Microscopia intravital de la microcirculación del cerebro del ratón con una ventana craneal cerrado

El objetivo general de este procedimiento es estudiar la microcirculación en el cerebro del ratón mediante microscopía intravital, que permite rastrear los cambios dinámicos en los marcadores hemodinámicos e inflamatorios en la microcirculación de la pila durante largos períodos de tiempo. Esta técnica se desarrolló en el Instituto de Bioingeniería de La Jolla, donde se utilizó para muchos tipos de estudios. Por ejemplo, el seguimiento de los cambios hemodinámicos durante el curso de la infección por Plasmodium burgi onca y en el momento de la expresión de la malaria cerebral.

Esto se logra implantando primero una ventana craneal crónica dos semanas antes de los estudios de microscopía intravital. El segundo paso del procedimiento es registrar la morfología general de la ventana craneal utilizando una imagen digital de alta resolución a bajo aumento. El tercer paso del procedimiento consiste en adquirir imágenes de microscopía intravital utilizando iluminación convencional y fluorescente, y seleccionar sitios de estudio específicos para las mediciones en línea del diámetro de los vasos y la velocidad de los glóbulos rojos.

El paso final del procedimiento es realizar un análisis intravital de la adherencia de leucocitos y plaquetas en los vasos de la pila a través de anticuerpos específicos marcados con fluorescentes. En última instancia, se pueden obtener resultados que muestran in vivo, cambios microcirculatorios en modelos de espejo cerebral de condiciones fisiológicas, fisiopatológicas o enfermas a través de la microscopía intravital cerebral para establecer los cambios hemodinámicos asociados con estas condiciones. La principal ventaja de esta técnica es que observamos el cerebro en su entorno fisiológico sin exponerlo a agentes externos o medios artificiales: la microscopía intravital en comparación con la imagen, la resonancia magnética y la angiografía tiene una resolución espacial y temporal y nos permite mirar desde el nivel microscópico al microscópico.

Este método puede ayudar a responder preguntas clave en la fisiología y fisiopatología de la microcirculación cerebral, como el cambio hemodinámico e inflamatorio durante la enfermedad aguda y crónica dos o tres semanas antes de la microscopía intravital. Se realiza una craneotomía en ratones de ocho a 10 semanas de edad, se demuestra previamente que no se coloca una barra de titanio en la cabeza del animal. La ventana craneal crónica es una preparación estable, que permite examinar la microcirculación de la pila incluso meses después de haber sido implantada el día del experimento.

En primer lugar, se comprueba la temperatura corporal del animal antes de colocarlo en un marco estereotáxico infundido previamente preparado con eritrocitos marcados con fluorescencia a través de la vena de la cola del ratón. Esto permitirá el seguimiento de los eritrocitos, que se demostrará más adelante. A continuación, anestesiar ligeramente al ratón con isde flúor.

4% para inducción, uno a 2% para mantenimiento. A continuación, coloque al animal en posición prona en un marco estereotáxico sobre una almohadilla térmica. Asegure la cabeza con cuidado con las barras para los oídos y ajuste el nivel con las palancas derecha e izquierda.

Limpie suavemente el cubreobjetos de la ventana craneal con un bastoncillo de algodón humedecido con aceite mineral. Luego, usando un microscopio estereoscópico conectado a una cámara digital, tome algunas fotografías panorámicas de los vasos debajo de la ventana. Después de transferir las fotos panorámicas a una computadora, seleccione la mejor para imprimir, identificar y fechar.

Esta foto se utilizará como mapa para las mediciones del diámetro de los vasos y las velocidades de los glóbulos rojos, que se demostrarán a continuación para comenzar la microscopía intravital. Transfiera el ratón a una platina de microscopio intravital personalizada. Colocar una gota de agua sobre la ventana craneal aprovechando el pozo formado por el acrílico dental.

Se utiliza un objetivo de inmersión en agua de 20 x con una apertura numérica de 0,5. Las imágenes se registran utilizando dos cámaras, una cámara digital de alta velocidad y poca luz conectada a una computadora y un monitor, y una cámara analógica con poca luz conectada a una cinta VCR, una marca de tiempo y un monitor a color antes de seleccionar los vasos para la medición, verificar los vasos para evaluar la calidad de la preparación y si la sangre fluye en todos los vasos, A continuación, seleccione los recipientes que se van a medir. Deben incluir lugares y arterias de diferentes diámetros y cubrir diferentes lugares dentro del área expuesta por la ventana.

En nuestro experimento, seleccionamos 12 vasos para la medición a medida que visualiza varios campos dentro de la ventana craneal. Para seleccionar los vasos, anotar la ubicación precisa de cada punto a medir en la foto de la vasculatura PY que se tomó anteriormente para cada punto, el diámetro del vaso se mide utilizando un dispositivo de cizallamiento de imagen. Una vez seleccionado el punto, la imagen del buque se alinea en posición vertical y la imagen se corta hasta que quede lo contrario.

Los extremos se alinean y la lectura se documenta. Para el seguimiento de eritrocitos, la cámara digital graba cada punto durante al menos 30 segundos y las imágenes de vídeo se graban a 150 fotogramas por segundo. Esta velocidad se establece para obtener de una a seis imágenes de una célula en un fotograma de vídeo para la determinación de velocidades de hasta seis milímetros por segundo.

Una vez realizada la recogida de datos, retire el ratón del marco estereotáxico y devuélvalo a su jaula para recuperarse de la anestesia utilizando el software adecuado. Las imágenes de vídeo adquiridas son digitalizadas y XY. Se obtienen datos de coordenadas para cada imagen de celda. Las posiciones de las celdas se determinan manualmente en lugar de mediante análisis de imágenes.

Dado que el ojo de un observador entrenado da una buena estimación de la ubicación del centro de una célula, que en general corresponde a la ubicación de la fluorescencia máxima observada. Para la mayoría de las orientaciones de celdas, las determinaciones de posición y velocidad se realizan para 15 celdas en cada recipiente. Un promedio para obtener la velocidad media de los glóbulos una vez que se dispone de mediciones del diámetro del recipiente y de la velocidad de los glóbulos rojos.

El cálculo del flujo sanguíneo en cada vaso se puede realizar utilizando la fórmula Q igual a D sobre dos al cuadrado por PI por V, donde Q es igual al flujo sanguíneo, V es igual a la velocidad de los glóbulos rojos y D es igual al diámetro de los vasos para la evaluación de la profusión y el análisis de la adherencia leucocitaria en los vasos de las pilas. La microscopía intravital se realiza en un animal infundido con una mezcla de albúmina marcada con FSE y anticuerpos contra el marcador de pan-leucocitos CD 45 marcado con Texas Red. La albúmina marcada con fluorescencia permite una mejor visualización de la red vascular, incluidos los vasos penetrantes, y es particularmente útil en estados de enfermedad como la malaria cerebral para verificar si hay vasos no perfundidos o subperfundidos.

Los anticuerpos anti CD 45 marcados con fluorescencia facilitan la identificación y cuantificación del rodaje de leucocitos y la adhesión a los vasos de las pilas. La cuantificación de la adhesión de los leucocitos se realiza contando el número de leucocitos en un vaso de 100 micras de longitud. El rodaje se cuantifica contando el número de leucocitos que viajan a una velocidad significativamente más lenta que la velocidad de la sangre en la misma longitud de 100 micras durante 30 segundos. Mostrado.

A continuación, se muestra un ejemplo de mediciones microvasculares de la velocidad de los glóbulos rojos mediante el seguimiento celular de fluorescencia de alta velocidad. Las imágenes de grabaciones de video de la A a la F son imágenes secuenciales de la microcirculación. Cada imagen representa la posición de un solo glóbulo rojo que fluye, que es capturado fotograma a fotograma por fotograma por la cámara de alta velocidad.

Este gráfico de un experimento representativo muestra los cambios en el flujo sanguíneo de las pilas a lo largo del tiempo. En ratones infectados con plasmodium, burgi, onca y en ratones de control no infectados, mientras que en ratones de control, el flujo sanguíneo de la pila es relativamente estable a lo largo del tiempo. Los ratones infectados con PBA muestran una disminución del flujo sanguíneo en un momento de desarrollo de la malaria cerebral.

Al sexto día, la tinción con anticuerpos fluorescentes rojos anti CD 45 de Texas revela un gran número de leucocitos adheridos a los vasos de un ratón infectado con Plasmodium burgi onca. Este procedimiento tiene una amplia gama de aplicaciones además del trabajo que aquí se realiza hoy. Cualquier técnica óptica que se pueda utilizar in vivo se puede adaptar a este modelo y en este modelo se pueden estudiar parámetros como el tejido, el nivel de oxígeno en el tejido, las especies reactivas de oxígeno en el pH y la interacción endotelial con los leucocitos.