Un método simple para la fase sólida automatizada Extracción de muestras de agua para análisis inmunológico de los pequeños contaminantes
1 de enero de 2016
Se presenta un protocolo para la extracción y preconcentración de estradiol de muestras de agua mediante el uso de un sistema automatizado y miniaturizado.
El objetivo general de este método de preparación de muestras es preconcentrar contaminantes orgánicos pequeños a partir de muestras de agua, de manera sencilla, rentable y automatizada. Este método puede reemplazar los procesos estándar de extracción en fase sólida (SPE) al estudiar la contaminación de muestras de agua mediante métodos de inmunodetección, como inmunoensayos en placas de pozo o biosensores. Las principales ventajas de esta técnica son que el procedimiento de SPE es automatizado, mientras que el tamaño físico y el costo de los instrumentos son bajos en comparación con los enfoques tradicionales.
Además, los rendimientos del proceso de enriquecimiento cumplen con los requisitos del análisis de inmunoensayos tanto en cuanto al bajo contenido de disolvente como a la eficiencia de preconcentración. Primero, filtre una muestra de agua de 100 milímetros con un filtro de tamaño de poro de cero punto dos micrómetros. Coloque la muestra filtrada en un frasco de vidrio con rosca GL 45.
Prepare 300 microlitros de eluyente diluyendo metanol en agua desionizada al 50 por ciento en volumen en un tubo hermético. A continuación, prepare una suspensión de 20 miligramos por mililitro de partículas de sorbente de sílice octadecil añadiendo 1.600 microlitros de metanol seguidos de 400 microlitros de agua desionizada a 40 miligramos de sorbente de fase reversa en un vial de vidrio. Cierre firmemente la tapa y agite con un mezclador de vórtice.
Coloque una membrana de nailon con un tamaño de poro de 11 micrómetros sobre una doble capa de tejido anti-polvo. Corte dos pequeñas partes en la membrana con un punzón de tres milímetros de diámetro. Luego, tome una de las pequeñas membranas con pinzas planas para filtros y colóquela en un lado de la columna.
A continuación, atornille el conector de fondo plano con el tubo y apriete. Luego, dibuje una flecha sobre el cuerpo de la columna, apuntando hacia el extremo donde se colocó la membrana. En este punto, sujete la columna al soporte con la flecha orientada hacia la parte inferior.
Conecte una jeringa desechable vacía de 10 mililitros al extremo del tubo de la columna utilizando los conectores de bloqueo inferior. Agite la suspensión del sorbente con el mezclador de vórtice y pipetee rápidamente 100 microlitros en el centro de la columna. Mientras inyecta, aspire suavemente la solución pipeteada a través de la membrana utilizando la jeringa con la otra mano.
La preparación de la columna de EPE es muy importante. Debe asegurarse de aspirar adecuadamente la solución a través de la membrana utilizando la jeringa mientras inyecta la suspensión de partículas en la columna. De lo contrario, las partículas no se empaquetarán densamente.
Repita el proceso anterior dos veces más, agitando la suspensión stock entre todos los pasos de pipeteo, para asegurar una suspensión homogénea de las partículas en la solución. Después de que toda la suspensión haya sido cargada y secada mediante aspiración con una jeringa, mantenga la jeringa en posición y coloque la segunda membrana de nailon en la parte superior utilizando la pinza con la otra mano. A continuación, enrosque el segundo conector con un tubo y deseche la jeringa.
En este momento, ajuste la columna del dispositivo de extracción en fase sólida utilizando los conectores de bloqueo inferiores. Conecte el frasco que contiene la muestra al dispositivo atornillando la tapa de seguridad GL 45 proporcionada. Añada 200 microlitros de eluyente al depósito de eluyente.
Luego, cargue 800 microlitros de agua desionizada en el depósito de dilución. Verifique que el regulador de presión esté en posición cerrada girándolo en sentido contrario a las agujas del reloj hasta que no sea posible seguir moviéndolo. Después de encender el prototipo, ingrese los valores 580 para pset y 30 para delta pset.
Para ajustar el regulador de presión, encienda la bomba. Luego, gire manualmente el regulador de presión hasta que el valor leído para preg sea inferior pero cercano a 320 milibares. Después de detener la bomba, inicie el procedimiento de SPE presionando inicio en la esquina del modo automatizado.
Una vez completado el procedimiento de SPE, cierre el pequeño frasco de la muestra y almacénelo a cuatro o cinco grados Celsius en la oscuridad hasta el análisis por ELISA. Para limpiar el sistema, prepare una solución de 10 mililitros de metanol al 70 por ciento en volumen en un frasco de vidrio con rosca GL 45. Desconecte la columna de SPE y tape los tubos con conectores.
En el modo automatizado, seleccione el archivo de limpieza e inícielo con los mismos ajustes de presión utilizados previamente para pset, delta pset y preg. La reproducibilidad del empaquetado del sorbente se evaluó secando y pesando el sorbente pipeteado en viales de vidrio. La reproducibilidad del tiempo de inyección se probó con muestras de 100 mililitros.
Las concentraciones de las muestras enriquecidas y originales se determinaron utilizando un kit comercial de ELISA para el 17 beta-estradiol. A partir de las curvas de calibración es evidente que la proporción de metanol en la muestra enriquecida no afecta la sensibilidad del inmunoensayo. Se calcularon recuperaciones de 128 ± 22 por ciento y 107 ± 6 por ciento para agua desionizada y agua de mar artificial, respectivamente.
Una vez dominada, la preparación de una columna de extracción en fase sólida puede realizarse en menos de cinco minutos, si se lleva a cabo correctamente. Todo el procedimiento de extracción en fase sólida puede completarse en menos de una hora. Tras su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en el campo de la ciencia ambiental exploraran el desarrollo de métodos de inmunodetección para el monitoreo de contaminantes orgánicos pequeños.
Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo preparar muestras de agua utilizando nuestro instrumento automatizado y rentable para el análisis de contaminantes mediante inmunoensayos. No olvide que trabajar con contaminantes orgánicos y disolventes puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como usar guantes adecuados y gafas de protección, al realizar este procedimiento.
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Descripción general
Este artículo presenta un protocolo para la extracción automatizada y la preconcentración de estradiol a partir de muestras de agua. El método tiene como objetivo mejorar la eficiencia del estudio de contaminantes orgánicos en el agua mediante técnicas de inmunodetección.
Componentes Clave del Estudio
Área de la ciencia
- Ciencias ambientales
- Química analítica
- Evaluación de la calidad del agua
Antecedentes
- Los métodos tradicionales de extracción en fase sólida (SPE) pueden ser intensivos en mano de obra y costosos.
- Los sistemas automatizados pueden agilizar el proceso de extracción.
- Los métodos de inmunodetección requieren una preparación eficiente de las muestras para obtener resultados precisos.
- Un bajo contenido de disolvente es crucial para el análisis ambiental.
Objetivo del estudio
- Desarrollar un método rentable y fácil de usar para preconcentrar estradiol a partir de muestras de agua.
- Automatizar el proceso de extracción para reducir la manipulación manual.
- Mejorar la eficiencia de los métodos de inmunodetección en el monitoreo ambiental.
Métodos Utilizados
- Filtración de muestras de agua utilizando un filtro de tamaño de poro de 0,2 micrómetros.
- Uso de un frasco de vidrio con rosca GL 45 para el almacenamiento de muestras.
- Implementación de un sistema automatizado y miniaturizado para la extracción.
- Comparación del nuevo método con los procesos tradicionales de SPE.
Resultados principales
- El método automatizado cumple con los requisitos de rendimiento para los inmunoensayos.
- Se logró un bajo contenido de disolvente durante el proceso de extracción.
- La técnica demostró una alta eficiencia de preconcentración.
- El costo y el tamaño del sistema fueron significativamente menores que los de los métodos tradicionales.
Conclusiones
- El método de extracción automatizado es una alternativa viable a la SPE tradicional.
- Mejora el análisis de contaminantes orgánicos en muestras de agua.
- Este enfoque puede facilitar un monitoreo ambiental más eficiente.
Preguntas frecuentes
Relevancia Ejecutiva para la Industria
La extracción automatizada en fase sólida permite la preconcentración eficiente de contaminantes orgánicos traza a partir de muestras de agua, apoyando los flujos de trabajo de inmunodetección en la investigación de toxicología ambiental. Este método reduce la manipulación manual y el espacio requerido para el equipo, al tiempo que mantiene compatibilidad con la detección basada en ELISA, facilitando el cribado de mayor rendimiento de contaminantes. Este enfoque contribuye a la eliminación mecanicista de riesgos al proporcionar una preparación confiable de muestras para ensayos relacionados con biomarcadores en la evaluación preclínica de seguridad.
Aplicaciones Estratégicas en I+D de Biotecnología Farmacéutica
Descubrimiento Temprano y Validación de Blancos
- Valor científico: Permite investigar los efectos de compuestos disruptores endocrinos sobre vías hormonales mediante la recuperación de analitos purificados.
- Valor operativo: Facilita la preparación reproducible de muestras para obtener lecturas consistentes en ensayos inmunológicos en estudios de interacción con el blanco.
Desarrollo de Pruebas y Tamizaje
- Valor científico: Proporciona muestras preconcentradas con bajo contenido de disolvente, preservando la sensibilidad del inmunoensayo para la detección de moléculas pequeñas.
- Valor operativo: Automatiza los pasos de extracción, mejorando el rendimiento y reduciendo la variabilidad en campañas de cribado de compuestos.
Investigación Traductiva y Preclínica
- Valor científico: Proporciona matrices de muestras relevantes para enfermedades para evaluar el impacto de contaminantes en la expresión de biomarcadores en modelos preclínicos.
- Valor operativo: Permite un flujo de trabajo estandarizado entre tipos de muestras acuosas, favoreciendo la comparabilidad entre estudios en farmacología de seguridad.
Integración de la Línea de Procesamiento y del Flujo de Trabajo
El método se integra en los flujos de trabajo de descubrimiento temprano mediante la preparación de muestras acuosas para análisis inmunológicos, conectando el muestreo ambiental con ensayos de validación de objetivos.
- Biología del Descubrimiento: Apoya la comprobación de hipótesis sobre interacciones entre contaminantes y biomarcadores mediante la extracción limpia de analitos.
- Selección: Proporciona extractos listos para ensayos con recuperación constante, lo que permite la evaluación fiable de bibliotecas de compuestos.
- Análisis: Genera resultados cuantitativos preconcentrados compatibles con lecturas ELISA para análisis comparativo.
- Investigación Translacional: Conecta modelos de exposición ambiental con el monitoreo de efectos preclínicos mediante la preparación estandarizada de muestras.
- Reutilización Empresarial: Establece una plataforma reutilizable para la extracción automatizada en múltiples matrices de muestras acuosas en ensayos de toxicología.
Impacto Operativo y Empresarial
- Valor científico: Confianza predictiva en los resultados de inmunoensayos mediante la eliminación eficaz de interferencias de la matriz y el enriquecimiento del analito.
- Valor operativo: Normalización y reproducibilidad mediante el empaque automatizado de columnas y parámetros de elución controlados.
- Valor estratégico: Mejora en las decisiones de avance o detención en cribados toxicológicos tempranos al reducir los falsos negativos derivados de una extracción ineficiente.
- Impacto en el portafolio: Priorización basada en riesgos de compuestos mediante la detección confiable de contaminantes de baja abundancia en matrices acuosas.
Consideraciones de Implementación
- Conocimientos técnicos en compatibilidad de inmunoensayos y principios de extracción en fase sólida.
- Acceso a sistemas automatizados de manipulación de fluidos capaces de procesar muestras a baja presión.
- Normalización de los protocolos de preparación del sorbente y de elución entre los distintos equipos de laboratorio.
- Consideraciones para la adaptación a diferentes volúmenes de muestra y propiedades fisicoquímicas de los contaminantes.
- Las limitaciones prácticas incluyen los pasos manuales de ensamblaje de columnas antes de la automatización y los requisitos de validación para nuevos pares analito-sorbente.
