Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

El objetivo de este video es describir un método que aumenta el rendimiento al tiempo que equilibra el esfuerzo y la precisión para la extracción de lípidos de las membranas celulares de los microorganismos para su uso en la caracterización de lípidos totales y la abundancia relativa de lípidos indicadores para determinar la estructura de la comunidad microbiana del suelo y estudios con muchas muestras. En el campo, debe tener en cuenta la heterogeneidad del suelo recolectando muestras de suelo de una manera que represente su sitio. Para preservar la comunidad microbiana en el momento del muestreo, las muestras deben transportarse desde el campo sobre hielo.

Una vez de vuelta en el laboratorio, retire las raíces y las piedras y rompa los terrones mediante un tamizado grueso. Esto también sirve para homogeneizar su muestra. Prepárese para la liofilización colocando las submuestras en recipientes apropiados y liofilice lo antes posible.

Una vez que los suelos se hayan liofilizado, almacene en un recipiente sellado con desecante hasta la extracción. Es mejor almacenar los suelos secados en el congelador a 80 grados C.As preparación para la extracción, eliminar los suelos liofilizados del almacenamiento y moler. Los métodos de molienda incluyen molino de bolas, medidor de bolas o mortero.

Después de moler la tierra, nuevamente, homogeneice bien sus muestras de suelo y guárdelas en el congelador. Todo el material de laboratorio debe estar escrupulosamente limpio. Cualquier residuo de detergente, grasa o suciedad puede afectar a los resultados al aparecer como un pico en el cromatograma GC final.

Las extracciones se realizan en tubos centrífugos de teflón de 30 mililitros, que deben ser enjuagados con solvente. Agregue de dos a tres mililitros de hexano a los tubos y al vórtice durante unos segundos. Decantar el hexano a otro tubo y vórtice.

Se pueden usar de dos a tres mililitros de hexano para enjuagar en serie seis tubos. Guarde los tubos de hexano enjuagados boca abajo en la campana extractora y deseche el hexano usado en un contenedor de residuos adecuado. La cristalería se puede amortiguar o enjuagar con solvente inmediatamente antes de usarla.

La amortiguación garantiza que la cristalería esté limpia por oxidación de residuos a alta temperatura. Envuelva la cristalería en dos o tres capas de papel de aluminio y colóquela en el horno de mufla. Ajuste a 450 grados C, y una vez que el horno haya alcanzado el punto de ajuste, hornee durante un mínimo de 4 1/2 horas.

Espere al menos una hora para que se enfríe antes de sacarlo del horno. Etiquete y pese los tubos de teflón enjuagados con hexano. Agregue tierra en tubos centrífugos de teflón y vuelva a pesar la masa del suelo.

Realice siempre al menos dos blancos por lote e incluya un estándar de control, preferiblemente un suelo que haya sido extraído previamente, si desea verificar que la extracción funcionó correctamente. Extracciones lipídicas. Prepare tres repipetas de cinco a 10 mililitros para tampón de fosfato, cloroformo y metanol.

El cloroformo es un líquido muy denso que tiene una tensión superficial baja. Tenga cuidado de que la cantidad que dispense sea precisa y consistente. Mantenga la botella al menos medio llena de líquido.

En la campana extractora, agregue los reactivos al suelo en el tubo de teflón en el siguiente orden, tampón de fosfato, cloroformo y metanol. Esta es la primera extracción física de lípidos del material de la muestra. Las recetas para las soluciones de reactivos se incluyen en el protocolo escrito.

Las proporciones de disolvente y el orden de adición son importantes para la correcta separación de las fases orgánica y acuosa. Deje que la tierra se humedezca después de la adición del tampón antes de agregar el cloroformo. Si es conveniente, los extractantes se pueden combinar y agregar como una sola alícuota para la segunda extracciones y las siguientes.

Tape bien los tubos de teflón y cúbralos para protegerlos de la luz. Colócalos en la coctelera horizontalmente asegurándote de que estén bien sujetos. Con un ajuste de velocidad alto, agite durante la hora.

Mientras los tubos se agitan, prepare dos tubos largos de vidrio para cada muestra de la siguiente manera. Etiquete el tubo, agregue el mismo volumen de cloroformo que se agregó al suelo y un volumen igual de tampón de fosfato. Después de retirar los tubos de teflón del agitador a 25 grados C, centrifugar los tubos durante 10 minutos a 2.500 RPM.

Luego, en la campana extractora, con las luces apagadas, decanta el sobrenadante del tubo de teflón en uno de los tubos largos. La separación de fases debe ser visible en el tubo de vidrio. La capa inferior contiene el disolvente orgánico, principalmente el cloroformo, y los lípidos.

Esta extracción se repite. Vierta el sobrenadante en el segundo tubo preparado anteriormente. Ahora has extraído físicamente los lípidos del suelo dos veces.

Para la mayoría de los suelos, esto es adecuado. Tape de forma segura todos los tubos de clase larga con tapas revestidas de teflón e invierta 10 veces para mezclar. Fases separadas por gravedad durante la noche.

Deje que las muestras permanezcan inalteradas durante la noche para completar la separación de las dos fases. Para hacer esto, mantenga las muestras en un gabinete oscuro o cubiertas con papel de aluminio a temperatura ambiente. Está bien permitir que los extractos se separen durante el fin de semana.

Segundo día, aislamiento de lípidos. En el segundo día, se aspira la capa acuosa y se concentran los lípidos eliminando el disolvente en un sistema de evaporación al vacío. Las muestras también se pueden secar colocándolas en un baño de agua o arena y aplicando un suave chorro de nitrógeno.

El líquido en los tubos ahora debe estar bien separado y en gran parte transparente. Si no es así, o si la interfaz entre las dos capas es especialmente gruesa, permita que la separación continúe durante otro día. Instale un aspirador de vacío en el capó.

Se trata de un matraz de brazo lateral conectado a una bomba de vacío con un tubo Tygon de hoja y una pipeta de pasto. Con la bomba en marcha, utilizando la pipeta para extraer la fase acuosa en el matraz. Aspire la capa superior y la interfaz.

Esto será aproximadamente 2/3 del camino hacia abajo. Haz esto con los dos o tres juegos de tubos de vidrio. La capa superior puede contener algunas partículas de tierra.

Quítelos si es posible. Combine el extracto del segundo y o tercer juego de tubos con el de los dos primeros decantando cuidadosamente. Trate de excluir del vertido cualquier material sólido y enjuague las paredes del tubo girando.

Utilice una pipeta limpia para cada muestra y repita este proceso para las muestras restantes. Una vez que los extractos de cloroformo se hayan combinado y hayan estado reposando durante unos minutos, inspeccione la superficie del líquido. A menudo, se formará una fina capa de agua residual.

Si esto está presente, aspire antes de continuar. El agua residual puede atacar los dobles enlaces de ácidos grasos, pero una cantidad muy pequeña debe evaporarse junto con los solventes a medida que se secan las muestras. Secar todas las muestras utilizando el aparato de evaporación al vacío.

Tape bien los tubos y guárdelos en un congelador a 80 grados C.Día tres, saponificación y metilación. Primero, abre los baños de agua. Compruebe el nivel del agua y programe el baño de uno a 95 grados C y el baño de dos a 80 grados C. Con una pipeta, agregue un mililitro del reactivo de saponificación, Reactivo 1, a los lípidos secos.

Tape herméticamente, haga un vórtice brevemente y colóquelo en una rejilla. Una vez que haya bajado con este paso, coloque la rejilla de tubos en el baño de agua a 95 grados C y espere cinco minutos. Retire la rejilla de tubos de la bañera y revise los tubos para ver si hay fugas.

Esto se indicará mediante burbujas que se elevan en el tubo como una espuma. Vuelva a apretar o reemplace las tapas de los tubos con fugas. Continúe calentando los tubos en el baño de agua durante otros 10 minutos.

Reduzca el ajuste de temperatura en el baño de agua a 80 grados C y continúe la incubación durante otros 15 minutos. Retire los tubos y enfríe colocando la rejilla en una olla con agua del grifo. No use agua helada.

Una vez que las muestras se hayan enfriado, agregue dos mililitros del reactivo de metilación, Reactivo 2, a cada muestra. Nuevamente, tape firmemente y en vórtice durante cinco a 10 segundos. Las sales granulares pueden volverse visibles como precipitantes en la solución, lo que ocurre a veces debido al exceso de reactivos.

Coloque la rejilla en el baño de agua a 80 grados C e incube durante 10 minutos. Retire la rejilla de tubos del baño de agua y colóquela en una olla con agua del grifo para que se enfríe. Agite la rejilla para acelerar el proceso de enfriamiento.

Con una nueva pipeta, agregue 1,25 mililitros de hexano y éter terciario butílico metílico, reactivo 3, a cada tubo para extraer la fase. Selle bien las tapas y coloque los tubos en una coctelera durante 10 minutos. Después de agitar, deje reposar la rejilla de tubos durante 10 minutos para que se separen las fases.

Transfiera la fase orgánica, que ahora es la capa superior, a un tubo de vidrio corto con una pipeta de pasto. Lo mejor es recuperar la mayor parte del líquido. Cantidades muy pequeñas de la fase acuosa no comprometerán la extracción.

Repita la extracción de fase acuosa agregando el reactivo 3, agitando, permitiendo que las fases se separen y transfiriendo la fase superior. Dependiendo de la condición de la fase inferior, puede repetir esto una vez más para un total de tres transferencias. Agregue 3 mililitros del lavado base, Reactivo 4, que es una solución diluida de hidróxido de sodio, a los extractos en los tubos cortos.

Tape los tubos de ensayo herméticamente y en vórtice durante 20 a 30 segundos y luego centrifugue durante tres minutos a 2.000 RPM. Una vez centrifugado, con una pipeta de pasto limpio, aspire la fase orgánica superior y transfiérala a un vial de ámbar de cuatro mililitros. Tenga mucho cuidado de no aspirar nada de la fase acuosa.

El siguiente paso es evaporar el solvente hasta la sequedad en un aparato de evaporación al vacío. Cuarto día, preparación de los extractos para el análisis de GC. Con la pipeta, añada 100 microlitros de reactivo 3 a cada uno de los viales de 4 mililitros que contengan la fase seca.

Agite la muestra en vórtice y luego déjela reposar durante 10 minutos. Con la segunda pipeta, transfiera con cuidado los FAME suspendidos a un vial de GC. Agregue otra alícuota del solvente al vial de cuatro mililitros y vórtice brevemente.

Enrolle el vial para asegurarse de que se disuelvan los FAM residuales en las paredes del vial. Utilizando de nuevo la segunda pipeta, transfiera el disolvente al vial de GC. Complete la transferencia añadiendo una tercera alícuota de disolvente al vial, vórtice y transfiriéndolo al vial de GC.

Tape el vial de GC y guárdelo en el congelador. Guarde los viales de GC sellados en el congelador antes del análisis. Análisis de GC.

Para utilizar este sistema, el análisis debe realizarse utilizando una columna GC específica. El cromatógrafo de gases está equipado con una entrada dividida sin división equipada con un revestimiento de entrada de vidrio de cuatro milímetros de diámetro interior con un tapón de lana de vidrio desactivado. La entrada se ajusta a 250 grados C y funciona en modo de presión constante.

El gas portador es el hidrógeno. El nitrógeno y el aire son necesarios como gases de soporte del detector. Se utiliza una columna Agilent Ultra 2.

La columna tiene 25 metros de largo con un diámetro interior de 2 milímetros y un espesor de película de fase estacionaria de 33 micrómetros. La fase estacionaria en esta columna es 5% fenilo, 95% metilpolisiloxano, también conocida como columna de tipo DB-5. Para analizar los extractos lipídicos, se inyecta una alícuota de dos microlitros en una proporción de división de 100:1 con la temperatura del horno a 170 grados C.Post inyección, el horno se programa para aumentar a cinco grados por minuto hasta 300 grados C y luego se mantiene durante 12 minutos.

Se realizan una serie de inyecciones del estándar MIDI y los resultados se utilizan para realizar ajustes de acuerdo con las instrucciones del manual MIDI. Una vez calibrado de esta manera, el sistema puede necesitar ajustes menores en ocasiones, pero generalmente debería lograr buenos resultados utilizando estos parámetros. El sistema MIDI produce un informe para cada muestra que contiene una tabla con una línea por pico realizado.

El software informa sobre el tiempo máximo de retención, el área del pico, la identificación del pico, junto con el ECL o la longitud estimada de la cadena, un parámetro utilizado para la identificación del pico, y un factor de respuesta, un parámetro utilizado para normalizar las variaciones y la respuesta del detector con respecto al tiempo de retención. La ECL expresa dónde, entre una serie de FAME de cadena recta, elude cada FAME desconocido. Así, por ejemplo, si el tiempo de retención de una incógnita eluye a medio camino entre los de una cadena de 12 y 13 carbonos, la ECL se informa como una cadena de 12,5 carbonos.

El software compara el ECL de cada pico con los de los FAMEs en una base de datos, y cuando se producen coincidencias asigna el nombre correspondiente a lo desconocido. En los casos en los que dos FAMEs de la base de datos tienen ECLs muy cercanas, el software informa de ambos nombres enumerando primero el más cercano. Las tablas de datos de los informes se pueden recopilar en una hoja de cálculo o base de datos.

Después de ajustar el factor de respuesta, las áreas de pico se pueden comparar con el área de pico de un patrón externo o interno para llegar a una concentración del extracto. Dividiendo entre la masa de suelo extraído, los datos se pueden expresar como masa de FAME por gramo de suelo o, utilizando también el peso molecular de cada FAME, como nanomoles por gramo de suelo. A continuación, se pueden sumar los FAMEs de los biomarcadores para obtener biomasa de gremios microbianos, y estos gremios pueden analizarse más a fondo.

Por ejemplo, aquí vemos praderas no fertilizadas con más biomasa FAME que praderas fertilizadas. Ambos tienen más biomasa que los campos de maíz cercanos. Además, los FAME se asocian con grupos funcionales particulares como hongos o bacterias.

Estas asociaciones son específicas del ecosistema, por lo que es importante no generalizarlas en exceso. Este tipo de análisis muestra si ciertos grupos son más abundantes en ciertos ambientes. Aquí, los hongos son más abundantes en la pradera no fertilizada que en el campo de maíz.

Y, por último, otra forma de observar la composición general de la comunidad microbiana es comparar observando la abundancia relativa de todos los FAMEs a la vez utilizando métodos de ordenación como el escalamiento multidimensional no métrico, NMDS, o el análisis de componentes principales, PCA. En una ordenación, las comunidades microbianas que son más similares estarán más juntas. Entonces, a partir de nuestros datos de ejemplo, el maíz y la pradera no fertilizada están muy alejados, mientras que algunas muestras de pradera fertilizada tienen comunidades microbianas que se asemejan a las del maíz y otras se asemejan a la pradera no fertilizada.

Las comunidades microbianas suelen ser muy variables incluso dentro de un entorno, por lo que no siempre se separan claramente. Después de ver este video, uno debería tener una buena comprensión del proceso por el cual los biomarcadores lipídicos de las membranas celulares de los microorganismos se extraen del suelo. La extracción de ácidos grasos fosfolípidos es una forma eficaz, rápida y económica de evaluar los gremios microbianos y la biomasa microbiana total mediante la identificación de biomarcadores microbianos únicos.