Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

El objetivo general de este método es recuperar y analizar todas las entidades moleculares principales, incluyendo metabolitos polares y semipolares, lípidos y proteínas, a partir de una única muestra mediante una sencilla extracción fraccionada con metil-ter-butil éter. En general, los científicos encuentran difícil analizar múltiples clases de compuestos a partir de una sola muestra. Mediante la extracción con MTBE que presentamos aquí, es posible extraer y analizar múltiples clases de compuestos, como lípidos, metabolitos y proteínas, a partir de una única muestra.

La principal ventaja de esta técnica es que puede extraer de forma robusta todas las clases de compuestos moleculares a partir de una pequeña cantidad de una sola alícuota de muestra. Este método ayuda a responder preguntas fundamentales en biología de sistemas, ya que proporciona la base experimental para el análisis multiómico, generando fracciones que pueden utilizarse en análisis mediante proteómica, lipidómica y metabolómica. El siguiente protocolo se demuestra utilizando tejido foliar de Arabidopsis.

Arabidopsis son plantas con flores pequeñas de la familia Brassicaceae, y están emparentadas con la col. Comience este procedimiento enfriando previamente los portamuestras del homogenizador de tejidos en nitrógeno líquido durante al menos 10 minutos. Retire las muestras del nitrógeno líquido y colóquelas en los portamuestras.

Luego retire los porta-tubos del nitrógeno líquido. Coloque rápidamente los porta-tubos en el homogenizador de tejidos y configure el homogenizador para triturar el material biológico en un polvo fino y homogéneo. Para hojas, utilice 20 hertz durante un minuto.

El tiempo y la velocidad de homogenización pueden variar según el tejido. Asegúrese de homogenizar hasta que la muestra resultante sea un polvo muy fino. Además, la muestra debe mantenerse congelada en cada paso de la homogenización.

Homogenice las muestras, luego retire las muestras biológicas de los porta-tubos. Y si no se van a usar inmediatamente, colóquelas en un congelador a menos 80 grados Celsius hasta su posterior extracción. Etiquete cuatro tubos microcentrífugos seguros de fondo redondo de dos mililitros con el número de muestra.

Enfríe previamente los tubos y algunas espátulas sumergiéndolos en nitrógeno líquido. Una vez que los tubos y las espátulas estén fríos, coloque uno de los tubos en una balanza analítica y utilice una espátula para distribuir 25 miligramos de polvo de tejido en el tubo de microcentrifuga. Registre el peso exacto de cada muestra e inmediatamente coloque las muestras alícuotas en nitrógeno líquido.

Realice este paso rápidamente para evitar el deshielo del material vegetal. Almacene las muestras alícuotas a menos 80 grados Celsius hasta su posterior extracción. Para prepararse para la extracción, enfríe previamente el éter metil terc-butilo, o la mezcla de extracción de metanol MTBE, preparada como se describe en el documento adjunto, en un congelador a menos 20 grados Celsius.

Saque las muestras alícuotas y agregue un mililitro de la mezcla de extracción preenfriada a cada tubo de muestra. Realice este paso rápidamente. El MTBE tiene una baja viscosidad y puede gotear fuera de la punta de la pipeta.

Mezcle inmediatamente cada muestra en un mezclador de vórtice hasta que el tejido se homogenice bien dentro de la mezcla de extracción. Mantenga los tubos en un portatubos sobre la bancada hasta que se hayan extraído todas las muestras. Este paso es crítico.

Aquí precipitamos proteínas e inactivamos sus actividades enzimáticas. Incube todas las muestras en un agitador orbital a 100 RPM durante 45 minutos a cuatro grados Celsius. Luego, sonique las muestras durante 15 minutos en un baño de sonicación con hielo.

A continuación, para fraccionar mediante separación de fases, agregue 650 microlitros de una solución de agua y metanol en una proporción de tres a uno a cada tubo de muestra. Luego, mezcle mediante vortex durante un minuto. Centrifugue las muestras a una velocidad de 20,000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Después de este paso, manipule los tubos con cuidado para evitar la mezcla de las dos fases líquidas y para no perturbar el pellet precipitado. En esta etapa, hay dos fases líquidas admisibles con un pellet sólido en el fondo del tubo. La fase superior no polar contiene lípidos.

La fase acuosa inferior contiene metabolitos polares y semipolares. El precipitado contiene proteínas, almidones y la pared celular. Transfiera 500 microlitros del disolvente de la fase superior, que contiene lípidos, a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros etiquetado.

Luego, utilizando una pipeta de 200 microlitros, retire cuidadosamente la fase lipídica restante y deséchela. A continuación, transfiera 400 microlitros del disolvente de la fase inferior a un tubo microcentrífugo de 1,5 mililitros etiquetado. Transfiera una alícuota adicional de 200 microlitros a un tubo microfuge para realizar análisis adicionales, como el análisis de metabolitos mediante cromatografía de gases.

Retire y deseche el resto de la fase acuosa pipeteando el exceso de volumen. A continuación, para lavar el pellet obtenido de proteína-almidón-pared celular, agregue 500 microlitros de metanol y luego vortexee durante un minuto. Centrifugue las muestras a una velocidad de 10.000 ×g durante cinco minutos a cuatro grados Celsius.

Evapore el disolvente de las muestras de lípidos utilizando un evaporador con flujo de nitrógeno para evitar modificaciones oxidativas de los lípidos. Las muestras secas resultantes deben analizarse inmediatamente. Evapore el disolvente de las muestras acuosas durante la noche en un concentrador al vacío sin calentamiento.

Las muestras acuosas secas pueden almacenarse durante varias semanas a menos 80 grados Celsius antes del análisis. Re-suspender las fracciones lipídicas secas en 400 microlitros de una solución de acetonitrilo a 2-propanol en una proporción de siete a tres. Transferir suficiente líquido a viales de vidrio y tapar herméticamente.

Luego, coloque los viales de vidrio en un muestreador automático refrigerado a cuatro grados Celsius. Inyecte dos microlitros por muestra y separe los lípidos en una columna de fase reversa C8 mantenida a 60 grados Celsius utilizando un sistema UPLC que opera a un flujo de 400 microlitros por minuto. Utilice las fases móviles descritas en la Tabla 1 del documento adjunto para la separación cromatográfica.

Adquiera los espectros de masas en modo de ionización positiva y negativa utilizando un instrumento de MS adecuado que cubra el rango de masa entre 150 y 1500 de relación carga-masa. Re-suspenda la fase polar en 200 microlitros de una solución uno a uno de metanol grado UPLC en agua. Transfiera suficiente líquido a viales de vidrio y tápelos firmemente.

Luego, coloque los viales de vidrio en un muestreador automático refrigerado, a cuatro grados Celsius. Inyecte dos microlitros de cada muestra y separe los metabolitos en una columna RP C-18 mantenida a 40 grados Celsius utilizando un sistema UPLC que funcione a un caudal de 400 microlitros por minuto. Utilice las fases móviles para la separación cromatográfica con los parámetros indicados en la Tabla 2 del documento adjunto.

Adquiera espectros de masas de escaneo completo en modo de ionización positiva y negativa utilizando un espectrómetro de masas adecuado que cubra un rango de masas entre 50 y 1500 de relación masa/carga. Finalmente, realice la extracción, digestión y análisis de proteínas, tal como se describe en el documento adjunto. Se recolectaron 25 miligramos de tejido foliar de Arabidopsis, se molieron y se extrajeron antes de someterlos a tres plataformas analíticas de UPLC-MS.

Los metabolitos primarios y secundarios polares y semipolares fueron analizados a partir de la fase polar mediante UPLC-MS en fase reversa C-18. Los cromatogramas de ionización básica de lípidos, mostrados en el panel superior, y de metabolitos semipolares, mostrados en el panel inferior, se analizaron en modo de ionización positiva. El gráfico circular en la esquina superior derecha de cada cromatograma muestra el número de lípidos y metabolitos identificados asignados a diferentes clases químicas.

Por ejemplo, se asignaron 58 lípidos diferentes al grupo de triacilgliceroles, indicados en el gráfico superior como TAG. Metabolitos más hidrofílicos de esta fracción, como azúcares y aminoácidos polares, que no presentan buena retención en el material de fase reversa, pueden analizarse mediante otros métodos analíticos, como GC-MS o cromatografía líquida de interacción hidrofílica. Las proteínas obtenidas a partir de la extracción se digirieron en solución y se analizaron mediante LC-MS en tándem.

El gráfico circular que se muestra en la esquina superior derecha indica el número de proteínas identificadas asignadas a diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, se asignaron 268 proteínas a la categoría de localización. En resumen, más de 200 especies de lípidos, 50 metabolitos semipolares anotados y varios miles de proteínas pueden identificarse rutinariamente a partir de muestras como la utilizada en este ejemplo.

Además, el método mostró una amplia aplicabilidad utilizando diferentes tejidos, órganos y material de cultivo celular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer y analizar la mayoría de los compuestos esenciales a partir de una sola muestra. Al intentar este procedimiento, es importante mantener todas las muestras congeladas, moler adecuadamente el material y usar disolventes y productos químicos de grado analítico.

Tras seguir este procedimiento, se pueden emplear todos los métodos analíticos para determinar la composición molecular de las muestras extraídas.