La fabricación de dispositivos de microfluidos basados ​​en papel tridimensional para inmunoensayos

El objetivo general de este protocolo es demostrar nuestro proceso de fabricación de dispositivos tridimensionales basados en papel, que utilizamos como plataforma para desarrollar inmunoensayos en el punto de atención. Este método proporciona una plataforma de microfluídica basada en papel con un proceso de fabricación fiable, de modo que el tiempo y el esfuerzo se pueden dedicar al desarrollo de ensayos en lugar de al diseño de dispositivos. La principal ventaja de nuestra técnica es que permite preparar muchos dispositivos en paralelo y en una cantidad que es deseable para proyectos de investigación académica.

Por lo general, los nuevos usuarios tendrán dificultades con este método porque hay muchas variables a tener en cuenta a la hora de fabricar dispositivos, como la alineación adecuada de las capas. Los errores pueden dar lugar a un mal funcionamiento de los dispositivos. Una demostración visual de este método es fundamental porque el ensamblaje puede ser difícil de imaginar utilizando solo los detalles proporcionados en los manuscritos.

En primer lugar, prepare capas de papel de filtro cualitativo cortando una hoja de papel en un tamaño de papel estándar para facilitar el modelado con una impresora de cera. Cargue una hoja de papel cortada en la bandeja de la impresora. A continuación, imprime las capas previamente diseñadas.

A continuación, corte una fila de membrana de nailon en hojas con un cortador de papel de mesa, teniendo mucho cuidado al manipular la membrana de nailon para mantener su integridad y protegerla contra el desgarro. Guarde cualquier material no utilizado en un gabinete desecador, ya que las membranas de nailon son sensibles a la humedad. Con una impresora de cera, imprima un patrón de capa de captura en una hoja de papel de copia y péguelo con cinta adhesiva a una caja de luz para que sirva como guía para el posicionamiento de la membrana de nailon.

A continuación, coloque una hoja limpia de papel de copia sobre la hoja de papel de copia impresa anteriormente. Pega la hoja de papel limpia a la caja de luz, pero no las juntes con cinta adhesiva. Ahora, coloque una hoja cortada de membrana de nailon sobre la hoja limpia de papel de copia, asegurándose de que la membrana cubra el área impresa de la capa inferior de papel de copia.

Pega los cuatro lados de la membrana de nailon a la hoja limpia de papel de copia. Cargue una hoja de membrana de nailon soportada por el papel de copia adherido a ella en la bandeja de la impresora de alimentación manual. A continuación, imprima una hoja de membrana de nailon a la vez.

Pega las capas impresas en un marco acrílico para calentarlas uniformemente por encima y por debajo de la capa cuando se coloquen en un horno de convección por gravedad. Ahora, coloque las capas en el horno a 150 grados centígrados durante 30 segundos hasta que la cera se derrita en el grosor del papel. Después de retirar el papel del horno, confirme que la cera ha impregnado el grosor del papel dándole la vuelta y comprobando si hay imperfecciones en el diseño.

Retire el papel y la membrana de nailon del marco acrílico. A continuación, retire la membrana de nailon de la hoja de soporte de papel de copia con un cortador de papel. Patrón de láminas de doble cara de películas adhesivas utilizando un plotter de cuchillas robotizado con archivos de diseño previamente preparados.

A continuación, pegue con cinta adhesiva una capa de papel que debe respaldarse con adhesivo en una caja de luz con el lado impreso hacia abajo. Despegue un lado del revestimiento protector de la hoja de adhesivo del patrón. Presione la hoja de patrón de adhesivo y la capa de papel juntas.

A continuación, coloque el dispositivo parcialmente montado en un deslizamiento protector. A continuación, pase el ensamblaje de dos capas resultante a través de una laminadora automatizada para presionar completamente el adhesivo y el papel, eliminando cualquier bolsa de aire de las capas adyacentes. Pegar una capa conjugada sobre un marco acrílico de manera que la zona hidrofílica a tratar quede suspendida y no esté en contacto con el marco.

Añadir 2,5 microlitros de BSA y un X PBS a la zona hidrofílica de la capa conjugada. Después de dejar que la muestra se seque a temperatura ambiente durante dos minutos, séquela a 65 grados centígrados durante cinco minutos. A continuación, agregue cinco microlitros de nanopartículas de oro coloidal OD conjugadas con el anticuerpo anti-beta hCG, luego repita el proceso de secado.

Coloque una capa de canal lateral en un marco acrílico de manera que la zona hidrofílica a tratar quede suspendida y no esté en contacto con el marco. Agregue 10 microlitros de agente bloqueador para tratar el canal lateral, luego repita el mismo proceso de secado utilizado para la capa conjugada. A continuación, pegue una capa de captura en un marco acrílico de modo que la zona hidrofílica a tratar quede suspendida y no esté en contacto con el marco.

Tratar la capa de captura con cinco microlitros de anticuerpo anti-alfa hCG. Después de dejar que la muestra se seque a temperatura ambiente durante dos minutos, séquela a 65 grados centígrados durante ocho minutos. Agregue dos microlitros de agente bloqueador, luego repita el mismo proceso de secado utilizado para la capa de captura.

Pega la capa de lavado a la caja de luz con la cara impresa hacia arriba. Si se utilizan agujeros de alineación, elimínelos de las capas siguientes con una herramienta de perforación de agujeros manual. Retire la película protectora en la parte posterior de la capa de captura para exponer el adhesivo.

Alinee la capa de captura sobre la capa de lavado usando los orificios de alineación como guía, luego presione las dos capas juntas y evite tocar las zonas hidrofílicas para minimizar la contaminación o el daño al dispositivo. A continuación, retire la película protectora de la parte posterior de la capa de incubación para exponer el adhesivo. Alinee la capa de incubación sobre la capa de captura y presiónelas juntas.

Continúe agregando capas de esta manera hasta que se ensamblen todas las capas activas. Ahora, coloque el dispositivo parcialmente ensamblado en un deslizamiento protector y fije firmemente las capas con una laminadora. Retire la película protectora de la parte posterior de la capa de lavado y fije la capa de secado en la parte inferior del dispositivo.

Después de laminar para completar el ensamblaje del dispositivo microfluídico tridimensional a base de papel, corte la cantidad deseada de dispositivos de hojas de dispositivos completamente ensamblados con tijeras. Agregue 20 microlitros de una muestra de control positivo de tampón de hCG a la zona hidrofílica en la parte superior del dispositivo. Una vez que la muestra se haya absorbido completamente en el dispositivo, agregue 15 microlitros de tampón de lavado.

Después de que la primera alícuota de tampón de lavado se haya absorbido completamente en el dispositivo, agregue una segunda alícuota de 15 microlitros de tampón de lavado. Para revelar los resultados del ensayo, retire las tres capas superiores del dispositivo con pinzas para exponer la capa de captura. El método de impresión en cera se puede utilizar para formar barreras hidrofóbicas dentro de dispositivos microfluídicos basados en papel y produce vías fluídicas con dimensiones reproducibles, lo cual es fundamental para ensayos con rendimientos y tiempos de duración repetibles.

El rendimiento del inmunoensayo basado en papel de hCG se demostró mediante la realización de 35 ensayos positivos y 35 negativos en paralelo. Se determinó que el coeficiente de variación para cada conjunto de datos era del 1 % para los ensayos realizados con muestras negativas y del 3 % para los ensayos realizados con muestras positivas. Una desalineación entre las capas que componen el canal de incubación y la zona de captura puede causar el desarrollo de un patrón irregular en la señal positiva, lo que puede resultar en una interpretación errónea de la señal cualitativa.

Si la cera no se imprime en una cantidad suficiente o no se permite que se derrita completamente a través del grosor del papel, la integridad de las barreras hidrofóbicas resultantes puede verse comprometida y provocar fugas dentro del dispositivo. Los ensayos que tardan más de lo esperado en completarse pueden indicar un mal funcionamiento en la fabricación de un dispositivo. Los dispositivos microfluídicos basados en papel proporcionan a los investigadores una plataforma versátil para desarrollar pruebas analíticas de bajo costo en el punto de atención.

Si bien existen varias aplicaciones, el enfoque que demostramos aquí da como resultado una arquitectura de dispositivo general para realizar inmunoensayos, que son críticos en la atención médica. Al intentar este procedimiento, es importante recordar que debe comprobar si hay imperfecciones durante el proceso de fabricación y antes de tratar las capas con costosos reactivos bioquímicos. Una vez dominado, este método, desde la impresión de capas hasta el ensamblaje de las capas tratadas, puede utilizarse para preparar una hoja de inmunoensayos funcionales en dos horas.

Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo fabricar dispositivos tridimensionales basados en papel y sentirse lo suficientemente cómodo como para adaptar esta plataforma a otros tipos de ensayos de interés.