Name: Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 46 s
Description: Aprende a generar cultivos celulares derivados de pacientes con glioma pontino intrínseco difuso mediante procesamiento post-mortem rápido. Este método permite estudiar directamente la biología tumoral y evaluar estrategias terapéuticas en diferentes subtipos genéticos.

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Los autores agradecen el apoyo de la Fundación McKenna Claire, Instituto Nacional de Trastornos Neurológicos y Accidentes Cerebrovasculares (NINDS K08NS070926 y R01NS092597), Departamento de Defensa (NF140075), Instituto de Medicina Regenerativa de California (CIRM RB4-06093 y RN3-06510), limonada de Alex Soporte Fundación, la curación comienza ahora Fundación y DIPG de colaboración, Fundación Lyla Nsouli, Desvela cáncer pediátrico, tumor Foundation encefálico infantil, Fundación Mateo Larson, Fundación V, Fondo de la Familia Godfrey en la memoria de Fiona Penélope, la Fundación Wayland Villars DIPG, el Dylan Jewett , Connor Johnson, Zoey Ganesh, Dylan Frick, Abigail Jensen, y Jennifer Kranz Fondos Memorial, Fundación N8, Virginia y DK Ludwig Fondo para la Investigación del cáncer, Instituto de Investigación de Salud infantil en Stanford Anne T. y Robert M. Bass dotado Facultad de becas en Pediatric cáncer y enfermedades de la sangre.

Este protocolo se ha realizado con la aprobación de nuestro comité de revisión institucional apropiada con des-identificación de todos los datos del paciente y de acuerdo a todas las directrices institucionales, nacionales e internacionales para el bienestar humano. Obtener toda la debida aprobación institucional junta de revisión y el consentimiento informado de la familia del paciente antes de trabajar con este protocolo. 1. obtener muestras de tejido NOTA: Un componente crítico de este protocolo requiere un manejo adecuado de la donación de tejidos a partir de inmediato en el momento de la autopsia. La viabilidad global de la muestra depende en gran medida de reducir al mínimo el intervalo post mortem (PMI), transferir inmediatamente el tejido en el medio frío adecuado suplementado con antibióticos / antimicóticos, manteniendo la muestra en hielo húmedo durante todo el transporte, y el mantenimiento de una técnica estéril durante todo el protocolo. <ol><li> Tras la notificaciónde una donación inminente, preparar un kit de recogida de muestras. El uso de una caja de envío con un recipiente aislado que se puede utilizar directamente para el transporte de vuelta de la muestra de tejido, incluyen los siguientes materiales: <ol><li> Incluir materiales para la preparación estéril, incluyendo guantes estériles, cortinas y escalpelos. </li><li> Incluir 8 - 10 50 tubos cónicos estériles ml que contenían 30 ml de medios de envío en el recipiente aislado con hielo o compresas frías. NOTA: Si bien cualquier medio de cultivo celular estándar puede trabajar, la mejor viabilidad muestra se obtiene con Hibernate-A suplementado con antibióticos / antimicótico. </li><li> Incluya todos los tubos de muestras adicionales para otros análisis (por ejemplo, fijadores). </li><li> Si la autopsia no se llevará a cabo en las instalaciones del investigador, incluirá un documento que establece claramente cómo recoger la muestra de tumor. Esto incluye detalles tales como el mantenimiento de la esterilidad, manteniendo los tubos de muestras en hielo húmedo, e incluyendo muestras del cerebro medio y médula como tumor células a menudo invaden estas regiones. </li></ol></li><li> Mantener la esterilidad durante la autopsia. Considere el cerebro dentro del cráneo estéril, por lo que observar una técnica estéril (incluyendo guantes cambiantes) una vez que el cráneo está abierto. Evitar la contaminación con la piel y el cabello es crítico. </li><li> Disecar el tumor desde el lado ventral (el &quot;vientre&quot; de la protuberancia, ver Adicional Figura 1). Con un bisturí estéril, cortar pequeños trozos de 1 cm de tumor y transferir inmediatamente en los medios de comunicación Envío frío (ver nota en el paso 1.1.2) y poner en hielo húmedo. Colocar 10 ml de tejido en cada tubo, lo que resulta en un volumen final de tejido y medios de comunicación en cada tubo de 40 mL. NOTA: En el caso de DIPG, el tumor infiltra difusamente la protuberancia y frecuentemente el resto del tronco cerebral. Como tal, recoger la mayor cantidad de la muestra como sea posible, típicamente incluyendo 3 - 4 tubos (30 - 40 ml de tejido) de protuberancia y 1 - 2 tubos (10 - 20 ml de tejido) cada uno de cerebro medio y médula. </li><li> recoger samples del cerebro medio y médula yuxtapuesta a la protuberancia, que a menudo contienen muchas células tumorales. </li><li> Después de la recogida de muestras, enviar las muestras S / N en el hielo húmedo en el contenedor aislado. No envíe la muestra en hielo seco, como la congelación mata las células. </li></ol> 2. Preparación para el Procesamiento de Muestras <ol><li> Antes de comenzar la preparación de muestras, esterilizar campana de cultivo de tejidos junto con hojas de afeitar, pinzas hemostáticas curvas, y cualesquiera otras herramientas no estériles bajo luz UV durante 1 h. Realizar todos los pasos siguientes en condiciones estériles para evitar la contaminación de los cultivos. </li><li> Preparar y soluciones de filtro estériles. <ol><li> Para preparar la solución 1,8 M de sacarosa, se disuelven 308,07 g de sacarosa en 300 ml de agua destilada. Añadir 50 ml de 10x de Hank tamponada Solución Salina (HBSS) sin calcio o magnesio y llevar a volumen total a 500 ml con agua destilada. Almacenar a 4 ° C. </li><li> Para preparar la solución de digestión enzimática, tomar 50 ml de HBSS con el calcio y el magnesio por cada 10 ml de tejido picado y añadir 500 l 5 mg / ml de desoxirribonucleasa I (concentración final de 50 mg / ml), 500 l 2,5 mg / ml de colagenasa I / II y la solución de dispasa (concentración final 25 g / ml) y 500 l de tampón 1 M HEPES. Precalentar solución de digestión en un baño de agua a 37 °. </li><li> Para preparar los medios de la base del tallo del tumor (TSM), mezclar 250 ml Neurobasal-A, medio Eagle modificado de 250 ml Dulbecco: Nutriente F12 Mezcla (DMEM / F12), 5 ml 100x antibiótico-antimicótico, 5 ml de 200 mM de L-alanil-L- dipéptido de glutamina (GlutaMAX-A), 5 ml de tampón HEPES, 5 ml de piruvato sódico 100 mM, y 5 ml 100x MEM aminoácidos no esenciales. </li><li> Para preparar completa TSM con factores de crecimiento, añadir los siguientes suplementos a base de TSM: 50x B27 Suplemento Minus vitamina A (1:50), factor de crecimiento epidérmico humano (H-EGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento de fibroblastos humano (H- FGF, 20 ng / ml), factor de crecimiento derivado de plaquetas humano AA (H-PDGF-AA, 10 ng / ml),humano derivado de plaquetas factor de crecimiento BB (H-PDGF-BB, 10 ng / ml), y la solución de heparina (2 mg / ml). </li></ol></li><li> Pre-enfriar una centrífuga de laboratorio equipado con un rotor basculante-cubo a 4 ° C. </li></ol> 3. disociación mecánica <ol><li> Transferir el tejido en un 100 mm x 20 mm placa de altas paredes de cultivo celular. Retirar los restos de los medios de envío y reemplazar con 10 - 15 ml de medio de cultivo frío. </li><li> Usando las pinzas hemostáticas curvas para captar una hoja de afeitar, pelos en el tejido fino mientras se quita los vasos sanguíneos obvias o las meninges. NOTA: Los fragmentos de tejido finales deben ser menor que 1 mm (véase la figura 1B). </li><li> Transferir el tejido en un tubo cónico de 50 ml limpio. Lavar la placa de cultivo celular con un adicional de 5 medios de cultivo frío mL y transferir al tubo cónico. Repita este paso de lavado si es necesario para transferir el tejido restante. </li><li> Con una pipeta serológica de 10 ml, se tritura suavemente (4 - 5 veces). Permitir TISS más grandesfragmentos ue a depositan en el fondo del tubo. Si es necesario, se centrifuga brevemente la muestra durante 1 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Recoger la fracción disociada mecánicamente. <ol><li> Eliminar el sobrenadante y filtrar a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml con la etiqueta &quot;Mechanical disociación.&quot; Invertir el filtro sobre el tubo cónico original y lavar con medio de cultivo para recuperar los fragmentos de tejido. </li><li> Se centrifuga la fracción &quot;disociación mecánica&quot; durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Eliminar el sobrenadante de la fracción de granulado &quot;disociación mecánica&quot; y resuspender el tejido en medio de cultivo frío. Si hay más de 5 ml de tejido en el tubo cónico de &quot;disociación mecánica&quot;, dividir el tejido dentro de otros tubos 50 ml cónicos de tal manera que no tubo tiene más de 5 ml de tejido. </li></ol></li><li> Almacenar la fracción disociada mecánicamente en hielo hasta la etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa (Step 5). Como alternativa, la fracción disociada mecánicamente puede proceder al paso 5 durante el período de incubación de disociación enzimática (Paso 4.4). </li></ol> 4. La disociación enzimática <ol><li> Si hay más de 5 ml de tejido en el tubo que contiene el resto de los fragmentos de tejido más grandes, dividir el tejido en otros nuevos tubos 50 ml cónicos de tal manera que no tubo tiene más de 5 ml de tejido. </li><li> Centrifugar el tubo (s) cónica que contiene los fragmentos de tejido restantes durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Eliminar el sobrenadante y añadir la solución de digestión enzimática precalentado, de manera que hay 5 solución de digestión ml por cada 1 ml de tejido (por ejemplo, 25 ml solución de digestión de 5 ml de tejido). </li><li> Sellar las tapas de tubo cónico con película de laboratorio y se incuba la reacción en un aparato rotatorio a 37 ° C durante 30 min. </li><li> Después de la incubación, las muestras se tritura suavemente (véase la Figura 1C). <ol><li> Con una pipeta serológica de 10 ml,pipeta de la muestra de arriba abajo 6 - 8 veces. Evitar la generación de burbujas de aire excesivas. </li><li> Añadir una punta de pipeta 1.000 l hasta el final de la pipeta y se tritura un adicional de 6 - 8 veces. </li><li> Permitir que cualquier trozos restantes a depositan en el fondo del tubo. Retire y filtrado del sobrenadante con las células que hayan quedado suspendidos a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 ml con la etiqueta &quot;La disociación enzimática&quot; y almacenar en hielo. </li><li> Si los fragmentos de tejido quedan importantes, agregar un adicional de 10 ml de HBSS con calcio y magnesio a los fragmentos y repita los pasos 3.5.1 y 3.5.2. Filtrar esta solución final a través de un filtro de 100 micras en el tubo &quot;Enzymatic disociación&quot;. </li></ol></li><li> Centrifugar el tubo &quot;Enzymatic disociación&quot; de 5 min (350 xg, 4 ° C) y continuar a centrifugación en gradiente de sacarosa. </li></ol> 5. La sacarosa gradiente de centrifugación <ol><li> Si las muestras aún se suspenden en solución, centrifuge por 5 min (350 xg, 4 ° C). </li><li> Quitar el tejido sobrenadante y resuspender en 20 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio. Se ajusta el volumen hasta 25 ml en total con HBSS frío. </li><li> Añadir lentamente 25 ml de 1,8 M solución de sacarosa y el tubo para mezclar. Esto da lugar a un gradiente de 0,9 M de sacarosa. </li><li> Centrifugar sin freno para 10 min (800 xg, 4 ° C). El uso de un freno de centrifugación interrumpirá el gradiente y reducir el rendimiento (véase la Figura 1D para un ejemplo de una muestra antes y después de la centrifugación). </li><li> Con cuidado aspirar restos de mielina y tanto solución de sacarosa como sea posible. Lavar la muestra mediante la adición de 30 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio y mezclando suavemente. Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> Lisis Celular ACK 6. Rojo Sangre <ol><li> Eliminar el sobrenadante de lavado. Añadir 5 ml de tampón de lisis ACK y resuspender suavemente el sedimento celular, agitando el tubo durante 1 min a TA. </li><li> Se detiene la lanalysis mediante la adición de 30 ml de HBSS fría sin calcio y magnesio. </li><li> Centrifugar durante 5 min (350 xg, 4 ° C). </li></ol> 7. Mantenimiento de Cultura Inicial <ol><li> Volver a suspender los sedimentos celulares finales en 10 - 15 ml tibia completa de TSM con factores de crecimiento y cuantificar la densidad de células viables en un hemocitómetro usando exclusión de azul de tripano. NOTA: El rango de células viables varía ampliamente dependiendo de las circunstancias de la donación de tejidos, y la cuantificación puede ser difícil en esta etapa temprana debido a los desechos celulares sobrante. En un caso ideal, el objetivo de tener un millón de células vivas por muestra. En los casos en que un exceso de restos sigue siendo, la placa a una densidad más baja en un matraz T175. </li><li> La transferencia de las suspensiones celulares finales a un nuevo matraz de cultivo T75. Spike en factores de crecimiento adicionales cada otro día para mantener los niveles generales de factores de crecimiento, y el monitor para el desarrollo de las neuroesferas de células tumorales (véase la Figura 1E y la Figura 2). </li><li>Por otra parte, los procesos células disociadas enzimáticamente para su posterior análisis, incluyendo citometría de flujo y clasificación de células activadas por fluorescencia. </li><li> Tras el desarrollo de neuroesferas (que en promedio es de 3 - 4 semanas, pero oscila desde unos pocos días a tan largo como 2 meses), revertir filtro de la muestra utilizando un filtro de malla de nylon 100 micras para reducir la cantidad de desechos. NOTA: El filtrado debe mantenerse en cultivo en el caso de células individuales viables o esferas pequeñas están presentes. </li><li> Asegurar la integridad y la pureza de la cultura mediante la realización de la huella de ADN, mientras que pases, en comparación con la muestra inicial del paciente. </li></ol>

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</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo describe un método para el rápido procesamiento de post-mortem donaciones de tejido tumoral para desarrollar cultivos de células derivadas del paciente, que puede ser utilizado en una variedad de in vitro o en experimentos in vivo. Debido a la naturaleza del trabajo con muestras de la autopsia, el mantenimiento de la viabilidad de la muestra plantea un reto significativo. Varios factores contribuyentes, incluyendo el intervalo de post-mortem a autopsia o el tiempo necesario para el transporte de tejido, deben minimizarse tanto como sea posible, pero a menudo son difíciles de controlar. En nuestra experiencia, un intervalo postmortem de menos de 6 - 8 h (desde el momento de la muerte a la vez que el tejido se coloca en el hielo frío y el envío de medios de transporte) ha dado la mejor oportunidad de establecer un cultivo de células duradera. Lo mejor es entonces recibirá el tejido en el laboratorio dentro de las 24 h, y procesarla para el cultivo inmediatamente después de recibirla. Dado que la ubicación de estos casos raros varía ampliamente, yla calidad de la etapa de recogida de tejido afecta en gran medida las posibilidades de éxito, la logística de la realización de la autopsia puede ser un reto. En muchos casos, con el fin de lograr el marco de tiempo de 6-8 horas, no es factible realizar la cosecha tejido en un centro académico. En su lugar, tener un servicio de recuperación del tejido de guardia para recuperar el tejido tumoral en la funeraria bajo un protocolo aprobado por el IRB es a menudo más conveniente para la recuperación del tejido. Obtener el consentimiento informado antes de la muerte se recomienda y facilita la planificación logística. Se recomienda preparar kits de autopsias independientes con instrucciones claras y exhaustivas y materiales estériles para la recogida de tejido (guantes, paños, escalpelos). Además, el establecimiento de puntos claros de comunicación entre el investigador, patólogo, y funeraria es crítica. Por ejemplo, el investigador debe discutir el protocolo con el patólogo antes de la autopsia y poner de relieve los errores comunes. Estos errores incluyen microBIAL la contaminación (en general de enzimas) durante la recuperación de los tejidos, el hecho de enviar a través del envío y el fracaso para enviar la muestra en hielo húmedo suficiente en un recipiente thermoinsulated noche / acelerada. Por último, se recomienda utilizar un servicio de mensajería de puerta a puerta para el envío de la muestra para minimizar el tiempo de transporte. También se debe tener cuidado durante la disociación del tejido para preservar la viabilidad celular. Por ejemplo, el uso de medios de comunicación diseñado para preservar la salud del tejido neural para el transporte (Hibernate-A suplementado con antibiótico / antimicótico) aumentará la posibilidad de generar una cultura exitosa. También es importante mantener la muestra a una temperatura fría durante todo el protocolo por siempre la transferencia de las muestras en hielo. El cobro de ambas fracciones disociación mecánica y enzimática, junto con la minimización de la trituración puede mejorar el éxito de protocolo, ya que ambos pasos son traumática a las células. En nuestra experiencia, mientras que la mayoría de las culturas exitosas crecen fuera de las dos fracciones, Hemos tenido casos en los que sólo una de las dos preparaciones establecido una cultura duradera, lo que podría reflejar la naturaleza delicada de estas muestras. Otro paso traumático en el protocolo es la trituración; una estrategia que puede reducir el grado de trituración necesario es asegurarse de que las muestras se trituraron a fondo en el comienzo de la preparación. Otros ejemplos de los aspectos del protocolo diseñado para mejorar la viabilidad de la muestra incluyen tampones añadiendo (por ejemplo, HEPES) a través del protocolo, que es especialmente crítico durante la disociación enzimática. Una posible modificación de este protocolo para aumentar aún más la viabilidad celular es la extracción de la sangre roja etapa de lisis celular ACK. Sin embargo, en este caso, a menudo es necesario entonces realizar un paso de lisis ACK durante la semana inicial en cultivo para eliminar las células rojas de la sangre. Otro aspecto de este protocolo que se puede modificar es la eliminación de la mielina y los restos celulares utilizando un Densit sacarosay degradado. Específicamente, otras estrategias que han sido reportados para mejorar la viabilidad celular de las células microgliales también son posibles en este paso, tal como un gradiente de densidad Percoll discontinuo 18 o perlas de eliminación de mielina magnéticos. Por último, la duración entre la disociación inicial del tejido y la aparición de neuroesferas varía entre las muestras y puede tomar de una semana a un mes o más. Dado que los cultivos iniciales típicamente contienen un grado significativo de células muertas y restos celulares, puede ser difícil determinar si quedan células viables; la cultura debe mantenerse durante al menos 4 - 8 semanas (Figura 2). Una de las estrategias para el aislamiento de células que crecen de los escombros restantes se presenta aquí (es decir, revertir el filtrado de grupos de células y re-siembra en medio fresco). La decisión sobre si se debe seguir manteniendo una cultura es en última instancia una decisión caso por caso en función de factores que rodean THe autopsia (por ejemplo, un intervalo postmortem prolongado, problemas durante el transporte del tejido), la disociación de tejido (por ejemplo, sangre excesivo o residuos), y cómo la muestra aparece en cultivo. Una vez que se establece una cultura, la identidad debe ser validado por la huella de ADN utilizando el análisis de repetición en tándem corto o un método similar, comparando la cultura a una muestra del tumor original conservado para este fin. Sugerimos validar de forma rutinaria culturas por la huella de ADN para asegurar que no haya ocurrido contaminación por otras culturas, por ejemplo cada 3 - 6 meses. La generación de estos cultivos DIPG derivados del paciente representa un paso importante en el éxito del desarrollo de terapias eficaces. La expansión de los modelos de cultivos DIPG derivados del paciente y de xenoinjertos disponibles será fundamental para la identificación de las estrategias terapéuticas más eficaces y, finalmente, la superación de esta enfermedad devastadora.

DIPG es una neoplasia agresiva del sistema nervioso central que se plantea en la protuberancia ventral, por lo general durante la infancia media 1, 2. A pesar de décadas de los ensayos clínicos, el tratamiento actual se limita a la radioterapia, que proporciona una mejora temporal o estabilización de los síntomas y sólo se extiende la mediana de supervivencia en un promedio de 3 meses. Incluso con la radioterapia, la mediana de supervivencia global es sólo 9 meses con el 90% de los niños que mueren de la enfermedad dentro de los 2 años del diagnóstico inicial. Debido a la naturaleza infiltrante del tumor y de las funciones críticas de tronco cerebral, la resección quirúrgica no es posible. Por otra parte, en los Estados Unidos, la obtención de biopsias quirúrgicas para DIPG ha históricamente no se han realizado 3, como el análisis histopatológico no tiene ningún papel en la orientación de corriente de tratamiento clínico y diagnóstico típicamente se puede hacer por neuroimagen solo. Por lo tanto, la disponibilidad de tejido tumoral fo de estudio está restringido, lo que limita los esfuerzos para llevar a cabo investigaciones sobre moléculas de fármacos candidatos y la biología del tumor subyacente. En particular, las mejoras en las técnicas de neuroimagen y estereotácticas han permitido el desarrollo de biopsias seguras de DIPG en los últimos años 4, que, cuando se combina con los avances en biología molecular, han transformado nuestra comprensión de la enfermedad. En la actualidad, varios ensayos clínicos que utilizan la biopsia inicial y el perfil molecular de DIPG para la personalización de los planes de tratamiento están en curso (NCT01182350, NCT02274987) 5. DIPG y otros gliomas infantiles de grado alto representan enfermedades distintas de sus homólogos adultos con glioblastoma 6, 7, y modelos experimentales de este modo fieles de DIPG son necesarias para entender su fisiopatología única y descubrir estrategias terapéuticas eficaces. En los últimos años, se centró esfuerzos para obtener tumor DIPG tcuestión para la investigación en el momento de la autopsia o, con menor frecuencia, la biopsia han revolucionado nuestra comprensión y capacidad para estudiar DIPG. El trabajo de secuenciación de todo el genoma reveló una mutación recurrente en la histona H3, 3A familia (H3F3A) y el grupo de histona 1, H3b (HIST1H3B), lo que representa el primer ejemplo de enfermedad humana causada por mutaciones en la histona proteínas 8, 9, 10, 11 de codificación . Además, un subconjunto de DIPGs expresa mutaciones en el gen ACVR1, que no han sido previamente reportados en cáncer, pero son idénticas a las mutaciones encontradas en la infancia congénita del desarrollo trastorno fibrodisplasia osificante progresiva 8, 9, 10, 11. A su vez, los primeros cultivos de células DIPG derivados del paciente y Mo xenoinjerto ortotópicodels ahora se han establecido 1, 2, 12, 13, 14, así como los modelos de ratón establecidos a través del xenotrasplante directa de las células tumorales en ratones inmunodeficientes para generar los xenoinjertos de serie 3, 14, 15. Los primeros esfuerzos de cribado de fármacos que utilizan estos modelos derivados del paciente han identificado nuevos agentes prometedores para la traducción clínica 4, 14 y han sentado las bases de al menos un ensayo clínico (NCT02717455). Estos primeros pasos hacia el progreso son sólo el principio, y numerosas muestras de tejidos derivados del paciente y modelos de cultivo será necesario definir los subtipos de la enfermedad y el desarrollo de las estrategias terapéuticas más eficaces. genéticamente motormodelos de ratón de Ered DIPG también facilitarán los estudios dirigidos a la promoción de nuestra comprensión básica de la enfermedad. Los esfuerzos realizados para generar modelos genéticos para DIPG serán ayudados por los estudios de genómica fundamentales discutidos anteriormente, pero en la actualidad un número limitado de opciones están disponibles. Uno de estos modelos, que genera los gliomas del tronco cerebral de alto grado histológicamente similares, utiliza el virus RCAS / TV de un sistema para impulsar la sobreexpresión de PDGF-B y la pérdida Ink4a-ARF en células nestina positiva en la fosa posterior de ratones recién nacidos 5, 16. Otro enfoque consiste en recapitular varias mutaciones importantes DIPG-asociado (histona H3.3 mutación K27M, pérdida de p53 y la activación de PDGFRA) en las células precursoras neurales derivadas de células madre embrionarias humanas, lo cual es suficiente para hacer que estas células oncogénicas 6, 7, 17. La combinación de métodos genéticos y el paciente derived modelos permitirán a los ensayos preclínicos y promover el desarrollo de terapias eficaces. Para hacer frente a los retos para la investigación DIPG explicado anteriormente, el protocolo de la autopsia rápida fue desarrollado para generar cultivos celulares derivados de pacientes para la investigación 8, 9, 10, 11, 12, 14. El protocolo tiene por objeto proteger la viabilidad del tejido y maximizar la probabilidad de generar cultivos resistentes a pesar de los retos asociados con intervalos post-mortem extendidas y el tiempo de transporte. Cuando generado con éxito, estos cultivos DIPG se pueden utilizar en posteriores manipulaciones in vitro y en experimentos de xenoinjerto in vivo, lo que permite la evaluación de potenciales moléculas terapéuticas en las células derivadas del paciente.

<table><tbody><tr><td>Hibernación-A</td><td>Gibco</td><td>A12475-01</td><td></td></tr><tr><td>HBSS con Calcio/Magnesio</td><td>Gibco</td><td>24020-117</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Corning</td><td>21-022-CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH (Colagenasa/Dispasa)</td><td>Roche</td><td>5401054001</td><td></td></tr><tr><td>DNAse I</td><td>Worthington Biochemical</td><td>LS002007</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma</td><td>S0389</td><td></td></tr><tr><td>Antibiótico/Antimicótico</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal-A</td><td>Gibco</td><td>10888-022</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11330-032</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX-I (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento de B27 Menos Vitamina A</td><td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Aminoácidos No Esenciales (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Humano PDGF-AA</td><td>Shenandoah Biotecnología</td><td>100-16</td><td></td></tr><tr><td>Humano PDGF-BB</td><td>Shenandoah Biotecnología</td><td>100-18</td><td></td></tr><tr><td>Humano EGF</td><td>Shenandoah Biotecnología</td><td>100-26</td><td></td></tr><tr><td>Humano FGF</td><td>Shenandoah Biotechnology</td><td>100-146</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de bisturí estériles</td><td>Bard Paker</td><td>372610</td><td></td></tr><tr><td>Hemostáticos curvos</td><td>Fine Science Tools</td><td>13013-14</td><td></td></tr><tr><td>Hojas de afeitar</td><td>VWR</td><td>55411-050</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular de 100 x 20 mm</td><td>Corning</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Pinzas estériles</td><td>TWD Tradewinds</td><td>DF8988-5</td><td></td></tr><tr><td>Paños estériles</td><td>3M</td><td>2037</td><td></td></tr><tr><td>Guantes estériles</td><td>Kimberly Clark</td><td>1182307</td><td></td></tr><tr><td>ACK Tampón de lisis</td><td>Gibco A1049201</td><td></td><td></td></tr><tr><td>filtro de malla de 100 micras</td><td>Fisher</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tubo cónico</td><td>Fisher</td><td>1495949A</td><td></td></tr></tbody></table>

un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (dipg)

A Protocol for Rapid Post-mortem Cell Culture of Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG)

Difusa intrínseca glioma pontino (DIPG) es un tumor del tronco cerebral infantil que tiene un pronóstico universalmente fatal. Debido a la resección quirúrgica no es una estrategia de tratamiento viable y la biopsia no se realiza de forma rutinaria, la disponibilidad de muestras de pacientes para la investigación es limitada. En consecuencia, los esfuerzos para estudiar esta enfermedad han sido desafiados por una escasez de modelos de enfermedades fieles. Para hacer frente a esta necesidad, se describe aquí un protocolo para el rápido procesamiento de las muestras de tejido de la autopsia post mortem con el fin de generar modelos de cultivo de células derivadas del paciente duraderos que se pueden utilizar en ensayos in vitro o in vivo experimentos de xenoinjerto ortotópico en. Estos modelos pueden ser utilizados para la detección de los posibles objetivos farmacológicos y estudiar los procesos fundamentales dentro patobiológicas DIPG. Este protocolo se puede ampliar aún más para analizar y aislar las células tumorales y microambientales usando células activadas por fluorescencia (FACS), que permite el posterior análisis de genes exsión, la expresión de proteínas, o las modificaciones epigenéticas del ADN en la célula o mayor nivel de células individuales. Por último, este protocolo también se puede adaptar para generar cultivos derivados del paciente para otros tumores del sistema nervioso central.

El protocolo descrito se resume como un flujo de trabajo de cinco pasos con imágenes del tejido en varias etapas de procesamiento de la Figura 1. La muestra se obtiene primero a través de una rápida autopsia estéril. Durante disociación mecánica, el tejido se pica mientras se quita los vasos sanguíneos y meninges de la muestra, y se filtró a través de un filtro de malla de nylon 100 micras. El resto de los fragmentos de tejido se disocian enzimáticamente en un horno de calentamiento. A continuación, los residuos se reduce a través de centrifugación en gradiente de sacarosa, el aislamiento de una capa distinta de la mielina de la muestra. Además, ACK lisis reduce visiblemente la cantidad de glóbulos rojos presentes en la muestra. Por último, las células se colocaron en placas en medio libre de suero complementado con factores de crecimiento. Adicional Figura 1 es un ejemplo de tumor en la autopsia. El tumor crece como una infiltración difusa de la una protuberanciad las regiones adyacentes del tallo cerebral. Durante los preparativos de la muestra, pequeños trozos de ~ 1 cm x 1 cm se deben cortar y se colocaron inmediatamente en un medio de envío de frío en hielo. La figura 2 muestra diversos ejemplos de cómo las muestras pueden aparecer a partir de las primeras etapas de cultivo a una cultura durable. Inicialmente plateado y culturas antiguas (A, B) a menudo no parecen contener muchas células supervivientes. Además, grupos de células tempranas (C, D) a menudo no presentan el grado de contraste típicamente asociados con neuroesferas. En particular, la duración de tiempo en cultivo antes de la aparición de grupos de células puede tomar semanas a un par de meses. Sin embargo, el paso inicial de estos grupos de células, combinado con el filtrado inverso de grupos de células, se puede aislar células tumorales sanas que son capaces de formar esferas (F). El filtrado (E) contiene típicamente residuos que hayan quedado; Sin embargo, se recomienda chapado y mantener el filtrado y la vigilancia de<html> el desarrollo de grupos de células. Estas muestras derivadas del paciente entonces se pueden mantener en cultivo durante varios pasajes (G, H). La figura 3 demuestra la capacidad de estas células para ser xenoinjertado en ratones. En cada uno de estos casos, las células fueron transfectadas con DIPG un reportero GFP-luciferasa para monitorear el desarrollo de los tumores a través de la bioluminiscencia (A). Los tumores también pueden ser examinados histológicamente, por ejemplo, para observar el injerto del tumor (B) o la expresión de marcadores específicos (C). Estos modelos in vivo, en combinación con los ensayos in vitro se pueden utilizar para evaluar los efectos de diversos fármacos o manipulaciones de genes (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 14). Les / ftp_upload / 55360 / 55360fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Las muestras de tejido en varias etapas de procesamiento. (A) Obtener la muestra a través de procedimientos de autopsia estériles y envío de noche en hielo húmedo. (B) De izquierda a derecha: (fila 1) tubos que contenían tejido tumoral en los medios de transporte; tejido fresco en un 100 mm x 20 mm placa de cultivo celular; picado inicial del tejido; (Fila 2) los tejidos parcialmente picada; eliminación de meninges y los vasos sanguíneos; tamaño final de las piezas de tejido picado. (C) De izquierda a derecha: (fila 1) el tejido se incubaron en una mesa giratoria en un horno de 37 ° C; (Fila 2) la trituración del tejido a través de una punta de pipeta 1.000 l unido a una pipeta de 10 ml; filtrado de tejido disociado a través de un filtro de malla de nylon 100 micras. (D) De izquierda a derecha: disoció el tejido suspendido en una solución 0,9 M de sacarosa antes de la centrifugación; tejido disociado separado a través de un gradiente de sacarosa después de la centrifugación; una capa visible oescombros f mielina en la parte superior de la gradiente de sacarosa; un sedimento celular final después de ACK de lisis y de lavado. (E) La muestra final se puede colocar en la cultura o utilizar en otros análisis aguas abajo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig2.jpg" /> Figura 2. Imágenes de células de cultivos primarios y principios de paso. (A - B) Los cultivos se vierten inmediatamente después de la disociación (SU-DIPG-XXX, A), o que no han crecido todavía neuroesferas (SU-DIPG-XXIX, B). (C - D) aparición temprana de neuroesferas en cultivos primarios de SU-DIPG-XXVIII (C) y SU-DIPG-XXIX (D). (EF) Primer paso del cultivo primario de D usando un filtro de nylon de 100 micras, con el fifiltrado (E) y el filtrado inverso (F) plateado. (G - H) neuroesferas maduros de la primera paso de SU-DIPG-XXVII (G) y la tercera paso de SU-DIPG-XXV (H) que crecen en cultivo. Barra de escala = 200 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55360/55360fig3.jpg" /> Figura 3. Cultivos celulares derivados de los pacientes pueden injertarse y forman tumores en ratones. Imágenes (A) Bioluminiscencia de cuatro cultivos celulares derivados de pacientes diferentes transfectadas con un reportero GFP-luciferasa. (B) Sección sagital de un xenoinjerto de ratón, que muestra células tumorales injertadas en la protuberancia ratón. Verde: GFP, Rojo: proteína básica de la mielina. Barra de escala = 1 mm. (C) Ejemplo de inmunofluorescenciacencia imagen que muestra células tumorales GFP injertadas en un cerebro de ratón. Azul: DAPI, Verde: GFP, Rojo: IGF2R. Barra de escala = 40 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/55360fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Figura 1. Muestra suplementario Autopsia de un tumor pontino. Inmediata aparición post-mortem de un glioma pontino intrínseco difuso. El tumor aparece como una masa grande, la mielina rico en la superficie ventral de la protuberancia. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55360/SupplementalFigure1.pdf" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para descargar la imagen.</a>

Este protocolo describe un método para el rápido procesamiento de las muestras difusas pontina glioma intrínseco post mortem para la creación de modelos de cultivos celulares derivados de pacientes o la caracterización directa de las células tumorales y microambientales.

Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

Diffuse Intrinsic Pontine Glioma (DIPG) is a childhood brainstem tumor that carries a universally fatal prognosis. Because surgical resection is not a ...

El objetivo general de este protocolo rápido de cultivo celular post mortem es generar cultivos celulares derivados de pacientes de glioma difuso intrínseco del puente duradero para facilitar los experimentos necesarios para comprender y, en última instancia, desarrollar terapias efectivas contra el DIPG. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología fundamental y las estrategias terapéuticas para el glioma difuso intrínseco del puente, como si ciertos fármacos son eficaces en diferentes cultivos derivados de pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio directo de la biología de las células derivadas de pacientes.Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el DIPG, ya que permite probar diferentes estrategias terapéuticas en diversos subtipos genéticos de la enfermedad. Aunque este método puede proporcionar información sobre el DIPG, también puede aplicarse a otras enfermedades, como otros gliomas pediátricos de alto grado, glioblastomas en adultos u otros tumores del sistema nervioso central. En general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, porque es complicado obtener y procesar rápidamente muestras de autopsia de manera eficiente.Antes de la preparación de la muestra, esterilice la cabina de cultivo celular, junto con cuchillas de afeitar, pinzas hemostáticas curvas y otras herramientas no estériles, bajo luz UV durante una hora, y realice todos los siguientes pasos bajo condiciones estériles. A continuación, transfiera el tejido a una placa de cultivo celular de 100 milímetros por 20 milímetros con bordes elevados. Retire el medio residual proveniente del envío y sustitúyalo con 10 a 15 mililitros de medio de cultivo frío.Luego, utilizando hemostatos curvos para sujetar una cuchilla de afeitar, pique finamente el tejido mientras elimina los vasos sanguíneos o las meninges. Los fragmentos finales de tejido deben ser más pequeños que un milímetro. Posteriormente, transfiera el tejido a un tubo cónico limpio de 50 mililitros.Lave el recipiente de cultivo celular con cinco mililitros adicionales de medio de cultivo frío y transfiera la muestra al tubo cónico. Repita este paso de lavado según sea necesario para transferir el tejido restante. Utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, triture suavemente la muestra de cuatro a cinco veces.Deje que los fragmentos de tejido más grandes se sedimenten en el fondo del tubo. Si es necesario, centrifugue brevemente la muestra durante un minuto. Para recoger la fracción disociada, retire el sobrenadante y filtre a través de un filtro de 100 micrones hacia un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como Disociación Mecánica.Invierta el filtro sobre el tubo cónico original y lávelo con medio de cultivo para recuperar los fragmentos de tejido. Posteriormente, centrifugue la fracción de disociación mecánica durante cinco minutos. Luego, elimine el sobrenadante de la fracción de disociación mecánica sedimentada y re-suspenda el tejido en medio de cultivo frío.Si hay más de cinco mililitros de tejido en el tubo cónico para disociación mecánica, divida el tejido en otros tubos cónicos de 50 mililitros de manera que ningún tubo contenga más de cinco mililitros de tejido. Luego, almacene la fracción disociada mecánicamente en hielo hasta el paso de centrifugación en gradiente de sacarosa. En este procedimiento, centrifugue el tubo cónico que contiene los fragmentos de tejido restantes durante cinco minutos.Luego, elimine el sobrenadante y agregue la solución de digestión enzimática precalentada, de manera que haya cinco mililitros de solución de digestión por cada mililitro de tejido. A continuación, selle la tapa del tubo cónico con película de laboratorio e incube la reacción en un rotador a 37 grados Celsius durante 30 minutos. Después de la incubación, triture suavemente las muestras.Utilizando una pipeta serológica de 10 mililitros, aspire y expulse la muestra de seis a ocho veces, evitando generar burbujas de aire excesivas. A continuación, coloque una punta de pipeta de 1.000 microlitros en el extremo de la pipeta y realice una trituración adicional de seis a ocho ciclos. Deje que los restos de grumos se sedimenten en el fondo del tubo.Luego, retire y filtre el sobrenadante con las células aún en suspensión a través de un filtro de 100 micrones hacia un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como Disociación Enzimática y almacénelo en hielo. A continuación, centrifugue el tubo de disociación enzimática durante cinco minutos y continúe con la centrifugación en gradiente de sacarosa. Si la muestra aún está en suspensión en la solución, centrifúguela durante cinco minutos.A continuación, elimine el sobrenadante y re-suspenda el tejido en 20 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Luego, afora hasta 25 mililitros con HBSS frío. Añada lentamente 25 mililitros de solución de sacarosa 1,8 M e invierta el tubo para mezclar.Esto da como resultado un gradiente de sacarosa 0,9 molar. Posteriormente, centrifugue la muestra sin interrupción durante 10 minutos. Aspire cuidadosamente los restos de mielina con la mayor cantidad posible de solución de sacarosa.Luego, lave la muestra añadiendo 30 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio, y mezclando suavemente. A continuación, centrifúguela durante cinco minutos. En este procedimiento, elimine el sobrenadante de lavado.Añada cinco mililitros de tampón de lisis ACK y re-suspenda suavemente el botón celular, agitando el tubo durante un minuto a temperatura ambiente. Luego, detenga la lisis añadiendo 30 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Posteriormente, centrifugue durante cinco minutos.Re-suspendir el pellet final de células en 10 a 15 mililitros de TSM completo tibio con factores de crecimiento, y cuantificar la densidad de células viables en un hemocitómetro, utilizando la exclusión con azul de tripano. Posteriormente, transferir la suspensión celular final a un nuevo matraz de cultivo T75. Agregar factores de crecimiento adicionales cada dos días para mantener los niveles totales de factores de crecimiento, y monitorear el desarrollo de neuroesferas de células tumorales.A continuación se muestran varios ejemplos de cómo pueden verse las muestras desde las primeras etapas del cultivo hasta un cultivo duradero. Inicialmente, las placas y los cultivos tempranos a menudo no parecen contener muchas células viables. Además, los grupos celulares tempranos a menudo no presentan el grado de contraste típicamente asociado con neuroesferas.Sin embargo, el primer pase de estos cúmulos celulares, combinado con la filtración inversa de los cúmulos celulares, puede aislar células tumorales sanas capaces de formar esferas. El filtrado generalmente contiene restos de desechos. Estas muestras derivadas de pacientes pueden luego mantenerse en cultivo durante varios pases.Una vez dominada, esta técnica puede realizarse en tres a cuatro horas si se lleva a cabo correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la muestra se mantenga a temperatura fría en todos los pasos, excepto durante la disociación enzimática, y minimizar el manejo traumático de la muestra. Tras seguir este procedimiento, se pueden realizar estudios adicionales, como cribado in vitro de fármacos o xenoinjertos ortotópicos, para responder preguntas posteriores sobre la patobiología del DIPG.Tras su desarrollo, esta técnica de cultivo ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neuro-oncología pediátrica exploren nuevas vías terapéuticas para niños con DIPG. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar protocolos de cultivo celular post mortem rápidos en muestras de tumores cerebrales. No olvide que trabajar con tejido humano puede ser peligroso, y siempre se deben tomar precauciones, como el uso de equipo de protección personal y técnica estéril.

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Investigación

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Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

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