Islote pancreático inclusión de secciones de la parafina

Este método puede ayudar a los científicos a maximizar el uso productivo de los islotes pancreáticos para evaluar múltiples resultados en cada muestra en su arquitectura de tejido nativo. La principal ventaja de este nuevo método de inclusión es que los islotes se distribuyen uniformemente en un área bien definida, colocando muchos islotes en el plano de sección, lo que optimiza el rendimiento experimental de este material de baja abundancia. El Dr. Yahui Kong, investigador asociado de mi laboratorio, demostrará el procedimiento.

Para comenzar este procedimiento, utilice una punta de pipeta p200 de baja unión y una rejilla calibrada bajo un microscopio estereoscópico para seleccionar a mano 250 islotes equivalentes. Transfiriéndolos a cada tubo de microfuga de baja unión de 1,5 mililitros. Deje que los islotes se asienten en el fondo del tubo de microfuga.

A continuación, utilice una pipeta con una punta p200 nueva para eliminar con cuidado la mayor parte del sobrenadante. Asegurándose de no eliminar ningún islote. Agregue un mililitro de PBS y centrifugue en una centrífuga de cubo oscilante hasta que la velocidad alcance 200 veces la gravedad y luego detenga el centrifugado.

Retire el sobrenadante. Repita todo este proceso de lavado de PBS durante un total de dos ciclos de lavado. A continuación, agregue 500 microlitros de solución de formalina al 10% o paraformaldehído recién hecho al 4%.

Deje que la muestra se fije a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de esto, use una pipeta con una punta p200 para quitar el fijador. Agregue un mililitro de PBS y centrifugue hasta que la velocidad alcance la gravedad de 200 veces y luego detenga el giro.

Retire el sobrenadante y luego repita todo el proceso de lavado de PBS una vez más para un total de dos ciclos de lavado. Prepare el gel deseado en tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros como se describe en el protocolo de texto. A continuación, coloque estos tubos de microcentrífuga en un bloque térmico a 70 grados centígrados para calentar el gel.

Utilice una punta de micropipeta cortada para transferir 10 microlitros de perlas de azul de agarosa por muestra a un tubo de microcentrífuga limpio de 1,5 mililitros. Agregue un mililitro de PBS a las cuentas, luego centrifugue a 800 veces la gravedad durante un minuto. Retire el PBS y repita este lavado una vez más.

Después del segundo lavado, vuelva a suspender las perlas en una cantidad adecuada de PBS. Centrifugar los tubos que contienen los islotes hasta que la velocidad alcance 200 veces la gravedad y luego detener el giro. Retire la mayor parte del sobrenadante.

Con unas tijeras, corte el extremo de una punta de micropipeta de 10 microlitros para cada muestra. Agregue 10 microlitros de perlas a cada tubo de islote usando una punta de corte limpia para cada muestra. Luego centrifugar hasta que la velocidad alcance 200 veces la gravedad.

Después de esto, use una punta de 200 microlitros sin cortar seguida de una punta de 10 microlitros para eliminar la mayor cantidad posible de PBS. Etiquete los portaobjetos del microscopio para la identificación de la muestra y colóquelos en el banco cerca del bloque térmico con el gel calentado. Con unas tijeras, corte los extremos de algunas puntas de micropipeta de baja fijación por muestra.

Con una micropipeta equipada con una punta cortada, agregue gel tibio a un tubo que contenga islotes y perlas. Mezclar inmediatamente evitando la creación de burbujas. Aplique esta mezcla a un portaobjetos formando un disco cerca del borde del portaobjetos dejando espacio para el anillo de gel exterior.

A continuación, golpee suavemente la corredera unas cuantas veces para asentar los islotes y las cuentas. Agregue 20 microlitros de gel tibio al tubo de muestra y mezcle el nuevo gel con los islotes y perlas restantes. Aplique esta mezcla en el mismo portaobjetos que rodea el disco original.

Repita según sea necesario utilizando puntas precortadas nuevas para cada aplicación hasta que el disco tenga el tamaño y el grosor deseados. Asegúrese de preparar cada disco individualmente y de realizar un seguimiento del orden de las muestras si coloca varios discos en cada lado. A continuación, coloque los portaobjetos sobre una superficie plana de hielo húmedo y cúbralos.

Deje reposar los portaobjetos durante 10 minutos o hasta que el gel se solidifique. Luego, retira los portaobjetos asegurándote de secar la parte posterior de cada uno. Etiquete un casete de tejido de procesamiento e inclusión de biopsia para cada muestra.

Use el borde romo de una hoja de afeitar para empujar suavemente el disco desde cada dirección para liberarlo del vidrio. Cuando se deslice fácilmente, empuje lentamente el disco fuera de la corredera y coloque el disco con el lado plano hacia abajo directamente sobre el papel. Puede ser difícil mantener intactos los distintos discos mientras se deslizan desde el portaobjetos de vidrio hasta el papel.

Si se produce una arruga en el disco, deje que vuelva a su posición original, agregue más gel y vuelva a gelificar el portaobjetos. Dobla el papel alrededor del disco para evitar que se mueva. Transfiera esto al casete y luego cierre el casete.

Sumerge el casete en un vaso de precipitados lleno de PBS. En este estudio, se utiliza un método de inclusión basado en disco de gel modificado para generar de manera eficiente un alto rendimiento de islotes por sección. La morfología de los islotes de roedores es notablemente más intacta después de la recuperación posterior al aislamiento en el medio de islotes, mostrando una superficie lisa y redondeada y una forma esférica compacta.

El hecho de que la morfología de los islotes humanos sea similar, independientemente de si está incrustada el día de la llegada o después de la recuperación posterior al envío durante la noche, podría deberse a que los islotes se recuperan del estrés de aislamiento antes del envío. En comparación, se observa que las secciones de parafina obtenidas a través de la antigua técnica de microtubos tienen un área de sección transversal de tejido más pequeña con menos islotes por sección y con islotes y perlas densamente empaquetados. Como se muestra aquí, esta técnica es capaz de producir secciones de islotes de alta calidad para la tinción histológica y de inmunofluorescencia.

La tinción con insulina y glucagón muestra la composición diversa y la heterogeneidad de la arquitectura de los islotes, lo que demuestra las diferencias arquitectónicas conocidas entre los islotes humanos, de ratón y de rata. Estas imágenes también representan secciones seriadas de los mismos islotes. Demostrando que esta técnica es capaz de obtener múltiples secciones de los mismos islotes.

Una vez dominada, esta técnica ahorra tiempo en comparación con la técnica de microcentrífuga. La formación del disco en una superficie plana en lugar de en un tubo facilita la transferencia física del disco al casete para su procesamiento. Aunque este método puede proporcionar información sobre la biología de los islotes, también se puede aplicar a otros bloques de células o tejidos friables que son difíciles de seccionar.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar usar un gel de volumen pequeño para concentrar el tejido en un área pequeña y formar el disco en una superficie plana. También es fundamental utilizar tubos de microcentrífuga de baja unión y puntas de pipeta para mejorar el rendimiento del tejido. Esta técnica allana el camino para que los investigadores en el campo de la biología de los islotes exploren la composición y heterogeneidad del tipo de célula, la interacción célula-célula y la regulación génica en islotes cultivados completos en su arquitectura nativa.

La capacidad de generar 10 o más secciones que contienen muchos islotes a partir de una sola condición experimental permite la cuantificación de múltiples resultados en el mismo material, mejorando la eficiencia experimental. La aplicación de esta técnica a muestras de tejido de abundancia limitada también puede ofrecer beneficios a otros campos. Es posible que sea necesario modificar los elementos de este procedimiento para satisfacer las necesidades del usuario.

Se debe optimizar la intensidad de fijación y la división. Con esta técnica se puede generar un disco más grueso o más grande. Es posible que sea necesario anidar pasos de procesamiento simples para la incrustación y optimizarlos.

Después de ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo generar un bloque de células de agarosa de alta calidad para secciones de parafina de islotes pancreáticos cultivados completos.