Seguimiento In Vivo del Desarrollo del Edema y Patología Microvascular en un Modelo de Malaria Cerebral Experimental usando Imágenes de Resonancia Magnética

El objetivo general de este método es monitorear los cambios patológicos de la malaria cerebral experimental in vivo. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la patogénesis de la malaria cerebral experimental, ya que nos permite visualizar in vivo cómo evoluciona la patología de todo el cerebro en el espacio y en el tiempo. De este modo, la técnica permite una evaluación detallada de la patología cerebral y puede utilizarse para evaluar la eficacia de nuevas estrategias de tratamiento contra la malaria cerebral.

La realización de la resonancia magnética correrá a cargo de Manuel Fischer, nuestro director de laboratorio. Comience recolectando mosquitos hembra de su jaula, de 17 a 22 días después de la ingesta de sangre. Use fórceps para colocar tres o cuatro mosquitos en un portaobjetos de vidrio, combinado con una gota de medio RPMI frío.

Luego, coloque el portaobjetos bajo un microscopio. Estire cuidadosamente el mosquito entre la cabeza y el cuerpo con pinzas, y use una jeringa y una aguja para aislar la glándula salival. A continuación, recoja las glándulas salivales del portaobjetos de vidrio succionándolas con una pipeta de vidrio y transfiriéndolas al tubo de centrífuga de 1,5 mililitros.

Luego, use un pequeño palo de plástico para aplastar las glándulas salivales aisladas dentro del tubo de centrífuga durante tres minutos para aislar los esporozoítos del tejido de la glándula salival. Centrifugar durante tres minutos a 1.000 veces g y cuatro grados centígrados para purificar los esporozoítos del tejido restante. Pipetear el sobrenadante, que contiene los esporozoítos, en un nuevo tubo de centrífuga y contar los esporozoítos purificados en un hemocitómetro de Neubauer.

Los esporozoítos muestran un movimiento típico en sentido contrario a las agujas del reloj. A continuación, ajuste la concentración de los esporozoítos purificados a 10.000 por mililitro añadiendo solución salina tamponada con fosfato. Por último, coloque un ratón C57BL/6 en un bloqueador y sumerja su cola en agua tibia para visualizar mejor la vena de la cola.

A continuación, inyecta un total de 1.000 esporozoítos, o 0,1 mililitros, en la vena de la cola para iniciar la infección. Comience llevando el ratón a un escáner de resonancia magnética para animales pequeños de 9,4 T, o MRI, que utiliza un resonador de volumen para la transmisión por radiofrecuencia. Luego, aplique el ungüento oftálmico de dexpantenol en ambos ojos.

Encienda el baño de agua con temperatura controlada a 42 grados centígrados para mantener la temperatura corporal del mouse. Luego, coloque un catéter de vena de cola en la vena de la cola del ratón. A continuación, coloque el ratón para la resonancia magnética colocándolo boca abajo y con la espalda arrugada sobre una cama de animales equipada con una llave de cabeza y una barra de dientes para minimizar el movimiento de la cabeza.

Tenga cuidado de no enderezar la columna cervical del ratón. Conecte un sistema de inyección de agente de contraste lleno de 0,3 milimoles por kilogramo de Gd-DTPA al catéter de la vena de cola. A continuación, coloque la bobina del cabezal del receptor de superficie Phased Array de 4 canales en la cabeza del mouse.

Finalmente, coloque una almohadilla para respirar en la parte posterior del mouse y verifique la respiración en el dispositivo de monitoreo. Encienda el láser posicional presionando F2 en el panel de control y mueva el mouse hasta que la luz posicional horizontal esté en el medio de la parte más pequeña de la bobina, que cubre la cabeza del mouse. Apague el láser posicional pulsando F2 de nuevo y, a continuación, mueva el ratón a la posición final pulsando F3 en el panel de control.

Comience realizando un escaneo de localización para asegurarse de que el cerebro del ratón esté en el isocentro del imán. Evaluar cualitativamente el edema vasogénico mediante el uso de imágenes 3D ponderadas en T2. Seleccione una secuencia RARA de varios cortes y ajuste la posición del corte, asegurándose de que todo el cerebro, desde la nariz hasta el cerebelo, esté cubierto.

Después de ajustar los cortes de saturación, inicie la secuencia y espere 10 minutos y 48 segundos para adquirir las imágenes. A continuación, realice la relaxometría T2 para evaluar cuantitativamente el edema vasogénico seleccionando una secuencia de eco de múltiples cortes y espines múltiples. Ajuste la posición del corte e inicie la adquisición de la secuencia, que tarda ocho minutos y 53 segundos.

Para evaluar cuantitativamente tanto el edema vasogénico como el edema citotóxico, se deben realizar imágenes ponderadas por difusión seleccionando una secuencia de difusión EPI de espín-eco. Ajuste la posición del corte y el corte de saturación. A continuación, inicie la secuencia y espere siete minutos y 56 segundos hasta que se adquieran las imágenes sin procesar.

A continuación, evalúe las microhemorragias mediante imágenes 3D T2 ponderadas en estrellas. Seleccione una secuencia FLASH con compensación de flujo, ajuste la posición del corte e inicie la secuencia, que se ejecuta durante 15 minutos y 40 segundos. Posteriormente, evalúe la permeabilidad arterial mediante angiografía de tiempo de vuelo seleccionando una secuencia FLASH 3D.

Ajuste la posición del corte, inicie la secuencia y, a continuación, espere siete minutos y 16 segundos hasta que se adquieran las imágenes. Por último, evaluar la alteración de la barrera hematoencefálica. Seleccione una imagen 3D ponderada en T1 con una secuencia FLASH, ajuste la posición del corte e inicie la secuencia.

Espere un minuto y 14 segundos hasta que se obtengan imágenes sin contraste. A continuación, inyecte un contraste de 0,3 milimoles por kilogramo y repita la medición. Un aumento en la interrupción de la barrera hematoencefálica y un aumento de líquido indican un edema vasogénico temprano en el bulbo olfatorio que ya está presente en la enfermedad leve y comienza a extenderse hacia el tronco encefálico a medida que aumenta la gravedad de la enfermedad.

En los mapas T2, la gravedad del edema vasogénico se puede cuantificar dibujando las regiones de interés en regiones anatómicas específicas. Para cada región, se puede obtener un tiempo de relajación T2 que aumenta con el aumento del edema. Además, el volumen cerebral indicativo de edema comienza a aumentar significativamente en los ratones moderadamente enfermos en comparación con los basales, y aumenta aún más en los ratones gravemente enfermos.

Por último, la patología microvascular, evidenciada por las microhemorragias y el aumento de la susceptibilidad de los vasos contrastantes, se produce tras los primeros signos de ruptura de la barrera hematoencefálica en el edema vasogénico. Estas microhemorragias se producen predominantemente en el bulbo olfatorio. Si se obtiene todo el protocolo de resonancia magnética, todas las imágenes, incluido el posicionamiento, se pueden obtener en una hora, si se realiza correctamente.

El protocolo mínimo debe incluir una secuencia ponderada en T2 o relaxometría en T2, y una secuencia ponderada en estrella en T2 para juzgar la presencia de edema vasogénico, carga de microhemorragia y deterioro microvascular. Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo la resonancia magnética de todo el cerebro visualiza los cambios patológicos en la malaria cerebral experimental, incluidos cambios como la hinchazón del cerebro, que es difícil de detectar ex vivo.