Un método de extracción fraccionada simple para el análisis comprensivo de metabolitos, lípidos y proteínas a partir de una sola muestra

El objetivo general de este método es recuperar y analizar todas las entidades moleculares principales, incluidos los metabolitos polares y semipolares, los lípidos y las proteínas de una sola muestra utilizando una extracción simple de éter de metil-tributilo fraccionado. En general, a los científicos les resulta difícil analizar múltiples clases de compuestos a partir de una sola muestra. Con la extracción de MTBE que presentamos aquí, puede extraer y analizar múltiples clases de compuestos, como lípidos, metabolitos y proteínas de una sola muestra.

La principal ventaja de esta técnica es que puede extraer de forma robusta todas las clases de compuestos moleculares a partir de una pequeña cantidad de alícuota de una sola muestra. Este método ayuda a responder preguntas fundamentales en biología de sistemas, ya que proporciona la base experimental para el análisis multiómico, proporcionando fracciones que pueden ser utilizadas para el análisis por proteómica, lipidómica y metabolómica. El siguiente protocolo se demuestra utilizando tejido foliar de Arabidopsis.

Las Arabidopsis son pequeñas plantas con flores de la familia Brassicaceae y están relacionadas con el repollo. Comience este procedimiento enfriando previamente los soportes de los tubos del homogeneizador de tejidos en nitrógeno líquido durante al menos 10 minutos. Retire las muestras de nitrógeno líquido y colóquelas en los soportes de los tubos.

Y luego retire los soportes de los tubos del nitrógeno líquido. Coloque rápidamente los soportes de tubos en el homogeneizador de tejidos y configure el homogeneizador para moler el material biológico hasta convertirlo en un polvo fino y homogéneo. Para las hojas, use 20 hercios durante un minuto.

El tiempo y la velocidad de homogeneización pueden variar en función del tejido. Asegúrese de homogeneizar hasta que la muestra resultante sea un polvo muy fino. Y la muestra debe mantenerse congelada en cada paso de la homogeneización.

Homogeneice las muestras y, a continuación, retire las muestras biológicas de los soportes de los tubos. Y si no se van a usar de inmediato, colóquelos en un congelador a menos 80 grados centígrados hasta su extracción. Etiquete cuatro tubos de microcentrífuga de dos mililitros con cierre de seguridad de fondo redondo con el número de muestra.

Enfriar previamente los tubos y algunas espátulas sumergiéndolos en nitrógeno líquido. Una vez que los tubos y las espátulas estén fríos, coloque uno de los tubos en una balanza analítica y use una espátula para alícuota 25 miligramos de polvo de tejido en el tubo de microcentrífuga. Registre el peso exacto de cada muestra y, a continuación, coloque inmediatamente las muestras liquóticas en nitrógeno líquido.

Realice este paso rápidamente para evitar descongelar el material vegetal. Almacene las muestras alícuotas a menos 80 grados centígrados hasta su posterior extracción. Para prepararse para la extracción, enfríe previamente la mezcla de extracción de metil terc-butil éter, o metanol MTBE, preparada como se describe en el documento adjunto, en un congelador a menos 20 grados centígrados.

Saque las muestras alícuotas y agregue un mililitro de la mezcla de extracción preenfriada a cada tubo de muestra. Realice este paso rápidamente. El MTBE tiene una viscosidad baja y puede gotear por la punta de la pipeta.

Mezclar cada muestra inmediatamente en un mezclador de vórtice hasta que el tejido esté bien homogeneizado dentro de la mezcla de extracción. Mantenga los tubos en una rejilla en el banco hasta que se hayan extraído todas las muestras. Este paso es fundamental.

Aquí precipitamos proteínas e inactivamos sus actividades enzimáticas. Incubar todas las muestras en un agitador orbital a 100 RPM durante 45 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, sonicar las muestras durante 15 minutos en un baño de sonicación helado.

A continuación, para fraccionar por separación de fases, agregue 650 microlitros de una solución de tres a uno de agua y metanol a cada tubo de muestra. A continuación, mezcle en vórtice durante un minuto. Centrifugar las muestras a una velocidad de 20.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Después de este paso, manipule los tubos con cuidado para evitar mezclar las dos fases líquidas y evitar alterar el pellet precipitado. En esta etapa, hay dos fases líquidas admisibles con un pellet sólido en el fondo del tubo. La fase superior no polar contiene lípidos.

La fase acuosa inferior contiene metabolitos polares y semipolares. El pellet contiene proteínas, almidones y la pared celular. Transfiera 500 microlitros del solvente de la fase superior que contiene lípidos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado.

A continuación, con una pipeta de 200 microlitros, retire con cuidado la fase lipídica restante y deséchela. A continuación, transfiera 400 microlitros del disolvente de la fase inferior a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros marcado. Transfiera una alícuota adicional de 200 microlitros a un tubo de microfuga para realizar análisis adicionales, como el análisis de metabolitos basado en cromatografía de gases.

Retire y deseche el resto de la fase acuosa pipeteando el exceso de volumen. Luego, para lavar el pellet de pared de proteína-almidón obtenido, agregue 500 microlitros de metanol y luego tórtelo durante un minuto. Centrifugar las muestras a una velocidad de 10.000 veces g durante cinco minutos a cuatro grados centígrados.

Evapore el disolvente de las muestras de lípidos utilizando un evaporador de flujo de nitrógeno para evitar modificaciones oxidativas de los lípidos. Las muestras secas resultantes deben analizarse inmediatamente. Evapore el disolvente de las muestras acuosas durante la noche en un concentrador de vacío sin calentar.

Las muestras acuosas secas pueden almacenarse durante varias semanas a menos 80 grados centígrados antes del análisis. Vuelva a suspender las fracciones lipídicas secas en 400 microlitros de una solución de acetonitrilo de siete a tres a 2-propanol. Transfiera suficiente líquido a los viales de vidrio y cúbralo herméticamente.

A continuación, coloque los viales de vidrio en un muestreador automático refrigerado a cuatro grados centígrados. Inyecte dos microlitros por muestra y separe los lípidos en una columna C8 de fase reversa sostenida a 60 grados Celsius utilizando un sistema UPLC que funcione a un caudal de 400 microlitros por minuto. Utilice las fases móviles descritas en la Tabla 1 del documento adjunto para la separación cromatográfica.

Adquiera los espectros de masas en modo de ionización positiva y negativa utilizando un instrumento MS adecuado que cubra el rango de masas entre 150 y 1500 relaciones carga-masa. Vuelva a suspender la fase polar en 200 microlitros de una solución de metanol de grado UPLC uno a uno en agua. Transfiera suficiente líquido a los viales de vidrio y cúbralo herméticamente.

Luego, coloque los viales de vidrio en un muestreador automático enfriado, a cuatro grados centígrados. Inyecte dos microlitros de cada muestra y separe los metabolitos en una columna RP C-18 sostenida a 40 grados Celsius utilizando un sistema UPLC que funcione a un caudal de 400 microlitros por minuto. Utilice las fases móviles para la separación cromatográfica con los parámetros indicados en la Tabla 2 del documento adjunto.

Adquiera espectros de masas de barrido completo en modo de ionización positiva y negativa utilizando un espectrómetro de masas adecuado que cubra un rango de masas entre 50 y 1500 relaciones masa-carga. Por último, realice la extracción, la digestión y el análisis de proteínas, tal y como se describe en el documento adjunto. Se cosecharon, molieron y extrajeron 25 miligramos de tejido foliar de Arabidopsis antes de someterlo a tres plataformas analíticas UPLC-MS.

Los metabolitos primarios y secundarios polares y semipolares se analizaron desde la fase polar mediante UPLC-MS C-18 de fase reversa. Los cromatogramas de picos de base de los lípidos, mostrados en el panel superior, y los metabolitos semipolares, mostrados en el panel inferior, se analizaron en modo de ionización positiva. El gráfico circular en la esquina superior derecha de cada cromatograma muestra el número de lípidos y metabolitos identificados asignados a diferentes clases químicas.

Por ejemplo, se asignaron 58 lípidos diferentes al grupo triacilglicérido, indicado en el gráfico superior como TAG. Los metabolitos más hidrofílicos de esta fracción, como los azúcares y los aminoácidos polares, que no muestran una buena retención en el material de fase reversa, pueden analizarse mediante otros métodos analíticos, como GCMS o cromatografía líquida de interacción hidrofílica. Las proteínas que se recuperaron de la extracción se digirieron en solución y se analizaron mediante LCMS de escopeta.

El gráfico circular que se muestra en la esquina superior derecha indica el número de proteínas identificadas asignadas a diferentes procesos biológicos. Por ejemplo, se asignaron 268 proteínas a la categoría de localización. En resumen, más de 200 especies de lípidos, 50 metabolitos semipolares anotados y varios miles de proteínas se pueden identificar de forma rutinaria a partir de muestras como la utilizada en este ejemplo.

Además, el método mostró una amplia aplicabilidad utilizando diferentes tejidos, órganos y material de cultivo celular. Después de haber visto este video, debería tener una buena comprensión de cómo extraer y analizar la mayoría de los compuestos esenciales de una sola muestra. Al intentar este procedimiento, es importante mantener todas las muestras congeladas, moler el material correctamente y utilizar disolventes y productos químicos de grado analítico.

Siguiendo este procedimiento, se pueden emplear todos los métodos analíticos para determinar la composición molecular de las muestras extraídas.