrana. Otro paso crítico es la eliminación de la membrana folicular. Si esta capa no se elimina completamente, la fertilización y la expansión del corion se verán obstaculizadas.Transfiera los ovocitos defoliculados en un volumen mínimo de medio a una placa de Petri con unas gotas de medio de cultivo DHP, y proceda a la fertilización. Cerca del final del paso de maduración de los ovocitos y antes de la defoliculación, prepare una solución de espermatozoides utilizando testículos de cinco machos en 500 microlitros de solución de Hank's. Añada de 10 a 50 microlitros de la solución de espermatozoides a los ovocitos defoliculados en medio de cultivo DHP.Luego, espere 10 segundos. Usando una pipeta, agregue unas gotas de medio E3 a los ovocitos. Espere un minuto y luego inunde la placa con medio E3.Después de permitir que los embriones fertilizados se desarrollen, utilice un microscopio estereoscópico con óptica de luz transmitida para observar la progresión a través de las etapas de segmentación y asegurar una fertilización exitosa, tal como se describió previamente para la fertilización y la determinación de etapas. Tal como se observa por la expresión de GFP, los ovocitos procedentes de cultivo in vitro son capaces de producir proteínas a partir de ARNm exógeno durante todo el desarrollo del ovocito en tan solo dos horas. Sin embargo, solo los ovocitos que inician las condiciones de cultivo en la etapa cuatro de la ovogénesis pueden desarrollarse hasta convertirse en ovocitos maduros de etapa cinco.En este experimento, el ARNm de aurora B de tipo silvestre inyectado rescata los efectos fenotípicos de una mutación en su gen correspondiente, cellular island. A los embriones de un grupo control también se les permite desarrollarse para mostrar el fenotipo mutante correspondiente. La inyección de un Morpholino que bloquea la traducción puede fenocopiar con éxito el fenotipo mutante conocido, como se muestra mediante la inyección de lrmp-MO en ovocitos, que imita el fenotipo mutante de la mutación correspondiente futile cycle.El ARN mensajero codificante también puede inyectarse en ovocitos de tipo silvestre o mutantes para visualizar los productos correspondientes en el embrión temprano. Por ejemplo, como se observa aquí, la proteína Sass6-mCherry se localiza en focos marcados por el marcador de centrosoma tubulina gamma. Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en aproximadamente de 5 a 6 horas, si se lleva a cabo correctamente.Al realizar este procedimiento, es importante recordar no apresurarse y permitir una maduración adecuada de los ovocitos antes de la defoliculación y la fertilización. Después de este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la fijación de embriones, para responder preguntas adicionales, tales como el rescate de su gen de interés o la localización de ARN o proteínas.Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la embriogénesis temprana exploraran la contribución de los productos génicos maternos en el pez cebra. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo manipular funcionalmente los productos génicos maternos mediante la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Developmental Biology

Biología del Desarrollo

Este vídeo muestra cómo morfolino o ARNm puede ser inyectado en embriones de pez cebra en el estadio de una célula para aumentar o disminuir el nivel de productos específicos de genes durante el desarrollo posterior.

Microinyección de embriones de pez cebra para analizar la función génica

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La producción de embriones de pez cebra mediante haploide<em&gt; In Vitro</em&gt; Fertilización

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La manipulación y<em&gt; In Vitro</em&gt; La maduración de<em&gt; Xenopus laevis</em&gt; Los ovocitos, seguido de inyección intracitoplasmática de espermatozoides, para estudiar el desarrollo embrionario

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Aislamiento rápido de ovocitos en estadio I en pez cebra desprovistos de células granulosas

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Generación de mutantes maternos usando pez cebra zpc:cas9 knock-in

Aprende a realizar la maduración in vitro de ovocitos de pez cebra para manipular productos génicos maternos antes de la fertilización. Este método permite estudiar contribuciones maternas en el desarrollo embrionario temprano.

La manipulación de genes maternos funcional de Productos que utilizan

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