Un protocolo para la rápida post-mortem de cultivos celulares de glioma pontino intrínsecos difusos (DIPG)

El objetivo general de este protocolo de cultivo rápido de células post-mortem es generar cultivos celulares duraderos derivados de pacientes de glioma pontino intrínseco difuso para facilitar los experimentos necesarios para comprender y, en última instancia, desarrollar terapias efectivas para el GPID. Este método puede ayudar a responder preguntas clave sobre la biología fundamental y las estrategias terapéuticas para el glioma pontino intrínseco difuso, como si ciertos medicamentos funcionan en diferentes culturas derivadas de pacientes. La principal ventaja de esta técnica es que permite el estudio directo de la biología de las células derivadas de los pacientes.

Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia la terapia para el GPID, ya que permite probar diferentes estrategias terapéuticas en diferentes subtipos genéticos de la enfermedad. Aunque este método puede proporcionar información sobre el GPID, también se puede aplicar a otras enfermedades, como otros gliomas pediátricos de alto grado, glioblastomas en adultos u otros tumores del sistema nervioso central. Por lo general, las personas nuevas en esta técnica tendrán dificultades, ya que es difícil obtener y procesar rápidamente las muestras de autopsia de manera eficiente.

Antes de la preparación de la muestra, esterilice la campana de cultivo de tejidos, junto con las hojas de afeitar, los hemostáticos curvos y otras herramientas no estériles bajo la luz ultravioleta durante una hora, y realice todos los pasos siguientes en condiciones estériles. A continuación, transfiera el tejido a una placa de cultivo celular de paredes altas de 100 milímetros por 20 milímetros. Retire los medios sobrantes del envío y reemplácelos con 10 a 15 mililitros de medios de cultivo en frío.

Luego, usando los hemostáticos curvos para agarrar una hoja de afeitar, pica finamente el tejido mientras retiras los vasos sanguíneos o las meninges. Los fragmentos finales de tejido deben tener un tamaño inferior a un milímetro. Después, transfiera el tejido a un tubo cónico limpio de 50 mililitros.

Lave la placa de cultivo celular con cinco mililitros adicionales de medio de cultivo en frío y transfiera la muestra al tubo cónico. Repita este paso de lavado según sea necesario para transferir el tejido restante. Con una pipeta serológica de 10 mililitros, triture la muestra suavemente durante cuatro o cinco veces.

Permita que los fragmentos de tejido más grandes se depositen en el fondo del tubo. Si es necesario, centrifugar brevemente la muestra durante un minuto. Para recoger la fracción disociada, retire el sobrenadante y filtre a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como Disociación Mecánica.

Invierta el filtro sobre el tubo cónico original y lávelo con medios de cultivo para recuperar los fragmentos de tejido. Posteriormente, centrifugar la fracción de disociación mecánica durante cinco minutos. A continuación, retire el sobrenadante de la fracción de disociación mecánica peletizada y vuelva a suspender el tejido en medios de cultivo fríos.

Si hay más de cinco mililitros de tejido en el tubo cónico de disociación mecánica, divida el tejido en otros tubos cónicos de 50 mililitros de modo que ningún tubo tenga más de cinco mililitros de tejido. A continuación, almacene la fracción disociada mecánicamente en hielo hasta la etapa de centrifugación en gradiente de sacarosa. En este procedimiento, centrifuga el tubo cónico que contiene los fragmentos de tejido restantes durante cinco minutos.

Después de eso, retire el sobrenadante y agregue la solución de digestión enzimática precalentada, de modo que haya cinco mililitros de solución de digestión por cada mililitro de tejido. A continuación, selle la tapa del tubo cónico con una película de laboratorio e incube la reacción en un rotador a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de la incubación, triture las muestras suavemente.

Con una pipeta serológica de 10 mililitros, pipetee la muestra hacia arriba y hacia abajo de seis a ocho veces, y evite generar burbujas de aire excesivas. A continuación, añada una punta de pipeta de 1.000 microlitros al extremo de la pipeta y triture la muestra entre seis y ocho veces más. Deje que los trozos restantes se asienten en el fondo del tubo.

Luego, retire y filtre el sobrenadante con las células aún suspendidas a través de un filtro de 100 micras en un nuevo tubo cónico de 50 mililitros etiquetado como Disociación Enzimática y guárdelo en hielo. Después de eso, centrifugue el tubo de disociación enzimática durante cinco minutos y continúe con la centrifugación en gradiente de sacarosa. Si la muestra aún está suspendida en solución, centrifugue durante cinco minutos.

A continuación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el tejido en 20 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Luego, sube el volumen a 25 mililitros con HBSS frío. Agregue lentamente 25 mililitros de solución de sacarosa 1.8 molar e invierta el tubo para mezclar.

Esto da como resultado un gradiente de sacarosa de 0,9 molares. A continuación, centrifugar la muestra sin descanso durante 10 minutos. Aspire cuidadosamente los restos de mielina en la mayor cantidad posible de solución de sacarosa.

A continuación, lavar la muestra añadiendo 30 mililitros de HBSS frío sin calcio y magnesio, y mezclar suavemente. Después de eso, centrifugalo durante cinco minutos. En este procedimiento, retire el sobrenadante de lavado.

Agregue cinco mililitros de tampón de lisis ACK y vuelva a suspender suavemente el pellet de celda, girando el tubo durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, apague la lisis añadiendo 30 mililitros de HBSS frío sin calcio ni magnesio. Posteriormente, centrifugarlo durante cinco minutos.

Vuelva a suspender el pellet de celda final en 10 a 15 mililitros de TSM completo tibio con factores de crecimiento y cuantifique la densidad celular viable en un hemocitómetro, utilizando la exclusión de azul de tripán. A continuación, transfiera la suspensión celular final a un nuevo matraz de cultivo T75. Agregue factores de crecimiento adicionales cada dos días para mantener los niveles generales del factor de crecimiento y controle el desarrollo de las neuroesferas de las células tumorales.

Aquí hay varios ejemplos de cómo las muestras pueden aparecer desde las primeras etapas de cultivo hasta un cultivo duradero. Inicialmente, los cultivos en placa y los primeros a menudo no parecen contener muchas células sobrevivientes. Además, los primeros grupos de células a menudo no exhiben el grado de contraste típicamente asociado con las neuroesferas.

Sin embargo, el paso inicial de estos grupos de células, combinado con el filtrado inverso de los grupos de células, puede aislar las células tumorales sanas que pueden formar esferas. Por lo general, el filtrado contiene restos de residuos. Estas muestras derivadas del paciente se pueden mantener en cultivo durante múltiples pasajes.

Una vez dominada, esta técnica se puede realizar en tres o cuatro horas si se realiza correctamente. Al intentar este procedimiento, es importante asegurarse de que la muestra se mantenga a temperatura fría en cada paso, excepto en la disociación enzimática, y minimizar la manipulación traumática de la muestra. Después de este procedimiento, se pueden realizar estudios adicionales, como el cribado in vitro de fármacos o el xenoinjerto ortotópico, para responder a preguntas posteriores sobre la patobiología del DIPG.

Tras su desarrollo, esta técnica de cultivo ha allanado el camino para que los investigadores en el campo de la neurooncología pediátrica exploren nuevas vías terapéuticas para los niños con GPID. Después de ver este video, debería tener una buena idea de cómo realizar protocolos rápidos de cultivo de células post-mortem en muestras de tumores cerebrales. No olvide que trabajar con tejido humano puede ser peligroso, y siempre se deben utilizar precauciones, como el uso de equipo de protección personal y técnicas estériles.