Un método de extracción y análisis de lípidos para caracterizar los microbios del suelo en experimentos con muchas muestras

El objetivo de este video es describir un método que aumenta el rendimiento al equilibrar el esfuerzo y la precisión para la extracción de lípidos de las membranas celulares de microorganismos, con el fin de caracterizar tanto los lípidos totales como la abundancia relativa de lípidos indicadores para determinar la estructura de la comunidad microbiana del suelo y para estudios con muchas muestras. En el campo, debe tenerse en cuenta la heterogeneidad del suelo al recolectar muestras de manera que representen adecuadamente el sitio. Para preservar la comunidad microbiana en el momento del muestreo, las muestras deben transportarse desde el campo sobre hielo.

Una vez de regreso en el laboratorio, retire las raíces y las piedras y desagregue los terrones mediante tamizado grueso. Esto también sirve para homogeneizar su muestra. Prepare para liofilizar colocando submuestras en recipientes adecuados y liofilice lo antes posible.

Una vez que los suelos están liofilizados, guárdelos en un recipiente hermético con un agente desecante hasta la extracción. Lo mejor es almacenar los suelos liofilizados a 80 grados C. Como preparación para la extracción, retire los suelos liofilizados del almacenamiento y muélelos. Los métodos de molienda incluyen molino de bolas, medidor de bolas o mortero y maja.

Después de moler el suelo, vuelva a homogeneizar cuidadosamente las muestras de suelo y almacénelas en el congelador. Todo el material de laboratorio debe estar meticulosamente limpio. Cualquier residuo de detergente, grasa o suciedad puede afectar los resultados al aparecer como un pico en el cromatograma final de GC.

Las extracciones se realizan en tubos centrífugos de teflón de 30 mililitros, que deben enjuagarse con disolvente. Añada de dos a tres mililitros de hexano a los tubos y vortex durante unos segundos. Vierta el hexano en otro tubo y vortex.

Se pueden utilizar de dos a tres mililitros de hexano para enjuagar en serie seis tubos. Almacene los tubos enjuagados con hexano boca abajo en la campana extractora y deseche el hexano usado en un recipiente adecuado para desechos. El material de vidrio puede ser calcinado o enjuagado con disolvente inmediatamente antes de su uso.

El encerrado asegura que el material de vidrio esté limpio mediante la oxidación de residuos a alta temperatura. Envuelva el material de vidrio en dos o tres capas de papel de aluminio y colóquelo en el horno mufla. Establezca 450 grados C y, una vez que el horno haya alcanzado el punto de consigna, caliente durante un mínimo de 4 1/2 horas.

Deje enfriar al menos una hora antes de retirar del horno. Etiquete y pese los tubos de teflón lavados con hexano. Añada el suelo a los tubos de centrífuga de teflón y vuélvalos a pesar para determinar la masa del suelo.

Siempre prepare al menos dos blancos por lote e incluya un estándar de control, preferiblemente un suelo que haya sido extraído previamente, si desea verificar que la extracción funcionó correctamente. Extracciones de lípidos. Prepare tres repipetas de cinco a 10 mililitros para tampón fosfato, cloroformo y metanol.

El cloroformo es un líquido muy denso con una tensión superficial baja. Tenga cuidado de que la cantidad que dispensa sea precisa y constante. Mantenga la botella al menos medio llena de líquido.

En la campana extractora, agregue los reactivos al suelo en el tubo de teflón en el siguiente orden: tampón fosfato, cloroformo y metanol. Esta es la primera extracción física de lípidos a partir del material de la muestra. Las recetas para las soluciones de reactivos se incluyen en el protocolo escrito.

Las proporciones del disolvente y el orden de adición son importantes para una adecuada separación de las fases orgánica y acuosa. Permita que los suelos absorban humedad durante un tiempo tras la adición del tampón antes de agregar el cloroformo. Si resulta conveniente, los extractantes pueden combinarse y añadirse como una única alícuota para la segunda y cualquier extracción posterior.

Cierre herméticamente los tubos de teflón y cúbralos para protegerlos de la luz. Colóquelos en el agitador en posición horizontal, asegurándose de que estén bien sujetos. Agite a velocidad alta durante una hora.

Mientras los tubos están agitándose, prepare dos tubos de vidrio largos para cada muestra de la siguiente manera. Etiquete el tubo, agregue el mismo volumen de cloroformo que se agregó al suelo y un volumen igual de tampón fosfato. Después de retirar los tubos de teflón del agitador, centrifugue los tubos durante 10 minutos a 2.500 RPM a 25 grados C.

Luego, en la campana extractora con las luces apagadas, vierta el sobrenadante desde el tubo de teflón a uno de los tubos largos. La separación de fases debería ser visible en el tubo de vidrio. La capa inferior contiene el disolvente orgánico, principalmente cloroformo, y los lípidos.

Se repite esta extracción. Vierta el sobrenadante en el segundo tubo preparado anteriormente. Ahora ha extraído físicamente los lípidos del suelo dos veces.

Para la mayoría de los suelos, esto es adecuado. Tape fuertemente todos los tubos largos con tapas revestidas de teflón e inviértalos 10 veces para mezclar. Separe las fases por gravedad durante la noche.

Deje reposar las muestras sin perturbar durante la noche para completar la separación de las dos fases. Para ello, mantenga las muestras en un armario oscuro o cubiertas con papel de aluminio a temperatura ambiente. Es aceptable permitir que los extractos se separen durante el fin de semana.

Día dos, aislamiento de lípidos. En el día dos, se aspira la capa acuosa y los lípidos se concentran eliminando el disolvente mediante un sistema de evaporación al vacío. Las muestras también pueden secarse colocándolas en un baño de agua o arena y aplicando un flujo suave de nitrógeno.

El líquido en los tubos ahora debería estar bien separado y en gran parte claro. Si no es así, o si la interfase entre las dos capas es especialmente gruesa, permita que la separación continúe durante otro día. Prepare un aspirador de vacío en la campana.

Este es un matraz de brazo lateral conectado a una bomba de vacío mediante un tubo de Tygon con forma de hoja y una pipeta de Pasteur. Con la bomba en funcionamiento, utilice la pipeta para extraer la fase acuosa hacia el matraz. Aspire la capa superior y la interfase.

Esto será aproximadamente a dos tercios del camino hacia abajo. Haga esto con los dos o tres juegos de tubos de vidrio. La capa superior puede contener algunas partículas de suelo.

Elimine estos si es posible. Combine el extracto del segundo y/o tercer conjunto de tubos con el de los dos primeros vertiendo cuidadosamente. Trate de evitar verter cualquier material sólido y enjuague las paredes del tubo mediante rotación.

Utilice una pipeta limpia para cada muestra y repita este proceso para las muestras restantes. Una vez que se hayan combinado los extractos de cloroformo y hayan reposado durante unos minutos, inspeccione la superficie del líquido. A menudo, se forma una capa delgada de agua residual.

Si esto está presente, aspire antes de continuar. El agua residual puede atacar los dobles enlaces de los ácidos grasos, pero una cantidad muy pequeña debería coevaporarse con los disolventes mientras se secan las muestras. Seque todas las muestras utilizando el aparato de evaporación al vacío.

Cierre herméticamente los tubos y almacénelos en un congelador a 80 grados C. Día tres, saponificación y metilación. Primero, encienda los baños de agua. Verifique el nivel de agua y ajuste el baño uno a 95 grados C y el baño dos a 80 grados C. Usando una repipeta, agregue un mililitro del reactivo de saponificación, Reactivo 1, a los lípidos secos.

Cierre herméticamente, vortex brevemente y coloque en un portamuestras. Una vez finalizado este paso, introduzca el portamuestras con los tubos en el baño de agua a 95 grados C y espere cinco minutos. Retire el portamuestras con los tubos del baño y verifique los tubos en busca de fugas.

Esto se indicará por la formación de burbujas que suben por el tubo como una espuma. Vuelva a apretar o reemplace las tapas de los tubos con fugas. Continúe calentando los tubos en el baño de agua durante otros 10 minutos.

Reduzca la temperatura del baño de agua a 80 grados C y continúe la incubación durante otros 15 minutos. Retire los tubos y enfríe colocando la gradilla en un recipiente con agua del grifo. No utilice agua con hielo.

Una vez que las muestras se hayan enfriado, agregue dos mililitros del reactivo de metilación, Reactivo 2, a cada muestra. Nuevamente, tápelas firmemente y vortexee durante cinco a 10 segundos. Pueden aparecer sales granulares visibles como un precipitado en la solución, lo cual ocurre a veces debido a un exceso de reactivos.

Coloque el soporte en el baño de agua a 80 grados C y incube durante 10 minutos. Retire el soporte de tubos del baño de agua y colóquelo en un recipiente con agua del grifo para enfriarlo. Agite el soporte para acelerar el proceso de enfriamiento.

Utilizando una repipeta, agregue 1,25 mililitros de hexano y éter metil-ter-butilo, Reactivo 3, a cada tubo para extraer la fase. Selle bien las tapas y coloque los tubos en un agitador durante 10 minutos. Después de agitar, deje reposar el soporte con los tubos durante 10 minutos para permitir la separación de las fases.

Transfiera la fase orgánica, que ahora es la capa superior, a un tubo de vidrio corto utilizando una pipeta Pasteur. Es recomendable recuperar la mayor parte del líquido. Cantidades muy pequeñas de la fase acuosa no comprometerán la extracción.

Repita la extracción de la fase acuosa añadiendo el reactivo 3, agitando, dejando separar las fases y transfiriendo la fase superior. Dependiendo del estado de la fase inferior, puede repetir este paso una vez más para un total de tres transferencias. Añada 3 mililitros del lavado básico, el reactivo 4, que es una solución diluida de hidróxido de sodio, a los extractos en los tubos cortos.

Cierre herméticamente los tubos de ensayo y vortexee durante 20 a 30 segundos, luego centrifugue durante tres minutos a 2.000 RPM. Una vez centrifugado, utilice una pipeta Pasteur limpia para aspirar la fase orgánica superior y transfiérala a un vial ámbar de cuatro mililitros. Tenga mucho cuidado de no aspirar ninguna parte de la fase acuosa.

El siguiente paso consiste en evaporar el disolvente hasta sequedad en un aparato de evaporación al vacío. Día cuatro, preparación de los extractos para el análisis por GC. Mediante el pipeteador, añada 100 microlitros del Reactivo 3 a cada uno de los viales de 4 mililitros que contienen la fase seca.

Vortex la muestra y luego déjela reposar durante 10 minutos. Utilizando el segundo pipeteador, transfiera cuidadosamente los FAMEs en suspensión a un vial de GC. Añada otra alícuota del disolvente al vial de cuatro mililitros y vortex brevemente.

Rollice el vial para asegurarse de que los FAME residuales en las paredes del vial se disuelvan. Usando el segundo pipeteador nuevamente, transfiera el disolvente al vial de GC. Complete la transferencia añadiendo una tercera alícuota de disolvente al vial, vortexeando y transfiriendo al vial de GC.

Cierre el vial de GC y guárdelo en el congelador. Almacene los viales de GC sellados en el congelador antes del análisis. Análisis de GC.

Para utilizar este sistema, el análisis debe realizarse usando una columna de CG específica. El cromatógrafo de gases está equipado con una entrada split/splitless provista de un revestimiento de vidrio con un diámetro interno de cuatro milímetros y un tapón de lana de vidrio desactivada. La entrada se ajusta a 250 grados C y se opera en modo de presión constante.

El gas portador es hidrógeno. Se necesitan nitrógeno y aire como gases de soporte para el detector. Se utiliza una columna Agilent Ultra 2.

La columna tiene 25 metros de longitud, un diámetro interno de 2 milímetros y un espesor de película de fase estacionaria de 33 micrómetros. La fase estacionaria de esta columna es de 5 % fenilo, 95 % metilpolisiloxano, también conocida como una columna tipo DB-5. Para analizar los extractos lipídicos, se inyecta una alícuota de dos microlitros en una relación de división de 100:1 con la temperatura del horno a 170 grados C. Tras la inyección, se programa el horno para que aumente cinco grados por minuto hasta alcanzar 300 grados C y luego se mantenga durante 12 minutos.

Se realizan una serie de inyecciones del estándar MIDI y los resultados se utilizan para realizar ajustes según las instrucciones del manual MIDI. Una vez calibrado de esta manera, el sistema podría necesitar ajustes menores ocasionalmente, pero en general debería obtener buenos resultados utilizando estos parámetros. El sistema MIDI genera un informe para cada muestra que contiene una tabla con una línea por cada pico detectado.

El software informa el tiempo de retención del pico, el área del pico, la identificación del pico, junto con la LCE o longitud de cadena estimada, un parámetro utilizado para la identificación de picos, y un factor de respuesta, un parámetro empleado para normalizar las variaciones y la respuesta del detector con respecto al tiempo de retención. La LCE expresa la posición relativa, entre una serie de ésteres metílicos de ácidos grasos de cadena recta, en la que eluye cada éster metílico desconocido. Por ejemplo, si el tiempo de retención de un compuesto desconocido corresponde a la mitad entre los tiempos de elución de cadenas de 12 y 13 carbonos, la LCE se reporta como una cadena de 12,5 carbonos.

El software compara el ECL de cada pico con los de los FAME en una base de datos, y cuando hay coincidencias, asigna el nombre correspondiente al compuesto desconocido. En los casos en que dos FAME en la base de datos tengan ECL muy similares, el software muestra ambos nombres, listando primero el más cercano. Las tablas de datos de los informes pueden consolidarse en una hoja de cálculo o base de datos.

Después de ajustar por el factor de respuesta, las áreas de los picos pueden compararse con el área del pico de un patrón externo o interno para obtener la concentración del extracto. Al dividir entre la masa de suelo extraída, los datos pueden expresarse como masa de FAME por gramo de suelo o, utilizando también el peso molecular de cada FAME, como nanomoles por gramo de suelo. Los FAMEs marcadores pueden sumarse entonces para obtener la biomasa de los gremios microbianos, y estos gremios pueden analizarse más a fondo.

Por ejemplo, aquí observamos praderas no fertilizadas con mayor biomasa de FAME que praderas fertilizadas. Ambas tienen más biomasa que los campos de maíz cercanos. Además, los FAME están asociados con grupos funcionales particulares como hongos o bacterias.

Estas asociaciones son específicas del ecosistema, por lo que es importante no generalizarlas en exceso. Este tipo de análisis muestra si ciertos grupos son más abundantes en ciertos ambientes. Aquí, los hongos son más abundantes en la pradera sin fertilizar que en el campo de maíz.

Y finalmente, otra forma de analizar la composición general de la comunidad microbiana consiste en comparar la abundancia relativa de todos los ésteres metílicos de ácidos grasos (FAME) simultáneamente, utilizando métodos de ordenación como el escalonamiento multidimensional no métrico (NMDS) o el análisis de componentes principales (PCA). En una ordenación, las comunidades microbianas más similares estarán más cercanas entre sí. Así, a partir de nuestros datos de ejemplo, el maíz y la pradera sin fertilizar están muy distantes, mientras que algunas muestras de pradera fertilizada presentan comunidades microbianas que se asemejan a las del maíz, y otras se asemejan a las de la pradera sin fertilizar.

Las comunidades microbianas a menudo son altamente variables incluso dentro de un mismo entorno, por lo que no siempre se separan de manera nítida. Tras ver este video, uno debería tener una buena comprensión del proceso mediante el cual se extraen de suelos los biomarcadores lipídicos procedentes de las membranas celulares de microorganismos. La extracción de ácidos grasos fosfolipídicos es una forma eficaz, rápida y económica de evaluar gremios microbianos y la biomasa microbiana total mediante la identificación de biomarcadores microbianos únicos.