Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

El objetivo general de esta plataforma de microarreglos celulares es correlacionar mediciones tanto de la diferenciación celular como de las fuerzas de tracción en función del contexto microambiental. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, permitiendo tanto investigaciones fundamentales de la biología de células madre como la optimización de protocolos de diferenciación. Las principales ventajas de esta técnica incluyen su capacidad de procesamiento, la posibilidad de variar señales bioquímicas y biofísicas, y lecturas finales mediante inmunofluorescencia y microscopía de fuerzas de tracción, o TFM.

Aunque se han utilizado estos métodos, quienes comprenden la diferenciación de progenitores hepáticos pueden aplicarlos fácilmente a otros tipos celulares arteriales y contextos tisulares. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el éxito experimental depende de la integración del protocolo de distribución con sustratos de hidrogel de alta calidad y la microscopía de fuerzas de tracción. Para fabricar hidogeles de poliacrilamida que contienen microesferas fluorescentes sobre una placa de Petri de fondo de vidrio silanizado de 35 mm para la evaluación en tiempo real de las interacciones célula-sustrato mediante TFM, primero prepare los sustratos de vidrio en soluciones según se describe en el protocolo escrito.

Coloque las placas de vidrio de fondo de 35 mm silanizadas en una bandeja de secado de vidrio y pipetee 20 microlitros de la solución de iniciador fotoquímico de perlas prepolimerizadas en proporción 9 a 1 en el centro de cada placa. Cubra suavemente cada placa con una cubreobjetos circular de 12 mm, evitando la formación de burbujas. Con el fin de distribuir las perlas fluorescentes hacia la superficie del hidrogel, invierta las placas y déjelas a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Con el plato aún invertido, exponerlo a UVA de 365 nanómetros durante 10 minutos. Optimizar el tiempo de polimerización según sea necesario. A continuación, sumergir los hidrogeles en tampón HEPES 1 M y dejarlos a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche.

Retire cuidadosamente las laminillas con una cuchilla, teniendo cuidado de no dañar los hidrogeles polimerizados. Deshidrate los hidrogeles a 50 grados Celsius sobre una placa calefactora hasta que estén secos. Los hidrogeles pueden almacenarse a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres meses.

Prepare los tampones para imprimir las biomoléculas y para la placa de origen según se describe en el protocolo escrito. Después de cargar los pinzas limpios según se describe en el protocolo escrito, prepare el microdispensador y prográmelo utilizando el software del fabricante. A continuación, encienda la unidad humidificadora.

Ajuste el punto de consigna a 65 % de humedad relativa y espere hasta que el reómetro alcance el punto de consigna. Coloque la placa fuente en el adaptador adecuado. A continuación, coloque los sustratos de hidrogel deshidratados en el adaptador correspondiente.

Ajuste los parámetros del programa para reflejar con precisión la disposición de la placa de origen, el diseño de la matriz y el formato deseado. Inicie la fabricación de la matriz. Verifique con una frecuencia de al menos una vez por hora que la humedad no haya descendido por debajo del 65 % de humedad relativa y que los punzones no estén obstruidos.

Si la humedad ha disminuido inesperadamente, detenga la impresión para llenar el humidificador y limpiar los tubos asociados de la condensación. Si los pinzas están obstruidos, detenga la impresión para limpiar las pinzas o reemplazarlas con pinzas previamente limpias. Una vez que el programa haya finalizado, coloque los arreglos fabricados en una caja para portaobjetos o en una placa micro bien cubierta con papel de aluminio.

Deje las matrices a temperatura ambiente y 65 % de humedad relativa durante la noche. Según nuestra experiencia, las dificultades más comunes están relacionadas con la fabricación de las matrices. Recomendamos confirmar la calidad técnica y robustez de las matrices fabricadas utilizando moléculas marcadas con fluorescencia, tinciones generales de proteínas e inmunofluorescencias.

Al día siguiente de la fabricación, sumerja la matriz en placas de Petri de 35 mm en 3 mL de penicilina-estreptomicina al 1% en volumen por volumen en PVS. Exponga los sustratos dispuestos a UVC durante 30 minutos. Luego, sustituya la solución de penicilina-estreptomicina por medio de cultivo celular.

Después de recolectar y contar las células, siembre las células en matrices a razón de 3 mL por placa de Petri de 35 mm. Incube las culturas en matrices a 37 grados Celsius y 5%CO2 durante dos a 24 horas, o hasta la formación de islotes celulares bien poblados. La densidad de siembra y el tiempo pueden ajustarse según el tipo celular y la aplicación específica.

Después de permitir la formación de islas celulares, lave los cultivos del arreglo dos veces con 3 mL de medio de cultivo celular precalentado. En este momento, se pueden añadir los controles y tratamientos adecuados de interés al sistema biológico. Cambie el medio de los arreglos cada uno o dos días para mantener la concentración de cualquier tratamiento.

De uno a cinco días después de iniciar los cultivos en matriz, realice una evaluación en vivo de las interacciones entre las células y el sustrato utilizando TFM. Transfiera las placas de Petri de 35 mm que contienen los cultivos en matriz a un microscopio invertido fluorescente con incubadora y una platina robótica para las mediciones de TFM. En una placa, marque las posiciones y los planos de enfoque de las islas individuales de células utilizando microscopía de contraste de fase.

Cambie a microscopía fluorescente de luz roja lejana para visualizar las perlas. Luego regrese a cada una de las posiciones guardadas en el paso anterior y corrija la coordenada z del plano de enfoque, de modo que solo la primera capa de perlas debajo de la isla celular esté enfocada. Guarde las nuevas coordenadas y continúe con la adquisición automatizada de imágenes de todas las islas celulares para capturar las imágenes de contraste de fases y fluorescentes en rojo lejano previas a la disociación.

A continuación, agregue cuidadosamente 150 microlitros de la solución de BSA/SDS al recipiente y espere cinco minutos para permitir la disociación completa de las células del sustrato. Monitoree la disociación celular utilizando microscopía de contraste de fase. Una vez que las islas celulares se hayan disociado del sustrato, regrese a las posiciones marcadas y verifique que la primera capa de microesferas siga estando en foco.

Si estas perlas están fuera del plano debido a la deformación inducida por la tracción generada por la célula, corrija la coordenada z del plano enfocado para que vuelvan a estar enfocadas. Guarde las coordenadas z corregidas y repita la adquisición de imágenes automatizada de todas las islas para capturar las imágenes fluorescentes post-disociación en rojo lejano. Repita estos pasos para los platos restantes.

Los ligandos de la notcha conjugados con proteína A/G, jagged uno y delta como uno, mostraron una retención mejorada en los hidrogeles. La presentación de los ligandos de la notcha también indujo la diferenciación de los progenitores hepáticos hacia un destino de célula de conducto biliar, como lo indica la presencia del marcador verde de células de conducto biliar. La respuesta a los ligandos de la notcha se cuantificó para cinco proteínas de matriz extracelular, o ECM, y mostró que la respuesta de los progenitores hepáticos a los ligandos depende del contexto de la ECM.

Se utilizó el silenciamiento mediante ARN de horquilla pequeña para generar progenitores sin los ligandos delta como uno y jagged uno. Luego, se expusieron las células a los ligandos de notch jagged uno, delta como uno y delta como cuatro. La respuesta al ligando de notch dispuesto en matriz varió según la expresión intrínseca en la célula de cualquiera de los ligandos.

Estas imágenes muestran la diferenciación de progenitores hepáticos dependiendo tanto de la rigidez del sustrato como de la composición de la matriz extracelular (ECM). El análisis cuantitativo reveló que el colágeno IV favorece la diferenciación tanto en sustratos blandos como rígidos, mientras que la fibronectina solo favorece la diferenciación en sustratos rígidos. Los mapas térmicos representativos sugieren que el estrés de tracción sostenido a baja rigidez del sustrato sobre colágeno IV promueve la diferenciación en células de conducto biliar.

Este hallazgo fue confirmado mediante la cuantificación de los valores promedio de la raíz cuadrada media del estrés de tracción. Este video y el protocolo adjunto han proporcionado los pasos principales para fabricar hidrogeles y matrices destinadas a realizar cultivos celulares sobre sustratos en matriz y para medir las interacciones célula-sustrato utilizando microscopía de fuerza de tracción. Después de familiarizarse con las técnicas, cada experimento puede completarse en tan solo una a dos semanas si se realiza adecuadamente.

En contraste con este método, se deben utilizar cultivos celulares para validar las condiciones del arreglo con puntuación alta mediante PCR cualitativa, inmunotransferencia, ejes de mecanobiología a escala estándar u otras técnicas complementarias de biología molecular. Esta plataforma versátil puede aplicarse a la investigación de alto rendimiento de funciones celulares en un amplio número de contextos celulares y tisulares, incluyendo la diferenciación de células madre y la biología de células cancerosas.