Aislar y analizar células del páncreas mesénquima por Citometría de Flujo

El objetivo general de este procedimiento es aislar las células mesenquimales pancreáticas para su análisis de expresión génica y de marcadores de superficie. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo del desarrollo del páncreas, como qué señales expresan las células mesenquimales y cómo influyen en el desarrollo epitelial. Las principales ventajas de esta técnica son que es relativamente sencilla y rápida, y que permite un buen rendimiento de células clasificadas.

Comience depositando los órganos internos en una placa de cultivo que contenga HBSS y colocando la placa bajo un microscopio estereoscópico. Separe el hígado y los riñones para exponer el páncreas usando pinzas finas para extraer el páncreas del estómago, el duodeno y el bazo. A medida que se recolecta cada páncreas, transfiera el tejido a un tubo cónico que contenga tampón digestivo recién preparado y coloque el tubo en hielo.

Cuando se hayan recolectado todos los páncreas, transfiera los tejidos a un bloque calefactor de 37 grados centígrados durante 30 minutos con agitación a 700 RPM, invirtiendo manualmente los tubos tres o cuatro veces después de 15 minutos. Si todavía quedan trozos grandes de páncreas después de la primera mitad de la digestión, invierta el tubo cada cinco minutos durante los últimos 15 minutos e incube el tejido durante cinco a 10 minutos adicionales según sea necesario. Al final de la digestión, coloque los tubos en hielo y agregue 10 mililitros de HBSS frío a cada muestra.

Recoja las células por centrifugación y vuelva a suspender los gránulos en dos mililitros de PBS fresco. A continuación, filtre las células a través de coladores de 35 micras en tubos de recolección de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros y lave los tubos de digestión con dos mililitros de PBS fresco, colando los lavados en sus tubos de recolección correspondientes. A continuación, vuelva a centrifugar las células y aspire cuidadosamente los sobrenadantes sin alterar los gránulos.

Vuelva a suspender las células en un tampón de clasificación de acuerdo con la edad de los animales y fíltrelas a través de nuevos filtros de células de 35 micras en nuevos tubos de recolección de cinco mililitros. Alícuota de 50 a 100 volúmenes de microlitros de células en nuevos tubos FACS para los controles de tinción, incluyendo un tubo para cada fluoróforo, el colorante de viabilidad, las proteínas fluorescentes y un control sin teñir. Lave cada tubo con hasta cuatro mililitros de tampón de clasificación y luego centrifuga.

A continuación, vuelva a suspender los pellets en un tampón de clasificación fresco de acuerdo con la edad de los animales. A continuación, tiñe las células con el tinte de viabilidad. Para la clasificación de células antes de la extracción de ARN, inmediatamente antes del comienzo de la clasificación, recubra un tubo de recolección estéril de 1,5 mililitros con un mililitro de tampón de clasificación que contenga un inhibidor de ARNasa.

Después de cinco minutos, agite el tubo de recolección y retire el líquido. Vortex, el primer control de tinción, y cargue el tubo en el citómetro de flujo para comenzar a determinar los parámetros de clasificación. Cuando se hayan establecido todos los parámetros de clasificación, cargue las muestras y clasifique las celdas en tubos de recolección de 1,5 mililitros.

A continuación, recoja las células clasificadas por centrifugación. Aspire el sobrenadante hasta el gránulo y extraiga el ARN de acuerdo con los protocolos estándar de extracción de ARN. Aquí, se muestra el tracto gastrointestinal completo aislado, incluyendo el estómago, el bazo, el intestino y el páncreas de un embrión embrionario de 15,5 días y una cría postnatal de cuatro días.

El análisis de citometría de flujo de células individuales de tejidos pancreáticos embrionarios, neonatales y adultos aislados como se acaba de demostrar revela que los tejidos pancreáticos transgénicos de todas las edades analizadas contienen distintas poblaciones de células marcadas con YFP. Después de la clasificación, estas células mesenquimales se pueden cultivar para establecer una línea celular durante al menos cinco pasajes. Obsérvese la morfología fibrótica de las células cultivadas típica de las células mesenquimales.

Las células clasificadas expresan el marcador panmesenquimatoso vementina, analizado por qPCR después de la extracción de ARN y la síntesis de ADNc. Además, la expresión aislada de marcadores de superficie de células pancreáticas indica que todas las células marcadas con fluorescencia en el páncreas transgénico YFP expresan CD9, una glicoproteína de la superficie celular que, según se informa, expresan los fibroblastos. Siguiendo este procedimiento, se pueden realizar otros métodos, como la secuenciación del ARN, para responder preguntas adicionales sobre la expresión génica de las células mesenquimales.