Una de alto rendimiento plataforma de microarrays de células para análisis correlativo de la diferenciación celular y las fuerzas de tracción

El objetivo general de esta plataforma de microarrays celulares es correlacionar las mediciones de las fuerzas de diferenciación celular y tracción en función del contexto microambiental. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la ingeniería de tejidos, permitiendo tanto investigaciones fundamentales de la biología de las células madre como optimización de los protocolos de diferenciación. Las principales ventajas de esta técnica incluyen su rendimiento, la capacidad de variar las señales bioquímicas y biofísicas, y las lecturas de los puntos finales tanto por microscopía inmunofluorescente como por microscopía de fuerza de tracción, o TFM.

Aunque se han utilizado estos métodos, aquellos que comprenden la diferenciación de los progenitores hepáticos se pueden aplicar fácilmente a otros tipos de células arteriales y contextos tisulares. La demostración visual de este método es fundamental, ya que el éxito experimental depende de la integración del protocolo de matrices con sustratos de hidrogel de alta calidad y microscopía de fuerza de tracción. Para fabricar perlas fluorescentes que contienen hidrogeles de poliacrilamida en una placa de Petri con fondo de vidrio silanizado de 35 mm para la evaluación en vivo de las interacciones del sustrato celular utilizando TFM, primero, prepare sustratos de vidrio en soluciones como se describe en el protocolo de texto.

Coloque placas de Petri con fondo de vidrio silanizado de 35 mm en una bandeja de secado de vidrio y pipetee 20 microlitros de perla de prepolímero 9 a 1 para la solución fotoiniciadora en el centro de cada plato. Cubra suavemente cada plato con un cubreobjetos circular de 12 mm evitando la creación de burbujas. Para distribuir las perlas fluorescentes a la superficie del hidrogel, invierta los platos y déjelos a temperatura ambiente durante 20 minutos.

Mientras aún está invertido, exponga el plato a 365 nanómetros de UVA durante 10 minutos. Optimice el tiempo de polimerización según sea necesario. A continuación, sumerja los hidrogeles en un tampón HEPES de 1 molar y déjelos a temperatura ambiente en la oscuridad durante la noche.

Retire los cubreobjetos con cuidado con una navaja, teniendo cuidado de no dañar los hidrogeles polimerizados. Deshidratar los hidrogeles a 50 grados centígrados en una placa caliente hasta que se sequen. Los hidrogeles se pueden almacenar a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres meses.

Prepare tampones para imprimir las biomoléculas y para la placa fuente como se describe en el protocolo de texto. Después de cargar los pines limpios como se describe en el protocolo de texto, prepare el microarrayer y prográmelo utilizando el software del fabricante. A continuación, encienda la unidad humidificadora.

Ajuste el punto de ajuste al 65% de humedad relativa y espere hasta que el reómetro coincida con el punto de ajuste. Coloque la placa fuente en el adaptador adecuado. A continuación, coloque los sustratos de hidrogel deshidratado en el adaptador adecuado.

Ajuste los parámetros del programa para reflejar con precisión el diseño de la placa fuente, el diseño de la matriz y el formato deseado. Inicie la fabricación de la matriz. Compruebe con no menos de una vez por hora que la humedad no haya bajado del 65% de humedad relativa y que los alfileres no estén obstruidos.

Si la humedad ha disminuido inesperadamente, haga una pausa en la matriz para llenar el humidificador y limpiar los tubos de condensación asociados. Si las clavijas están obstruidas, detenga la matriz para limpiarlas o, de lo contrario, reemplácelas con clavijas previamente limpias. Una vez que se complete el programa, coloque las matrices fabricadas en una caja deslizante o microplaca cubierta con papel de aluminio.

Deje las matrices a temperatura ambiente a 65% de humedad relativa durante la noche. En nuestra experiencia, las dificultades más comunes están relacionadas con la fabricación de matrices. Recomendamos confirmar la calidad técnica y la robustez de las matrices fabricadas utilizando moléculas marcadas fluorescentemente, tinciones de proteínas generales e inmunofluorescentes.

Al día siguiente de la fabricación, sumerja la matriz de placas de Petri de 35 mm en 3 ml de 1% de volumen por volumen de penicilina-estreptomicina en PVS. Exponga los sustratos dispuestos en UVC durante 30 minutos. A continuación, cambie la solución de penicilina-estreptomicina por medios de cultivo celular.

Después de recolectar y contar las células, siembre las células en matrices a 3 mL por placa de Petri de 35 mm. Incubar los cultivos a 37 grados Celsius y 5% de CO2 durante dos a 24 horas, o hasta la formación de islas celulares bien pobladas. La densidad y el tiempo de siembra se pueden ajustar según las células y la aplicación particular.

Después de permitir la formación de islas celulares, lave los cultivos de matriz dos veces con 3 mL de medio de cultivo celular precalentado. En este punto, se pueden añadir al sistema biológico los controles adecuados y los tratamientos de interés. Cambie los medios de las matrices cada uno o dos días para mantener la concentración de cualquier tratamiento.

Dentro de uno a cinco días después de iniciar los cultivos de matrices, realice una evaluación en vivo de las interacciones del sustrato celular utilizando TFM. Traslade las placas de Petri de 35 mm que contienen cultivos de matriz a un microscopio fluorescente invertido incubado con una platina robótica para mediciones TFM. En una placa, marque las posiciones y los planos de enfoque de las islas de células individuales utilizando microscopía de contraste de fase.

Cambie a la microscopía fluorescente de rojo lejano para visualizar las perlas. A continuación, vuelva a cada una de las posiciones guardadas en el paso anterior y corrija la coordenada z del plano de enfoque, de modo que sólo la primera capa de cuentas por debajo de la isla de celdas esté enfocada. Guarde las nuevas coordenadas y proceda a la obtención automática de imágenes de todas las islas de células para capturar el contraste de la fase de predisociación y las imágenes fluorescentes rojas lejanas.

A continuación, agregue con cuidado 150 microlitros de solución BSA/SDS al plato y espere cinco minutos para permitir la disociación celular completa del sustrato. Monitorice la disociación celular mediante microscopía de contraste de fase. Una vez que las islas de celdas se hayan disociado del sustrato, regrese a las posiciones marcadas y verifique que la primera capa de cuentas aún esté enfocada.

Si estas cuentas están fuera de plano debido a la deformación inducida por la tracción generada por la célula, corrija la coordenada z del plano enfocado para que vuelvan a estar enfocadas. Guarde las coordenadas z corregidas y repita las imágenes automatizadas de todas las islas para capturar las imágenes fluorescentes rojas lejanas posteriores a la disociación. Repita estos pasos para los platos restantes.

Los ligandos notch conjugados con proteína A/G dentados uno y delta como uno mostraron una mejor retención en los hidrogeles. La presentación del ligando notch también impulsó la diferenciación de los progenitores hepáticos hacia el destino de las células del conducto biliar, como lo indica la presencia del marcador de células del conducto biliar verde. La respuesta a los ligandos notch se cuantificó para cinco proteínas de la matriz extracelular, o MEC, y mostró que la respuesta de los progenitores hepáticos a los ligandos depende del contexto de la MEC.

Se utilizó una pequeña reducción de ARN de horquilla para generar progenitores sin los ligandos delta como uno y dentado. A continuación, se presentaron células con los ligandos notch dentados uno y delta como uno y delta como cuatro. La respuesta al ligando notch en matriz varió dependiendo de la expresión intrínseca celular de cualquiera de los ligandos.

Estas imágenes muestran la diferenciación de los progenitores hepáticos en función de la rigidez del sustrato y de la composición de la MEC. El análisis cuantitativo reveló que el colágeno cuatro favorece la diferenciación tanto en sustratos blandos como rígidos, mientras que la fibronectina sólo favorece la diferenciación en sustratos rígidos. Los mapas de calor representativos sugieren que el estrés de tracción sostenido a baja rigidez del sustrato en el colágeno cuatro promueve la diferenciación en células del conducto biliar.

Este hallazgo se confirmó mediante la cuantificación de los valores cuadráticos medios medios de la tensión de tracción. Este vídeo y el protocolo que lo acompaña han proporcionado los pasos principales para la fabricación de hidrogeles y matrices para realizar el cultivo celular en los sustratos matricados y para medir las interacciones entre los sustratos celulares mediante microscopía de fuerza de tracción. Después de familiarizarse con las técnicas, cada experimento se puede completar en tan solo una o dos semanas si se realiza correctamente.

En contracción con este método, los cultivos celulares deben utilizarse para validar las condiciones de la matriz de alta puntuación utilizando PCR cualitativa, inmunotransferencia, ejes de mecanobiología a escala estándar u otras técnicas complementarias de biología molecular. Esta plataforma versátil se puede aplicar a la investigación de alto rendimiento de las funciones celulares en un amplio número de contextos celulares y tisulares, incluida la diferenciación de células madre y la biología de células cancerosas.