Name: Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-01T11:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 4 s
Description: Aprende a correlacionar la diferenciación celular y las fuerzas de tracción mediante microarrays de alto rendimiento. Esta plataforma permite estudiar biología de células madre y optimizar protocolos de diferenciación en ingeniería de tejidos.

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Reconocemos Austin Cyphersmith y Mayandi Sivaguru (Carl Woese Instituto de Biología Genómica R., Universidad de Illinois en Urbana-Champaign) para obtener ayuda con la microscopía y para la pantalla y captura de vídeo con capacidad generosamente en el centro de microscopía.

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

En nuestros experimentos, hemos encontrado que los fallos más comunes están relacionados con la calidad de las matrices fabricadas y pobremente caracterizados respuesta en el sistema biológico de interés. Remitimos al lector a la Tabla 1 para los modos de fallo comunes en los experimentos de microarrays de células y pasos para solucionar problemas asociados. En cuanto a la calidad de las matrices, en particular, se recomienda lo siguiente. Confirmar la calidad técnica y la solidez de poner en orden los programas, parámetros y tampones que usan moléculas marcadas con fluorescencia, tales como dextrano conjugado con rodamina. pasadores limpiar a fondo, ya sea antes o después de poner en orden según las instrucciones del fabricante, y aún más visualmente comprobar que los canales de espiga son libres de desechos utilizando un microscopio de luz. Confirmar la retención biomolécula puso en orden el uso de manchas de proteínas generales o inmunomarcaje. Tenga en cuenta que las biomoléculas con un peso molecular inferior a 70 kDa con frecuencia no se retienen en el hidrogel 23, </<html> sup&gt; 31. Validar puso en orden el biomolécula célula funcionalidad mediante múltiples tipos de células. Tenga en cuenta que sólo las células adherentes son compatibles con las matrices; Además, la adherencia a las matrices depende tanto de las propiedades de células específicas (por ejemplo, perfil de expresión de integrina) y las proteínas de la MEC seleccionados. Debido al espacio limitado, no hemos proporcionado un extenso tratamiento de la gama de diseño, el diseño y la fabricación aquí y remitir al lector a trabajos previos 23, 25. Generalmente usamos 100 subarreglos punto (150 micras de diámetro punto, 450 m de centro a centro de distancia) compuestas de 10-20 condiciones de biomoléculas únicos (es decir, 5-10 puntos / condición). El número de subconjuntos en una matriz varía en función del número de condiciones de biomoléculas de interés, que se puede escalar cómodamente hasta 1280 en un 25 × 75 mm portaobjetos de microscopio (~ 6.400 puntos en 64 submatrices)xref &quot;&gt; 25, 31 de los parámetros anteriores variarán más dependiendo del tamaño del patrón de interés;. pines capaces de generar patrones de 75 a 450 micras están fácilmente disponibles. serie de experimentos se complementan con mejor validación de alta puntuación condiciones dispuestas de interés utilizando otros formatos de cultivo, las lecturas de ensayo, y sistemas de modelos biológicos. Específicamente, sugerimos validar aún más los efectos de las condiciones dispuestas seleccione utilizando cultivos en masa en conjunción con técnicas de biología molecular estándar (por ejemplo, QRT-PCR, inmunotransferencia) o estándar de TFM. La manipulación genética (por ejemplo, desmontables o sobreexpresión) del factor de interés en un sistema modelo biológico adecuado también puede servir para confirmar los efectos observados en las matrices. En modelos animales in vivo representan otro medio de validación y se utilizaron recientemente, por ejemplo, para confirmar el papel central de la galectina-3 y la galectina-8 enel cáncer de pulmón metastásico nicho, como se identificó inicialmente a través de microarrays de células 31, 49. Un número de otros métodos se han utilizado para investigar la regulación microambientales de funciones celulares, incluyendo una variedad de dos dimensiones sistemas microfabricados 18, 50, 51, 52, 53, 54, 55 y tridimensionales sistemas de biomateriales de ingeniería 56, 57, 58 , 59, 60, 61. En comparación con otros métodos, las ventajas particulares de la plataforma de microarrays de células descritas aquí consisten en: (1) un rendimiento de hastacientos o miles de diferentes combinaciones de factores, lo que permite el análisis de los efectos de interacción; (2), de formación de imágenes automatizado accesible y análisis; (3) la integración de las dos lecturas bioquímicas y biofísicas con la presentación controlada de factores desplegadas; (4) capacidad de variar las propiedades del material de sustrato; y (5) de alto contenido de análisis de una sola célula de destino celular y la función. En resumen, la combinación de microarrays de células con TFM sobre sustratos de rigidez sustrato sintonizable permite la caracterización exhaustiva de las dos señales bioquímicas y biofísicas. Tal como se presenta aquí, esta plataforma es generalizable y se puede aplicar fácilmente a una variedad de tipos de células adherentes y contextos de tejido hacia una mejor comprensión de la regulación microambientales combinatoria de la diferenciación celular y mechanotransduction.

Las interacciones entre las células y factores microambientales rodean mediar una gran variedad de procesos biológicos en todo el desarrollo, la homeostasis, y la patogénesis 1, 2, 3, 4 enfermedad. Estas interacciones microambientales incluyen la entrega de factores solubles a las células, la unión célula-matriz, y las interacciones célula-célula a través de la unión del ligando-receptor. Además de las consideraciones bioquímicas anteriores, los parámetros biofísicos, como las propiedades mecánicas de sustrato (por ejemplo, el módulo de Young, la porosidad) y forma de la célula, y mechanotransduction aguas abajo asociados han ganado cada vez más reconocimiento como mediadores clave de la diferenciación de células 5, 6, 7, 8, 9 <sup&gt; 10. Las señales resultantes de estas interacciones microambientales sirven como entradas a las redes de genes y vías de señalización. Por otra parte, estos componentes de células intrínseca también proporcionan retroalimentación al microambiente a través de factores secretados y enzimas que degradan la matriz, que completaron un complejo bucle co-regulación entre los programas genéticos de células intrínseca y factores microambientales de células extrínseca 5, 11, 12. El uso de sistemas de ingeniería para la presentación controlada de factores microambientales ha demostrado ser útil en una variedad de diferentes contextos 13, 14, 15. Sistemas microfabricados en particular, han facilitado patrón espacial precisa de las proteínas y células, así como análisis altamente paralelizado a través de la miniaturización 13, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22. Microarrays de células representan un sistema de este microfabricado en el que las combinaciones de biomoléculas son el contacto-impreso sobre un sustrato de poliacrilamida elástico de hidrogel 23, 24, 25. La inclusión de componentes de células de adhesivo (es decir, proteínas de la matriz) permite la adhesión sostenida cultivo de células y en microarrays, que es seguido a menudo por el análisis de aguas abajo a través de inmunocitoquímica y reporteros fluorescentes. Células microarrays han sido productiva dirigida hacia el logro de una mejor comprensión del fenotipo de células hepáticas 23, 26, neural diferenciación precursora 27, Mammardecisiones y destino progenitora 28, embrionaria de células madre de mantenimiento / diferenciación 23, 29, 30, 31 metástasis del cáncer de pulmón, y la respuesta terapéutica en el melanoma 32. Recientemente hemos demostrado el uso de células microarrays para definir el papel de la matriz extracelular (ECM) composición de proteínas en la especificación endodermo 33, el hígado progenitora diferenciación 34, 35, y la respuesta a los fármacos de células tumorales de pulmón 36. En estas obras, nos hemos centrado en la ampliación de las capacidades combinatorias de la gama plataforma y explorar las intersecciones de señalización de las células intrínseca con la composición de la matriz extracelular y la biomecánica. Además, hemos puesto en marcha lecturas biofísicos en esta gama plataforma para proporcionar cuantitativamente la capacidad de caracrizar el papel de la contractilidad celular en la diferenciación de los procesos 35. Para ello, hemos integrado la microscopía de fuerza de tracción (TFM) con microarrays de células para permitir la evaluación de alto rendimiento de la tracción generada por células. TFM es un método ampliamente utilizado para medir las fuerzas de tracción generada por células y se ha proporcionado información significativa con respecto a la coordinación de una sola célula y la función a nivel de tejido con la composición y la biomecánica del microambiente local de 37, 38, 39, 40. Por lo tanto, la combinación de TFM con microarrays de células proporciona un sistema de alto rendimiento para la medición de parámetros biofísicos clave, fisiológicamente relevantes. La plataforma de microarrays de células descrito aquí consiste en cuatro secciones: la fabricación de sustratos de poliacrilamida, fabricación de matrices, cultivo de células y lectura del ensayo y análisis de los datos. VerFigura 1 para un resumen esquemático de las tres primeras secciones experimentales; véase la Figura 2 para un resumen esquemático de la sección final con un enfoque en el análisis de los datos de inmunofluorescencia. Con el fin de adaptar la plataforma de microarrays de células para estudios de las interacciones célula-sustrato biomecánicos, hemos utilizado sustratos de poliacrilamida de módulo de Young sintonizable pero porosidad similares, por Wen et al. 41. Para habilitar las mediciones de TFM fuerzas ejercidas por las células en su sustrato, se implementó un formato de placa de Petri con fondo de vidrio, además del microscopio de vidrio grueso portaobjetos de frecuencia utilizada por otros grupos. Por lo tanto, esta plataforma de microarrays célula es capaz de mediciones paralelas de diferenciación celular a través de inmunofluorescencia en portaobjetos de microscopio y las fuerzas generadas por células a través de TFM en los platos con fondo de vidrio separados. También hemos aplicado varias mejoras en el enfoque analítico empleado normalmente en los microarrays de células. ESPECÍFICOSLy, en lugar de Z-paramétrica de puntuación de la intensidad global isla, que mide la intensidad de una sola célula y aplicar cuantil normalización con el fin de dar cuenta de las distribuciones no normales y con mayor precisión describir el comportamiento celular. Creemos que estas mejoras proporcionan una utilidad particular hacia la investigación de procesos biológicos en los que las señales bioquímicas y biofísicas tanto juegan papeles importantes, que se cruzan. Además, nuestras mejoras analíticos permiten la aplicación de microarrays de células para estudios de una serie de funciones celulares para los que una sola célula y el comportamiento a nivel de población divergen.

<table><tbody><tr><td>0,2 y micro; m filtro de jeringa</td><td>Pall Corporation</td><td>4433</td><td>Combine con jeringas de plástico Luer lock del tamaño adecuado.</td></tr><tr><td>100 y veces; penicilina &ndash; solución de estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>SV30010</td><td></td></tr><tr><td>22 &times; 60 mm cubreobjetos</td><td>Electrónica Microscopy Sciences</td><td>63765</td><td></td></tr><tr><td>3-(trimetoxisilil)procrilato (3-TPM)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>440159</td><td>Almacene bajo gas inerte según las instrucciones del fabricante. La exposición del 3-TPM al aire podría comprometer la silanización de los sustratos de vidrio. PRECAUCIÓN: El 3-TPM es un líquido combustible. Manténgalo alejado del calor, las chispas, las llamas abiertas y las superficies calientes y úselo solo en una campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>3-[(3-Colamidopropil)dimetilaminmonio]-1-hidrato de sulfonato de propano(CHAPS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3023</td><td></td></tr><tr><td>Placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm</td><td>Cell E& G</td><td>GBD00002-200</td><td>Pocillo de 13 mm compuesto por cubreobjetos #1.5. Permite la obtención de imágenes TFM y de células vivas.</td></tr><tr><td>Microplaca de polipropileno con fondo en V de 384 pocillos, no estéril</td><td>USA Scientific</td><td>1823-8400</td><td></td></tr><tr><td>Microplacas de poliestireno de 6 pocillos</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-1B</td> Las <td>placas de Petri con fondo de vidrio de 35 mm encajan en los pocillos de la microplaca, lo que facilita la fabricación de matrices.</td></tr><tr><td>Acetona</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179973</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3553</td><td>PRECAUCIÓN: La exposición a la acrilamida puede provocar toxicidad aguda e irritación. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Colágeno I, cola de rata</td><td>EMD Millipore</td><td>08-115MI</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno III, EMD humano</td><td>Millipore</td><td>CC054</td><td></td></tr><tr><td>Colágeno IV, EMD humano</td><td>Millipore</td><td>CC076</td><td></td></tr><tr><td>Reticulante, 365 nm</td><td>UVP</td><td>CL-1000</td><td></td></tr><tr><td>Dextrano, rodamina conjugada B, 70</td><td>kDa ThermoFisher Scientific</td><td>D1841</td><td>Se utiliza como marcador para la ubicación de la matriz.</td></tr><tr><td>Sulfóxido de dimetilo</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco (PBS)</td><td>Fisher Scientific (HyClone)</td><td>SH3001302</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico</td><td>Decon Labs</td><td>2701</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>ED</td><td></td></tr><tr><td>Fc-DLL1 recombinante, ratón</td><td>R& D Systems</td><td>5026-DL-050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinante DLL4, ratón</td><td>AdipoGen</td><td>AG-40A-0145-C050</td><td></td></tr><tr><td>Fc-recombinante JAG1, rata</td><td>R& D Systems</td><td>599-JG-100</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina, humano</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F2006</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio fluorescente, invertido</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 200M</td><td>El microscopio Ensure está equipado con una platina robótica para imágenes fluorescentes automatizadas y TFM. Control ambiental (i.e., 37 &deg; C y 5% de CO2) es muy recomendable para el TFM.</td></tr><tr><td>Fluoromount G con DAPI</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Ácido acético glacial</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>695092</td><td>PRECAUCIÓN: El ácido acético es inflamable y corrosivo. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>Irgacure 2959</td><td>BASF Corporation</td><td>55047962</td><td></td></tr><tr><td>Laminina, ratón</td><td>EMD Millipore</td><td>CC095</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>179957</td><td></td></tr><tr><td>Escáner de microarrays</td><td>GenePix</td><td>4000B</td><td>Los fluoróforos deben ser compatibles con Cy3 o Cy5.</td></tr><tr><td>Microarrayer</td><td>Digilab</td><td>OmniGrid Micro Otros</td><td>microarrayers de capacidad similar o mayor pueden ser fácilmente sustituidos.</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio, 25 &times; 75 mm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS294775X25</td><td>~0,9 &ndash; 1,1 mm de espesor.</td></tr><tr><td>N,N&prime; -Metilenebisacrilamida (bisacrilamida)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7279</td><td>PRECAUCIÓN: La exposición a la acrilamida puede provocar toxicidad aguda e irritación. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA), 16% v/v</td><td>Ciencias de la Microscopía Electrónica RT15710</td><td></td><td>Prepare PFA fresco (no lo almacene) para una fijación óptima. PRECAUCIÓN: La exposición a PFA puede resultar en toxicidad aguda y también puede irritar o corroer la piel al contacto. Use guantes, ropa y protección para los ojos protectores y úselo solo en una campana de gases químicos.</td></tr><tr><td>Proteína A/G, recombinante</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr><tr><td>Bandeja de secado Pyrex, 2.000&nbsp; mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-242B</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cultivo rectangular de 4 cámaras</td><td>Fisher Scientific (Nunc)</td><td>12-565-495</td><td>Para cultivo celular en portaobjetos de microscopio dispuestos.</td></tr><tr><td>Acetato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>Hidróxido de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>415413</td><td>PRECAUCIÓN: El NaOH es altamente cáustico y puede causar quemaduras graves en la piel y daños oculares. Use guantes, ropa y protección para los ojos.</td></tr><tr><td>Pin sigiloso para la colocación</td> de los pines <td>de ArrayIt</td><td>SMP3</td><td>Limpie los pines después de cada ejecución de la matriz siguiendo las instrucciones del fabricante. Produce dominios de 150 micras; Compre otros tamaños de alfileres (75&ndash; 450 micras) según se adapte a su aplicación particular.</td></tr><tr><td>Tritón X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

A High-throughput Cell Microarray Platform for Correlative Analysis of Cell Differentiation and Traction Forces

microarrays celulares microfabricados, que consisten en combinaciones de contactos impresos de biomoléculas sobre una superficie elástica hidrogel, proporcionan un alto rendimiento sistema de ingeniería estrechamente controlado para medir el impacto de las señales bioquímicas dispuestas sobre la diferenciación celular. Los esfuerzos recientes utilizando microarrays de células han demostrado su utilidad para estudios combinatorios en los que muchos factores microambientales se presentan en paralelo. Sin embargo, estos esfuerzos se han centrado principalmente en la investigación de los efectos de las señales bioquímicas en las respuestas de células. A continuación, presentamos una plataforma de microarrays de células con propiedades materiales sintonizables para evaluar tanto la diferenciación celular mediante inmunofluorescencia y célula-sustrato interacciones biomecánico mediante microscopía de fuerza de tracción. Para ello, hemos desarrollado dos formatos diferentes que utilizan hidrogeles de poliacrilamida de diferentes módulo de Young fabricado en cualquiera de portaobjetos de microscopio o platos de Petri con fondo de cristal. Proporcionamos best prácticas y reparación para la fabricación de microarrays de estos sustratos de hidrogel, el posterior cultivo de células en microarrays, y la adquisición de datos. Esta plataforma está bien adaptado para su uso en investigaciones de procesos biológicos para los que tanto bioquímica (por ejemplo, composición de la matriz extracelular) y biofísico (por ejemplo, sustrato de rigidez) señales pueden jugar significativa, la intersección de roles.

El uso de esta plataforma, se investigó el papel de ambas señales bioquímicas y biofísicas en la especificación de destino de células progenitoras del hígado 34, 35. Ligandos / Notch G conjugada con proteína A mostraron una mejor retención y la agrupación en el hidrogel de poliacrilamida (Figura 3A) y además están capaz de impulsar la diferenciación de las células progenitoras del hígado hacia un destino celular de las vías biliares (Figura 3B). Utilizando el análisis de una sola célula, que cuantifica la respuesta a los ligandos de Notch para las proteínas ECM colágeno I, colágeno III, colágeno IV, fibronectina y laminina (Figura 3C), encontrando que la respuesta de las células progenitoras del hígado al ligando depende también de la contexto ECM. Por último, hemos utilizado shRNA desmontables para generar células progenitoras del hígado sin los ligandos Dll1 y Jag1. La respuesta al ligando de Notch dispuestos variaba dependiendo del presencia de cualquiera de ligando, lo que confirma que la capacidad de respuesta al ligando de células extrínseca es también una función de la expresión de ligando de células intrínseca (Figura 3D). Además, se observó una subpoblación distinta de doble positivo (+ ALB / OPN +) células en la caída Dll1 (Figura 3D). En conjunto, estos resultados muestran representativas: (1) las capacidades combinatorias del formato de matriz, como se ejemplifica por el emparejamiento de múltiples dispuestos proteínas ECM y ligandos Notch con la caída de los ligandos individuales; (2) la funcionalidad de no sólo vistió proteínas ECM, sino también vistió ligando célula-célula a través de Proteína A conjugación / mediada por G; y (3) la aplicación de nuestro análisis de una sola célula y su capacidad de discernir las subpoblaciones únicas. También se observó que la diferenciación de células progenitoras del hígado depende tanto de la rigidez del sustrato y la composición de la MEC (Figura 4A </str<html> ong&gt;), encontrar específicamente que el colágeno IV es de apoyo de la diferenciación en ambos sustratos blandos y rígidos, mientras que la fibronectina sólo es compatible con la diferenciación en sustratos rígidos (Figura 4B). Mapas de calor representativas de las mediciones TFM sugieren que el estrés sostenido de tracción a baja rigidez sustrato sobre el colágeno IV promovió la diferenciación en células de los conductos biliares (Figura 4C), un hallazgo confirmado por los valores promedio de la raíz cuadrada media (Figura 4D). En conjunto, estos resultados muestran representativas: (1) la integración exitosa de TFM con microarrays de células en sustratos con una rigidez sintonizable para evaluar tanto el fenotipo celular y el esfuerzo de tracción; (2) la coordinación del destino de las células progenitoras hepáticas tanto con la composición de la matriz y la rigidez del sustrato; y (3) la aplicación de nuestros análisis y típicos perfiles de esfuerzo de tracción TFM en células microarrays. e 1 &quot;src =&quot; / files / ftp_upload / 55362 / 55362fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1: Descripción esquemática que muestra los primeros tres secciones experimentales. En la Sección 1, sustratos de vidrio se limpian y silanizada para facilitar la fabricación de hidrogeles de poliacrilamida. En la Sección 2, las combinaciones de biomoléculas de interés se preparan en una microplaca de fuente de 384 pocillos. Un arrayer robótico se carga entonces con alfileres limpias, la microplaca fuente, y los hidrogeles de poliacrilamida y se inicializa, la fabricación de matrices en los hidrogeles. En la sección 3, las células se siembran en los dominios dispuestos y permite que se adhieran, después de lo cual se realiza el protocolo de cultivo de interés. En el punto final, las células se fijan ya sea para inmunocitoquímica / inmunofluorescencia o analizados mediante TFM. Las barras de escala son 75 micras. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> dentro-page = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig2.jpg" /> Figura 2: Procesamiento y Análisis de inmunofluorescencia de datos de matrices. (A) de baldosa, compuestas imágenes RGB de 32 bits se han agrupado primero y luego divide en canales individuales de 8 bits. Usando una combinación de marcadores fluorescentes dispuestos e islas de células, se identifican tres esquinas de la matriz para permitir la orientación automatizado y cuadriculación de las matrices. (B) los datos de celda única se genera para cada canal de las matrices de entrada. Con el fin de dar cuenta de la deriva experimental, cuantil normalización se aplica mediante biológica replicar, produciendo una única distribución compartida a través de todas las repeticiones. Cuantil normalizado de datos se representa posteriormente y se interpreta a través de cálculo de las mediciones del conjunto (por ejemplo, células / isla, intensidad media, porcentaje de células positivas para una etiqueta) o el análisis directo de la distribución de una sola célula.m / archivos / ftp_upload / 55362 / 55362fig2large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura. <img alt="figura 3" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig3.jpg" /> Figura 3: Presentación Notch ligando media la diferenciación hepática Progenitor. (A) ligandos de Notch-Fc recombinante Jagged-1 (JAG1) y Delta tipo 1 (DLL 1) exhibió una mejor retención y la agrupación cuando se vistió con proteína A / G. La barra de escala es de 50 micras. Progenitores (B) del hígado diferenciarse en células del conducto biliar mediante la presentación con el ligando de Notch. 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es una etiqueta nuclear, albúmina (ALB) es un marcador de células hepáticas, y osteopontina (OPN) es un marcador de células del conducto biliar. La barra de escala es de 150 micras. (C) Cuantificación de porcentaje de células positivas para OPN para los ligandos de Notch JAG1, DLL1, y Delta-como 4 (Dll4) en las proteínas ECM colágeno I, collagen III, colágeno IV, fibronectina y laminina. T de Student pruebas se llevaron a cabo contra IgG de control para cada ligando Notch dispuestos dentro de cada proteína de ECM con P-valores indicados para p &lt;0,05 (*). (D) Imagen citometría de ALB y OPN para las células de colágeno III presentados con los ligandos Notch JAG1, Dll1, y Dll4. Células progenitoras del hígado sin la Notch ligandos Dll1 y Jag1 (es decir, shDll1 y shJag1) se generaron utilizando shRNA desmontables. Los datos en (C) presentan como media ± SEM Esta cifra ha sido modificado a partir de Kaylan et al. 34. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/55362/55362fig4.jpg" /> Figura 4: composición de la matriz y el sustrato Rigidez Coordinate hígado Progenitor diferenciación. (A) la diferenciación de progenitores de hígado a las células del conducto biliar depende tanto de composición de la MEC y la rigidez del sustrato. DAPI es una etiqueta nuclear, ALB es un marcador de células hepáticas, y de OPN es un marcador de células del conducto biliar. (B) Cuantificación de porcentaje de células positivas para OPN sobre sustratos de módulo de Young 30 kPa, 13 kPa, y 4 kPa para el colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), y todos de dos vías combinaciones de aquellas proteínas de ECM. (C) la tensión de tracción de la célula depende tanto de la rigidez del sustrato y la composición ECM. (D) La cuantificación de los valores de la raíz cuadrada de la media de la tensión de tracción sobre sustratos de módulo de Young de 30 kPa y 4 kPa para el colágeno I (C1), colágeno IV (C4), fibronectina (FN), y todas las combinaciones binarias de aquellos proteínas ECM. En (B) y (D), los datos se presentan como media ± SEM y t de Student-pruebasse llevaron a cabo contra 30 kPa para cada combinación de ECM con P-valores indicados para p &lt;0,05 (*), P &lt;0,01 (**), y P &lt;0,001 (***). Las barras de escala son 50 micras. Esta cifra ha sido modificado a partir de Kourouklis et al. 35. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55362/55362fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td fo:width="1.2in"> Sección </td><td fo:width="1.5in"> Problema </td><td fo:width="1.5in"> Causas potenciales </td><td> Solución </td></tr><tr><td rowspan="3"> 1. La fabricación de poliacrilamida sustrato. </td><td> Cubreobjetos no se puede quitar de hidrogel. </td><td> Overpolymerization. </td><td> Reducir el tiempo de polimerización a &lt;10 minutos (4 W / m 2). Compruebe que crossli UVnker de salida está dentro del rango esperado. </td></tr><tr><td> polimerización hidrogel de poliacrilamida pobres. </td><td> Underpolymerization. </td><td> Aumentar el tiempo de polimerización para&gt; 10 minutos (4 W / m 2). Compruebe que la salida de agente de reticulación UV está dentro del rango esperado. </td></tr><tr><td> hidrogeles de poliacrilamida se dañan después de la eliminación de cubreobjetos. </td><td> hidrogeles de poliacrilamida suaves son fáciles de dañar. </td><td> Observamos la disminución de rendimiento de hidrogel de fabricación (~ 50%) para la más suave (es decir, 4 kPa) hidrogeles en particular. Manejar hidrogeles suavemente y aumentar los números de partida para alcanzar el rendimiento deseado. </td></tr><tr><td rowspan="2"> 2. La fabricación de matrices. </td><td rowspan="2"> la morfología del terreno pobre o inconsistente. </td><td> función de humectación inconsistente. </td><td> Compruebe que humidificador y un reómetro funcional a través de cada tirada y mantener un 65% de humedad relativa. </td></tr><tr><td> Alfileres clavados en el cabezal de impresión o estorboGED. </td><td> Limpiar el cabezal de impresión para permitir el movimiento libre de pasador. Limpiar bien los pasadores antes o después de cada tirada para eliminar los agregados de canales de espiga. </td></tr><tr><td rowspan="8"> 3. Cultivo de células y Ejecución del ensayo. </td><td rowspan="2"> desprendimiento o muerte celular en matrices después de la colocación inicial. </td><td> Resiembra y la proliferación excesiva. </td><td> Reducir la densidad de siembra inicial y el tiempo. Utilice el &quot;mantenimiento&quot; o los medios de comunicación &quot;diferenciación&quot; durante el cultivo conjunto para reducir la proliferación celular. </td></tr><tr><td> La liberación de monómero de acrilamida tóxica de hidrogel. </td><td> Remojar hidrogeles en dH 2 O durante al menos 3 d para permitir la difusión / liberación de monómero de acrilamida y reducir la toxicidad celular. </td></tr><tr><td rowspan="4"> Las células no se adhieren a las matrices. </td><td> Underseeding. </td><td> Aumentar la densidad de siembra inicial y el tiempo. Use un tipo de célula más fuertemente adherente. </td></tr><tr><td> Poor deposición dematriz o condición biomolécula. </td><td> Pasadores limpias de partículas y agregados, confirman los parámetros de impresión, y evaluar la localización de los marcadores fluorescentes, por ejemplo, dextrano conjugado con rodamina. </td></tr><tr><td> La especificidad de las interacciones célula-matriz. </td><td> Diferentes tipos de células se adhieren específicamente a algunos pero no a otras proteínas ECM. Prueba de múltiples proteínas de la ECM con sus células. </td></tr><tr><td> almacenamiento de matrices subóptima después de la fabricación. </td><td> Recomendamos almacenar matrices fabricadas durante la noche a 65% de humedad relativa y temperatura ambiente, en parte para evitar cambios de fase durante la congelación. La adhesión celular es sensible tanto a la humedad, la temperatura y tiempo de almacenamiento; asegurarse de que estos parámetros son consistentes / optimizado para sus experimentos. </td></tr><tr><td rowspan="2"> Desprendimiento de hidrogel de sustrato de vidrio durante el cultivo celular. </td><td> limpieza de diapositivas pobres y silanización. </td><td> Reemplazar las soluciones de trabajo para la limpieza de diapositivas ysilanización. </td></tr><tr><td> Overdehydrated hidrogel. </td><td> No deje hidrogeles de deshidratación en un plato caliente durante más de 15-30 minutos. </td></tr><tr><td> 4. Análisis de Datos. </td><td> Alta variabilidad entre los puntos en paralelo y diapositivas. </td><td> La variabilidad en la matriz de fabricación. </td><td> Compruebe que los terminales y los cabezales de impresión están limpias. Confirmar la función humidificador. Visualizar y cuantificar lugar y la matriz calidad utilizando marcadores fluorescentes. matrices de las tiendas a las recomendaciones anteriores. </td></tr></tbody></table> Tabla 1: Solución de problemas.

La diferenciación celular está regulada por una serie de factores microambientales, incluyendo tanto la composición de la matriz y de material de sustrato propiedades. Se describe aquí una técnica utilizando microarrays de células en combinación con microscopía de fuerza de tracción para evaluar tanto la diferenciación celular y las interacciones célula-sustrato biomecánicas como una función del contexto microambientales.

Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

Microfabricated cellular microarrays, which consist of contact-printed combinations of biomolecules on an elastic hydrogel surface, provide a tightly ...

El objetivo general de esta plataforma de microarreglos celulares es correlacionar mediciones tanto de la diferenciación celular como de las fuerzas de tracción en función del contexto microambiental. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, permitiendo tanto investigaciones fundamentales de la biología de células madre como la optimización de protocolos de diferenciación. Las principales ventajas de esta técnica incluyen su capacidad de procesamiento, la posibilidad de variar señales bioquímicas y biofísicas, y lecturas finales mediante inmunofluorescencia y microscopía de fuerzas de tracción, o TFM.Aunque se han utilizado estos métodos, quienes comprenden la diferenciación de progenitores hepáticos pueden aplicarlos fácilmente a otros tipos celulares arteriales y contextos tisulares. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el éxito experimental depende de la integración del protocolo de distribución con sustratos de hidrogel de alta calidad y la microscopía de fuerzas de tracción. Para fabricar hidogeles de poliacrilamida que contienen microesferas fluorescentes sobre una placa de Petri de fondo de vidrio silanizado de 35 mm para la evaluación en tiempo real de las interacciones célula-sustrato mediante TFM, primero prepare los sustratos de vidrio en soluciones según se describe en el protocolo escrito.Coloque las placas de vidrio de fondo de 35 mm silanizadas en una bandeja de secado de vidrio y pipetee 20 microlitros de la solución de iniciador fotoquímico de perlas prepolimerizadas en proporción 9 a 1 en el centro de cada placa. Cubra suavemente cada placa con una cubreobjetos circular de 12 mm, evitando la formación de burbujas. Con el fin de distribuir las perlas fluorescentes hacia la superficie del hidrogel, invierta las placas y déjelas a temperatura ambiente durante 20 minutos.Con el plato aún invertido, exponerlo a UVA de 365 nanómetros durante 10 minutos. Optimizar el tiempo de polimerización según sea necesario. A continuación, sumergir los hidrogeles en tampón HEPES 1 M y dejarlos a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche.Retire cuidadosamente las laminillas con una cuchilla, teniendo cuidado de no dañar los hidrogeles polimerizados. Deshidrate los hidrogeles a 50 grados Celsius sobre una placa calefactora hasta que estén secos. Los hidrogeles pueden almacenarse a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres meses.Prepare los tampones para imprimir las biomoléculas y para la placa de origen según se describe en el protocolo escrito. Después de cargar los pinzas limpios según se describe en el protocolo escrito, prepare el microdispensador y prográmelo utilizando el software del fabricante. A continuación, encienda la unidad humidificadora.Ajuste el punto de consigna a 65 % de humedad relativa y espere hasta que el reómetro alcance el punto de consigna. Coloque la placa fuente en el adaptador adecuado. A continuación, coloque los sustratos de hidrogel deshidratados en el adaptador correspondiente.Ajuste los parámetros del programa para reflejar con precisión la disposición de la placa de origen, el diseño de la matriz y el formato deseado. Inicie la fabricación de la matriz. Verifique con una frecuencia de al menos una vez por hora que la humedad no haya descendido por debajo del 65 % de humedad relativa y que los punzones no estén obstruidos.Si la humedad ha disminuido inesperadamente, detenga la impresión para llenar el humidificador y limpiar los tubos asociados de la condensación. Si los pinzas están obstruidos, detenga la impresión para limpiar las pinzas o reemplazarlas con pinzas previamente limpias. Una vez que el programa haya finalizado, coloque los arreglos fabricados en una caja para portaobjetos o en una placa micro bien cubierta con papel de aluminio.Deje las matrices a temperatura ambiente y 65 % de humedad relativa durante la noche. Según nuestra experiencia, las dificultades más comunes están relacionadas con la fabricación de las matrices. Recomendamos confirmar la calidad técnica y robustez de las matrices fabricadas utilizando moléculas marcadas con fluorescencia, tinciones generales de proteínas e inmunofluorescencias.Al día siguiente de la fabricación, sumerja la matriz en placas de Petri de 35 mm en 3 mL de penicilina-estreptomicina al 1% en volumen por volumen en PVS. Exponga los sustratos dispuestos a UVC durante 30 minutos. Luego, sustituya la solución de penicilina-estreptomicina por medio de cultivo celular.Después de recolectar y contar las células, siembre las células en matrices a razón de 3 mL por placa de Petri de 35 mm. Incube las culturas en matrices a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante dos a 24 horas, o hasta la formación de islotes celulares bien poblados. La densidad de siembra y el tiempo pueden ajustarse según el tipo celular y la aplicación específica.Después de permitir la formación de islas celulares, lave los cultivos del arreglo dos veces con 3 mL de medio de cultivo celular precalentado. En este momento, se pueden añadir los controles y tratamientos adecuados de interés al sistema biológico. Cambie el medio de los arreglos cada uno o dos días para mantener la concentración de cualquier tratamiento.De uno a cinco días después de iniciar los cultivos en matriz, realice una evaluación en vivo de las interacciones entre las células y el sustrato utilizando TFM. Transfiera las placas de Petri de 35 mm que contienen los cultivos en matriz a un microscopio invertido fluorescente con incubadora y una platina robótica para las mediciones de TFM. En una placa, marque las posiciones y los planos de enfoque de las islas individuales de células utilizando microscopía de contraste de fase.Cambie a microscopía fluorescente de luz roja lejana para visualizar las perlas. Luego regrese a cada una de las posiciones guardadas en el paso anterior y corrija la coordenada z del plano de enfoque, de modo que solo la primera capa de perlas debajo de la isla celular esté enfocada. Guarde las nuevas coordenadas y continúe con la adquisición automatizada de imágenes de todas las islas celulares para capturar las imágenes de contraste de fases y fluorescentes en rojo lejano previas a la disociación.A continuación, agregue cuidadosamente 150 microlitros de la solución de BSA/SDS al recipiente y espere cinco minutos para permitir la disociación completa de las células del sustrato. Monitoree la disociación celular utilizando microscopía de contraste de fase. Una vez que las islas celulares se hayan disociado del sustrato, regrese a las posiciones marcadas y verifique que la primera capa de microesferas siga estando en foco.Si estas perlas están fuera del plano debido a la deformación inducida por la tracción generada por la célula, corrija la coordenada z del plano enfocado para que vuelvan a estar enfocadas. Guarde las coordenadas z corregidas y repita la adquisición de imágenes automatizada de todas las islas para capturar las imágenes fluorescentes post-disociación en rojo lejano. Repita estos pasos para los platos restantes.Los ligandos de la notcha conjugados con proteína A/G, jagged uno y delta como uno, mostraron una retención mejorada en los hidrogeles. La presentación de los ligandos de la notcha también indujo la diferenciación de los progenitores hepáticos hacia un destino de célula de conducto biliar, como lo indica la presencia del marcador verde de células de conducto biliar. La respuesta a los ligandos de la notcha se cuantificó para cinco proteínas de matriz extracelular, o ECM, y mostró que la respuesta de los progenitores hepáticos a los ligandos depende del contexto de la ECM.Se utilizó el silenciamiento mediante ARN de horquilla pequeña para generar progenitores sin los ligandos delta como uno y jagged uno. Luego, se expusieron las células a los ligandos de notch jagged uno, delta como uno y delta como cuatro. La respuesta al ligando de notch dispuesto en matriz varió según la expresión intrínseca en la célula de cualquiera de los ligandos.Estas imágenes muestran la diferenciación de progenitores hepáticos dependiendo tanto de la rigidez del sustrato como de la composición de la matriz extracelular (ECM). El análisis cuantitativo reveló que el colágeno IV favorece la diferenciación tanto en sustratos blandos como rígidos, mientras que la fibronectina solo favorece la diferenciación en sustratos rígidos. Los mapas térmicos representativos sugieren que el estrés de tracción sostenido a baja rigidez del sustrato sobre colágeno IV promueve la diferenciación en células de conducto biliar.Este hallazgo fue confirmado mediante la cuantificación de los valores promedio de la raíz cuadrada media del estrés de tracción. Este video y el protocolo adjunto han proporcionado los pasos principales para fabricar hidrogeles y matrices destinadas a realizar cultivos celulares sobre sustratos en matriz y para medir las interacciones célula-sustrato utilizando microscopía de fuerza de tracción. Después de familiarizarse con las técnicas, cada experimento puede completarse en tan solo una a dos semanas si se realiza adecuadamente.En contraste con este método, se deben utilizar cultivos celulares para validar las condiciones del arreglo con puntuación alta mediante PCR cualitativa, inmunotransferencia, ejes de mecanobiología a escala estándar u otras técnicas complementarias de biología molecular. Esta plataforma versátil puede aplicarse a la investigación de alto rendimiento de funciones celulares en un amplio número de contextos celulares y tisulares, incluyendo la diferenciación de células madre y la biología de células cancerosas.

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