Name: Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-01-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a caracterizar células madre adultas de ingeniería mediante cribado de alto contenido en placas de 96 pocillos. Este método permite analizar proliferación y migración celular en tiempo real para aplicaciones terapéuticas neuroprotectoras.

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La financiación para esta investigación fue proporcionada por el Comando de Investigación Médica y Material del Ejército de EE. UU. (Cuenta de subvención no. W81XWH-11-1-0700) y el Fondo de Investigación de Células Madre. PAB y EMP fueron beneficiarios de las Pasantías de Laboratorio de Pregrado de Verano (SULI) de Ames Laboratory.

1. Preparación del soporte para placas de 96 pocillos <ol><li> Crear un mapa de la placa de 96 pocillos delineando los diferentes sustratos y tipos de células para ser examinado (Figura 1). </li><li> Obtener las soluciones madre de diferentes sustratos [poli-L-lisina, fibronectina, colágeno tipo I, laminina y colágeno IV-entactina-laminina (ECL)], una placa de 96 pocillos de pocillos múltiples y preparo una estación de trabajo en un cultivo celular estéril capucha. </li><li> Preparar sustratos individuales por dilución de valores en salina tamponada con fosfato estéril (PBS) a una concentración final de 5 mg / ml (esta concentración se determinó previamente sobre la base de un ensayo dependiente de la concentración de sustrato para el crecimiento y la proliferación de las células). Mezclar utilizando un vórtice antes de verter en un depósito estéril. </li><li> Añadir 100 l de solución de sustrato en cada pocillo de acuerdo con el mapa de 96 pocillos (Figura 1) (una micropipeta de 12 o de 8 canales es conveniente para micropipeteado en una placa de 96 pocillos). Sellar la tapa a la placa de 96 pocillos usando una tira de Parafilm y almacenar durante la noche a 4 ° C. </li></ol> 2. célula de recubrimiento y Time-lapse de imágenes NOTA: Mouse MSCs fueron aisladas de la médula ósea de adultos C57BL / 6 ratones y se mantiene como una línea de células adherentes. MSCs se infectaron usando vectores lentivirales para diseñar ellos para secretar-cerebro factor neurotrófico derivado (BDNF; cDNA humano) y derivado de células gliales factor neurotrófico (GDNF; ADNc humano) usando la codificación BDNF (LV-BDNF de vector lentiviral; CMV-BDNF-IRES GFP), GDNF (LV-GDNF; CMV-GDNF-IRES-GFP), y la proteína verde fluorescente (GFP, LV-GFP; CMV-GFP). NOTA: Los medios de cultivo para las células madre mesenquimales de ratón (MSC) es medio de Dulbecco modificado de Iscove que contiene 10% de suero de hibridoma cualificado fetal bovino, 10% de suero equino, 2 mM L-glutamina, y 10.000 U / ml de penicilina, 10 mg / ml de estreptomicina . Los cinco tipos diferentes de MSC de ratón (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC y BDNF GDNF-GFP-MSC) se sembraron a alrededor del 30% de confluencia en frascos de cultivo celular T75 /. <ol><li> Célula de recubrimiento <ol><li> Al día siguiente, eliminar las soluciones de sustrato por aspiración y enjuagar cada pocillo con aproximadamente 200 l de PBS estéril, dos veces. Añadir medio de cultivo celular (200 l / pocillo) a cada pocillo después del enjuague final PBS. Coloque la placa de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular fijado en 37 ° C y 5% de CO 2 para el equilibrado. </li><li> Mientras que la placa de 96 pocillos se equilibradores en la incubadora, recoger las células (MSCs en matraces T75 deben ser aproximadamente 70% confluentes en el momento de la cosecha / chapado) mediante la recopilación de los medios de crecimiento (se hace referencia a medios de comunicación como condicionada) del matraz T75 y almacenar en un tubo cónico de 15 ml en condiciones estériles (este medio acondicionado se utilizará en el paso 2.1.4 a continuación). </li><li> Añadir 8 ml de PBS estéril al matraz y agitar suavemente y luego la pipeta de la PBS y añadir 1 ml de tripsina al 0,05% y 0,01%Solución de EDTA para separar las células de la superficie de cultivo del matraz T75. Monitorear el desprendimiento de células mediante la visualización del matraz usando un microscopio invertido equipado con óptica de contraste de fase. </li><li> Cuando las células han individual, añadir inmediatamente 8 ml de medio condicionado (recogidos en el paso 2.1.2) al matraz. Recoger la suspensión celular y transferir a un tubo de centrífuga cónico de 15 ml y centrifugar durante 4 min a 450 xg para sedimentar las células. </li><li> Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento de células en 200 l de fresco y calentado (37 ° C) medios de cultivo celular. </li><li> Determinar el número de células en la suspensión celular mediante la realización de un recuento de células viables azul de tripano usando un hemocitómetro. Placa de las células a una densidad de aproximadamente 300 células / pocillo en los pocillos apropiados de la placa de 96 pocillos. </li><li> Repita estos pasos para cada población de células. </li></ol></li><li> Time-lapse <ol><li> Una vez que todos los MSCs se han plateado, lugarla placa de 96 pocillos en una incubadora durante 2 horas para permitir que las MSC para unir al sustrato. </li><li> Inicie el sistema HCS y esperar 2 horas para que el sistema se equilibre. Ajuste el controlador ambiental a 37 ° C y conectar un cilindro de gas mixto que contiene 5% de CO2 en aire para el sistema de cámara ambiental HCS el suministro de una fuente de aire constante. </li><li> Retire la placa de 96 pocillos de la incubadora después del periodo de equilibración 2 hr y colocar directamente en la cámara de crecimiento celular del sistema de HCS. Permita 30 minutos para el equilibrio para dar cuenta de cualquier expansión relacionadas con el calor de la placa y luego iniciar la adquisición y análisis de imágenes de software para configurar los ajustes de la placa. </li><li> Seleccionar el objetivo 20X para formación de imágenes. Seleccione dos pozos por condición [es decir, las buenas prácticas agrarias-MSC en fibronectina etc. (6 sustratos x 5 subtipos MSC para un total de 30 condiciones x 2 repeticiones = 60 pozos en total)] para la creación de time-lapse. Elija dos sitios para la formación de imágenes conen cada pocillo. </li><li> Elija las longitudes de onda de luz correctas para imágenes. NOTA: Hay dos longitudes de onda diferentes (contraste de fase y fluorescencia GFP) fueron seleccionados para time-lapse. </li><li> Enfoque en el fondo del pozo con el autofoco láser y tomar imágenes de prueba para múltiples sitios y múltiples pozos para encontrar un plano focal optimizado. </li><li> Una vez que el enfoque se ha establecido, comenzar a capturar imágenes cada 5 minutos durante 48 horas para todos los 60 pozos (120 sitios). </li><li> Alimentar a las células cada 24 horas mediante la eliminación de la placa de 96 pozos del sistema de HCS. Retire 75 l de los medios de comunicación de cada pocillo y añadir 100 l de medio fresco a cada pocillo (equilibrar este medio fresco a 37 ° C y 5% de CO 2). </li><li> Al final del experimento de lapso de tiempo, retire la placa de 96 pozos del sistema de HCS. En condiciones estériles, recoger las muestras de medio condicionado de cada pocillo y transferir estas muestras a otra placa de 96 pocillos. NOTA: Estas muestras pueden ser utilizados para más analyses mediante la realización de ELISA para los factores neurotróficos. </li><li> Preparar la placa de 96 pocillos con MSCs cultivadas para ensayos adicionales, tales como ensayo de proliferación celular Ki67 o yoduro de propidio ensayo de tinción en vivo / muerto (ver detalles a continuación). </li><li> Realizar análisis de time-lapse de células de seguimiento migración / celular como se describe en la sección 5. </li></ol></li></ol> 3. Ki67 Proliferación Celular y yoduro de propidio Live / Dead Ensayo <ol><li> Ensayo de proliferación Ki67 celular (inmunocitoquímica) <ol><li> Enjuagar los cultivos de células con 0,1 M de fosfato (PO 4) tampón durante un minuto dos veces. Fijar el cultivo con 4% de paraformaldehído (PFA) durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar los pocillos con PBS durante siete minutos, tres veces. </li><li> Después del enjuague final, añadir 100 l de solución bloqueante (tampón fosfato salino, 5% de suero normal de burro, 0,4% de suero de albúmina bovina, y 0,2% de Triton X-100) a cada pocillo de unand incubar a temperatura ambiente durante 1 hr. Preparar el anticuerpo primario, conejo anti-Ki67, mediante la dilución en solución bloqueante en una relación de trabajo de 1: 200. </li><li> Eliminar la solución y aplicar bloqueador 100 l de la solución de anticuerpo primario a cada pocillo. Cubrir la placa de 96 pocillos e incubar las muestras a 4 ° C durante la noche. </li><li> Al día siguiente, eliminar la solución de anticuerpo y enjuagar con PBS durante 7 min, 3 veces. </li><li> Preparar el anticuerpo secundario, burro anti-conejo Cy3 en solución de bloqueo a una relación de trabajo de 1: 500. Añadir tinción nuclear DAPI a la solución de anticuerpo secundario a una dilución de 1: 100. Después de la eliminación del último aclarado PBS, aplicar 100 l de la solución de anticuerpo / DAPI secundario a cada pocillo. Incubar a temperatura ambiente en la oscuridad durante 90 min. </li><li> Eliminar la solución de anticuerpo / DAPI secundaria y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen. </li></ol></li><li> Propidium yoduro Live / Dead Ensayo <ol><li> Medir la muerte celular por yoduro de propidio (PI) ensayo de exclusión como se describe a continuación. </li><li> Preparar la solución de tinción de yoduro de propidio a una concentración de 1,5 mM en medio de cultivo. </li><li> Añadir 100 l de etanol al 70% a un pocillo de la MSCs durante 2 min con la intención de matar a esas células. Esto bien sirve como un control positivo para la tinción PI. La mayoría de las MSC será PI-manchado que indica la muerte celular. Eliminar la solución de etanol. </li><li> Añadir 100 l de solución de tinción de yoduro de propidio a cada pocillo e incubar durante 20 min a 37 ° C en un incubador de CO2 5%. </li><li> Enjuagar las células con tampón fosfato 0,1 M durante 1 min, 2 veces. Fijar las células con PFA al 4% en tampón 0,1 M P0 4 durante 20 min a temperatura ambiente. Retire la PFA y enjuagar con PBS tres veces durante 7 minutos. </li><li> Incubar con una solución de DAPI (01:50) diluido en solución bloqueante durante 1 hora a temperatura ambiente. Enjuague todos los pozos conPBS durante 7 min, 3 veces. </li><li> Eliminar la solución de DAPI y enjuagar cada pocillo con PBS durante 7 minutos, 3 veces. Cubrir la placa de 96 pocillos y se almacena a 4 ° C hasta su imagen. </li></ol></li></ol> Análisis 4. Automatización de Imágenes y Multiwavelength Scoring <ol><li> Cargue una placa de 96 pocillos (previamente procesada para immunolabeling Ki67 o yoduro de propidio manchadas) en el sistema de HCS y permita que la placa se equilibre durante 20 min Abra la adquisición y análisis de imagen sistema de software HCS. </li><li> Seleccione los valores de adquisición para el objetivo de 10X usando la cámara se va a agrupar en 1 y un ajuste de ganancia de 2. Busque el Z-plano en el que residen las células mediante la utilización de la función de exposición automática y calcular el desplazamiento para cada longitud de onda de interés. Para este análisis, imágenes de la captura de DAPI (W1), Cy3 (W2) y FITC (W3). Elija el nivel de intensidad máxima a la que los pocillos de control negativo no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Confirmar este ajuste es apropiado para la pospozos sitivos. </li><li> Adquirir plato. Captura imágenes y almacenarlas en la adquisición de imágenes y base de datos de software de análisis. </li><li> Una vez que las imágenes han sido adquiridas, imagen abierta adquisición y análisis de software fuera de línea y placa revisión de los datos de las imágenes adquiridas anteriormente. </li><li> Seleccione el análisis de puntuación Multi-longitud de onda. Configurar la intensidad mínima y máxima para cada longitud de onda. NOTA: detección DAPI debe marcar la coloración alrededor de cada núcleo visible. Cy3 debe detectar las células Ki67 positivas con inmunorreactividad (IR) y no debería detectar IR bajo los controles negativos. Para Cy3 Ki67 IR, el ancho mínimo aproximado fue de 7 m, ancho máximo aproximado fue de 30 m, la intensidad por encima del fondo local era 150 niveles de gris, y la zona manchada mínimo era de 50 m 2. </li><li> Ejecutar análisis para todas las posiciones. Exportar los datos para ver en hoja de cálculo. </li></ol> Seguimiento 5. celular <ol><li> Acquisitio Abrir imagenn y el programa de análisis y haga clic en &quot;Revisión de la placa de datos [DB] ...&quot;, la selección de la placa de interés. </li><li> Ver los datos como &quot;Tiempo vs. Bueno&quot;. </li><li> Elija uno de los sitios de la sección &quot;Sitios&quot; haciendo clic izquierdo en la selección deseada. Seleccione &quot;Transmitido ...&quot; en el capítulo &quot;Las longitudes de onda:&quot;. Haga clic derecho sobre la meta bien en la plantilla de la placa de 96 pocillos y haga clic en &quot;Cargar imágenes&quot;. </li><li> Seguimiento de las células haciendo clic en &quot;Aplicaciones&quot; y luego en &quot;Objetos de pista&quot;. </li><li> Utilice &quot;intercambio dinámico de datos (DDE)&quot; para elegir el formato para exportar los datos, por ejemplo, Microsoft Excel. </li><li> Elija los datos de seguimiento a la exportación, por ejemplo, el tiempo transcurrido, el número de objetos, la distancia, el intervalo de tiempo, velocidad, ángulo absoluto, distancia al origen, delta X y delta y. </li><li> Tag cada célula de interés con &quot;Ctrl + clic izquierdo&quot; en las células diana. </li><li> Células de pista. Si es necesario, detener / cambiar seguimiento inadecuado de las células con la tecla &quot;Esc&quot; y luego ajustar la configuración. </li><li> Después de rastreo celular es completa, guardar los datos con &quot;Registro de datos&quot;. </li></ol>

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Células madre adultas mesenquimales (MSCs) son un tipo de célula atractivo para el desarrollo de una estrategia experimental que combina una terapia basada en la entrega celular y génica. MSCs son multipotentes, capaces de diferenciarse en células de linaje mesodérmico, y muestran considerable plasticidad, diferenciando / transdifferentiating en linajes neuronales y gliales con la inducción apropiada paradigmas 17,18. Además, las MSC se han trasplantado y demostrado su eficacia en estudios preclínicos para una serie de trastornos, incluyendo enfermedades neurodegenerativas 19. La eficacia terapéutica de MSCs es bien conocido debido a sus anti-proliferativos beneficioso, actividades anti-inflamatorias y anti-apoptóticos 20. MSCs son también conocidos para producir y secretar diversos factores neurotróficos y de crecimiento, que probablemente contribuye a las cualidades neuroprotectoras asociados con MSCs ingenuos después del trasplante en los sitios de lesión o enfermedad 21. Importantly, MSCs se pueden modificar genéticamente para la entrega sostenida de factores neurotróficos para aplicaciones de terapias de gen celular y combinados y se han utilizado en un número de modelos animales de lesión o la enfermedad del CNS 11,19,22. En el desarrollo de una estrategia basada en la terapia celular y génica combinada, es importante que la salud de las células se evalúa cuidadosamente antes de su uso extensivo en vitro, y especialmente en aplicaciones in vivo. Como una prueba de concepto, que investigó múltiples poblaciones de líneas de ingeniería y MSC de control con el fin de estudiar las consecuencias de las modificaciones genéticas en la salud celular y fitness utilizando un enfoque de alto contenido de screening (HCS). En general, HCS se refiere a la selección de alto rendimiento basado en imágenes celular 14. Este enfoque de detección permite una evaluación cuantitativa de fenotipos celulares en múltiples niveles de espacial (celulares para subcelular) y temporales (milisegundos al día) resolución a través de diversas condiciones experimentales. Usando este enfoque accedimos posibles diferencias en la preferencia de sustrato sobre los siguientes parámetros: proliferación celular, la expresión de la proteína fluorescente verde (GFP), la muerte celular, la motilidad celular y / migración. Los experimentos fueron diseñados en formato de 96 pocillos placa de cultivo celular. Dentro de una sola placa se determinó rutinariamente posibles diferencias relacionadas con el sustrato con respecto a cada parámetro para las diferentes poblaciones de células MSC lentiviral transducidas y se compararon los MSCs de ingeniería con el original, MSC no transducidas. Esto proporcionó un medio para comparar directamente los resultados para los diferentes subtipos de MSC con una batería de ensayos in vitro tales como la proliferación celular utilizando immunolabeling Ki67, ensayo de viabilidad de células vivas / muertas mediante la tinción de yoduro de propidio, y el comportamiento celular mediante la realización de imágenes digitales en tiempo lapso . Como una extensión de esta HCS también se puede llevar a cabo pruebas ELISA en muestras de medios condicionados recogidos de individuo wells para determinar cuantitativamente la secreción de factores neurotróficos. El medio condicionado a partir de diferentes subtipos MSC también se puede utilizar en bioensayos in vitro para determinar la actividad biológica de factores secretados 11,23. Este tipo de plataforma de HCS también se puede utilizar para mediciones in vitro del crecimiento de neuritas a partir de cultivos neuronales primarios y líneas de células madre neurales 24. En general, nuestros resultados demostraron que las subpoblaciones de las MSCs genéticamente modificados muestran comportamientos similares en comparación con los MSCs no modificados. La influencia de diversos sustratos de cultivo sobre el crecimiento celular y la migración celular no fue dramáticamente diferente entre los subtipos de MSC, así como sustratos de cultivo. Como tal, los sustratos de matriz extracelular probados no parecen jugar un papel crítico en la modulación de estos aspectos de comportamiento de las células para estas diferentes MSCs de ingeniería. Este estudio demuestra el uso de un sistema de HCS para analizar different aspectos del comportamiento celular. Sin embargo, no es raro encontrar limitaciones asociadas con análisis de imagen. En ocasiones, al analizar las imágenes de fluorescencia, que era un poco difícil determinar el valor umbral por encima del cual correcta immunolabeled o células teñidas se contarían como positivamente marcado / manchado. Por lo tanto, para minimizar el sesgo subjetiva, la determinación de los valores umbral era dependiente de una comparación con los controles (controles negativos para imágenes de fluorescencia se llevaron a cabo en paralelo durante todo el procesamiento por la omisión de los anticuerpos primarios o secundarios). Se encontró Otra limitación durante el análisis de la migración celular utilizando la imagen digital de lapsos de tiempo. En algunos casos, el software de imagen no era capaz de diferenciar entre el movimiento browniano aleatorio de una célula frente a la migración de una célula en realidad sólo una distancia muy corta. Las limitaciones adicionales fueron evidentes en situaciones donde el software de análisis no era capaz de distinguir la presencia de multipcélulas LE en una proximidad muy cercana a uno-otro. Para superar esta limitación se requiere la selección manual de células durante el análisis en lugar de un análisis totalmente automatizado. Densidad de placas de la célula también puede resultar en sesgando los datos de migración celular entre poblaciones de células que muestran mayor preferencia para crecer en grupos frente a las células que crecen en aislados unos de otros. Estos tipos de diferencias son, en parte, probablemente un reflejo de la célula-sustrato frente a las preferencias de célula-célula. El uso de un sistema de HCS para adquirir imágenes y realizar análisis de datos proporciona un medio eficaz y rápidos para evaluar múltiples parámetros de la celda. Además, los vídeos digitales de lapso de tiempo de 30 condiciones diferentes (6 sustratos y 5 subtipos diferentes MSC) fueron adquiridos de forma rutinaria por períodos que van de horas a días (48 horas), mientras que el uso de la cámara ambiental. Posteriormente, estos datos se utilizó para calcular y determinar las diferencias en las tasas de migración celular a través de varias líneas celulares de diferente ECMmoléculas. En este informe hemos destacado la implementación de una plataforma de filtrado de contenido para evaluar la salud y la función celular. Este tipo de análisis es útil para el desarrollo de estrategias racionales para el diseño de tipos de células, así como sustratos de polímero para facilitar el crecimiento de células dirigida y la regeneración neural. Este es un paso esencial hacia la aplicación de entrega basada en células madre de factores terapéuticos antes de su extensa en los estudios preclínicos in vivo utilizando estrategias de trasplante celular.

Un problema importante con la implementación de terapias útiles para el tratamiento de trastornos del sistema nervioso se encuentra en el desarrollo de métodos eficaces que previenen la degeneración y también facilitan la recuperación de la función. Una estrategia innovadora es la modificación genética de células madre ingeniero ex vivo, para la producción de factores neuroprotectores, antes de su trasplante. Esta combinación de terapia basada en células, junto con un tipo de terapia de genes, proporciona un método potente para el tratamiento de la enfermedad o la muerte neuronal inducida por la lesión en el sistema nervioso. Los factores neurotróficos son esenciales para el crecimiento y la supervivencia de las neuronas en desarrollo, así como el mantenimiento y la plasticidad de las neuronas maduras. Un número de estudios han demostrado papeles significativos de factores neurotróficos en la promoción de crecimiento inicial y la diferenciación de las neuronas en el sistema nervioso central y periférico (SNC y SNP) y también puede estimular la regeneración in vitro y en unaNimal modelos de lesión neural 1. Cerebro-factor neurotrófico derivado (BDNF) es altamente expresado en el sistema nervioso central y desempeña un papel importante en la regulación del desarrollo neural, la plasticidad sináptica y la reparación 2. Derivado de la línea celular glial factor neurotrófico (GDNF) promueve la supervivencia de muchos tipos de neuronas incluyendo neuronas motoras dopaminérgicas y 3. Por lo tanto, una estrategia importante para la reparación neural es proporcionar fuentes exógenas de factores neurotróficos a las regiones lesionadas o enfermas del sistema nervioso. Las células derivadas de la médula ósea Multipotentes madre mesenquimales (MSC) tienen un gran potencial para la entrega de proteínas terapéuticas para tratar el sistema nervioso dañado o enfermo. El trasplante de MSCs ha atraído considerable atención en los esfuerzos para desarrollar terapias basadas en células compatibles paciente, ya que tienen un número de ventajas incluyendo, 1) relativa facilidad de aislamiento y mantenimiento, 2) capacidad multipotenciales, 3) pequeñas preocupaciones éticas, 4) Capacidad de sobrevivir y migrar después del trasplante y 5) el potencial para el trasplante autólogo de 4,5. Resultados prometedores se han reportado con el uso de MSC no tratados previamente y de ingeniería genética en modelos animales para un número de diferentes condiciones neurodegenerativas, incluyendo la lesión de la médula espinal 6,7, 8,9 accidente cerebrovascular, la deficiencia de mielina 10, y degeneración de la retina 11-13. El acoplamiento de trasplante de células con la entrega de factores neurotróficos partir de células madre genéticamente modificadas es una importante estrategia de reparación neural novedoso y. Un paso esencial en el desarrollo de sistemas de administración de factor terapéutico a base de células es determinar la salud normal de las células manipuladas. Como tal, el objetivo principal de este estudio fue evaluar los parámetros de crecimiento general de las células madre adultas genéticamente modificados. Un enfoque importante para evaluar rápidamente múltiples parámetros de la celda es emplear celular de alta a través screenin basado en imágenesg (HTS), se refirió a los procedimientos de tan alta de detección de contenido (HCS) 14 veces. Esta tecnología permite la adquisición de imágenes y análisis automatizado y este enfoque es especialmente adecuado para aplicaciones de investigación de células madre. En este proyecto hemos desarrollado una plataforma de perfiles que permite la caracterización rápida y optimización de las preferencias de sustrato celular y funciones celulares con células madre adultas de ingeniería genética que emplea un sistema de HCS.

<table><tbody><tr><td>Placas de 96 pocillos</td><td>Greiner Bio One</td><td>655090</td><td>Placas de 96 pocillos seleccionadas para su uso en ImageXpress</td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Anticuerpo anti-Ki67 de conejo</td><td>Abcam (Cambridge, MA)</td><td>Ab16667</td><td>Dilución 1:200</td></tr><tr><td>Colágeno tipo I</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>C7661</td><td>Colágeno de cola de rata</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>D3571</td><td></td></tr><tr><td>Burro anti-Conejo Cy3</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>711-165-152</td><td>dilución 1:500</td></tr><tr><td>ECL (Entactina-Colágeno-Laminina)</td><td>Millipore/Chemicon (Temecula, CA)</td><td>08-110</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30071.03</td><td></td></tr><tr><td>Suero equino</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr>Tienda de química de<td>etanol</td><td>(Ames, IA)</td><td>12003510</td><td>100%, 200 pruebas</td></tr><tr><td>de fibronectina</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>CB-40008</td><td></td></tr><tr><td>Iscove' s Medio Dulbeccos Modificado (IMDM)</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P285</td><td>Para PO4 tampón</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>P288</td><td>Para tampón PO4</td></tr><tr><td>L-Glutamina</td><td>Gibco/Invitrogen (Grand Island, NY)</td><td>25030-081</td><td></td></tr><tr><td>Laminina (ratón)</td><td>Trevigen (Gaithersburg, MD)</td><td>3400-010-01</td><td></td></tr><tr><td>MSCs de ratón de ratones C57BL/6 adultos</td><td>Tulane Cent para terapia génica (Nueva Orleans, LA)</td><td></td><td>Aislado de la médula ósea</td></tr><tr><td>MSCs modificadas genéticamente (GFP, BDNF, GDNF, BDNF/ GDNF)</td><td>Estas células se obtuvieron de nuestro estudio anterior: Ye et. al. (en preparación)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de burro normal (NDS)</td><td>Jackson Immuno Res Lab (West Grove, PA)&nbsp;</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehído (PFA)</td><td>Fisher Scientific (Hampton, NH)</td><td>O4042</td><td>4% PFA en 0,1 M Tampón PO4</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-lisina</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Yoduro de propidio (PI)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich (St. Louis, MO)</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina 0.05% (EDTA 1x)</td><td>Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Iscove's Modified Dulbecco's</td><td>Medium Invitrogen (Carlsbad, CA)</td><td>12440&ndash; 046</td><td></td></tr><tr><td>Hibridoma FBS</td><td>Hyclone (Logan, UT)</td><td>SH30396.03</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone de suero equino</td><td>(Logan, UT)</td><td>SH3007403</td><td></td></tr><tr><td>ImageXpress Micro</td><td>Dispositivos moleculares (Sunnyvale, CA)</td><td>ImageXpress micro</td><td>Sistema de cribado de alto contenido</td></tr><tr><td>MetaXpress 4.0</td><td>Dispositivos moleculares (Sunnyvale, CA)</td><td>MetaXpress 4.0</td><td>Adquisición y análisis de imágenes software</td></tr></tbody></table>

alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

High Throughput Characterization of Adult Stem Cells Engineered for Delivery of Therapeutic Factors for Neuroprotective Strategies

Las células madre mesenquimales (MSCs) derivadas de la médula ósea son un poderoso recurso celular y se han utilizado en numerosos estudios como posibles candidatas para desarrollar estrategias para el tratamiento de una variedad de enfermedades. El propósito de este estudio fue desarrollar y caracterizar las MSCs como vehículos celulares diseñados para la administración de factores terapéuticos como parte de una estrategia neuroprotectora para rescatar el sistema nervioso dañado o enfermo. En este estudio utilizamos MSCs de ratón modificadas genéticamente utilizando vectores lentivirales, que codificaron el factor neurotrófico derivado del cerebro (BDNF) o el factor neurotrófico derivado de las células gliales (GDNF), junto con la proteína fluorescente verde (GFP). 
Antes de proceder con los estudios de trasplante in vivo, era importante caracterizar las células modificadas para determinar si la modificación genética alteraba o no aspectos del comportamiento normal de las células. Se examinaron diferentes sustratos de cultivo para determinar su capacidad para apoyar la adhesión, proliferación, supervivencia y migración celular de las cuatro subpoblaciones de MSC modificadas. Se realizó un cribado de alto contenido (HCS) y un análisis de imágenes. 
Los sustratos examinados incluyeron: poli-L-lisina, fibronectina, colágeno tipo I, laminina, entactina-colágeno IV-laminina (ECL). El inmunomarcaje Ki67 se utilizó para investigar la proliferación celular y la tinción con yoduro de propidio para investigar la viabilidad celular. Las imágenes de lapso de tiempo se llevaron a cabo utilizando un sistema de cámara de luz transmitida/ambiental en el sistema de detección de alto contenido.
Nuestros resultados demostraron que las diferentes subpoblaciones de las MSCs modificadas genéticamente mostraron comportamientos similares que eran, en general, comparables a los de las MSCs originales no modificadas. La influencia de los diferentes sustratos de cultivo en el crecimiento celular y la migración celular no fue drásticamente diferente entre los grupos que compararon los diferentes subtipos de MSC, así como los sustratos de cultivo. 
Este estudio proporciona una estrategia experimental para caracterizar rápidamente las células madre modificadas y sus comportamientos antes de su aplicación en estudios de trasplante in vivo a largo plazo para el rescate y la reparación del sistema nervioso.

Los parámetros de crecimiento de MSC fueron examinados por el cultivo de las diferentes poblaciones de MSC sobre diferentes sustratos. Las cinco poblaciones diferentes de subtipos MSC (MSC, GFP-MSC, BDNF-GFP-MSC, GDNF-GFP-MSC, y BDNF / GDNF-GFP-MSC) se sembraron en placas de 96 pocillos de cultivo de tejidos pre-revestidas con el diferente sustratos como se ilustra en la Figura 1. Después de cuatro días de cultivo, las placas se fijaron y immunolabeled y / o teñidas con los reactivos apropiados y luego examinadas utilizando el sistema de HCS y análisis realizados con la adquisición de la imagen y el programa de software de análisis. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig1highres.jpg" width="650" /> Figura 1:. Plantilla de la placa de 96 pocillos para el diseño experimental placas de 96 pocillos se recubrieron con varios sustratos y los pocillos se sembró con células madre Engineered como se muestra en la plantilla. Como un ejemplo, sólo wells en filas BF se utilizaron en este experimento. Filas A, G y H se quedaron vacíos. Abreviaciones - MSC: células madre mesenquimales; GFP-MSC: verde fluorescentes MSC que expresan la proteína; BDNF-GFP-MSC: derivado del cerebro MSC factor que expresan GFP neurotróficos; GDNF-GFP-MSC; Derivado de células gliales MSC factor que expresan GFP neurotróficos; BDNF / GDNF-GFP-MSC; BDNF y GDNF MSC expresan GFP; ECL: entactina-colágeno IV-laminina). Immunolabeling anti-Ki67, seguido de contratinción DAPI, se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados proliferación de las diferentes poblaciones de MSCs de ingeniería (Figura 2a). Expresión del antígeno Ki67 se produce preferentemente durante las fases finales de G 1, S, G 2 y M del ciclo celular, y no se detecta en las células en la fase de reposo (G 0), y por lo tanto es útil como un marcador para la proliferación celular 15 . 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) es un nu comúnmente utilizadocounterstain clara y el cromosoma que emite fluorescencia azul tras la unión a AT regiones de ADN 16. El número total de células en un campo puede determinarse contando el número de núcleos teñidos con DAPI. Como se ilustra en la Figura 2B, aunque hubo una variación en los porcentajes de MSCs en proliferación, todos los sustratos, sin embargo, el apoyo considerable proliferación celular para cada uno de los subtipos de MSC. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2: ensayo de proliferación celular Ki67. (A) Fusionada, imagen doble fluorescente de Ki67 immunolabeling (rojo) y DAPI (azul) tinción nuclear. Muchos de los MSCs se immunolabeled con el anticuerpo Ki67 (rojo). Barra de escala = 50 m. (B) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de Ki67 immunolabeled subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágenoTipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Yoduro (PI) tinción de propidio se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influenciados supervivencia celular (Figura 3). El yoduro de propidio es un contratinción nuclear y el cromosoma-rojo fluorescente de uso común. El yoduro de propidio es impermeable a la membrana y generalmente excluido de células viables, y por lo tanto es útil para detectar las células muertas en una población. La proporción de células muertas dentro de una condición dada se puede determinar cuando se combina con una etiqueta nuclear general tal como DAPI para identificar todas las células dentro de un campo. El porcentaje de células PI-positivo era bajo en todos los sustratos examinados (La Figura 3). Como control positivo para el reactivo de PI, a unos pocillos que contienen MSCs se incubaron en 70% de etanol, una condición conocida para matar la mayoría de las células, lo que resulta en un alto porcentaje de células PI-etiquetados como se ilustra en la Figura 3B y 3C (etanol tratada positivo control). <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3: ensayo de la muerte celular yoduro de propidio. (A) Fusionada, doble imagen fluorescente de yoduro de propidio (rojo) y DAPI (azul) tinción. Aunque los núcleos de todas las células viables se tiñeron con DAPI (azul), no se detectó tinción con yoduro de propidio en el MSC. (B) Prácticamente todos los MSCs se tiñeron con yoduro de propidio después de la exposición a etanol al 70%. Las barras de escala en A y B = 100 m. (C) Gráfico de barras que ilustra los porcentajes de yoduro de propidio (PI) manchada subtipo MSCs crecido en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, colágeno o entactina-IV-laminina (ECL) sustratos para 5 días in vitro (DIV). Control de etanol: Esta condición sirvió como control positivo para el reactivo de tinción PI. La mayoría de las células sometidas a tinción PI tras el tratamiento de etanol están muertos y por lo tanto manchadas positivamente para el reactivo PI. N = un experimento. Cada barra representa un promedio de los datos agrupados de 8 sitios fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Para investigar la posible influencia de los diferentes sustratos en el comportamiento de las MSC de ingeniería, la migración celular se analizó mediante microscopía digital en tiempo transcurrido y el sistema de transmisión de luz / ambiental cámara en el sistema HCS (ver Suplementario Video 1). Múltiples sitios / pocillo fueron imágenes de lapso de tiempoy se utiliza para calcular las tasas de migración celular para las diferentes subpoblaciones de MSC que crecen en los diferentes sustratos utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. En general, como se muestra en la Figura 4C, todos los subtipos de MSC mostraron la tasa de migración más rápida en las superficies de la matriz extracelular (fibronectina recubiertos, colágeno, laminina y ECL) y el más lento en las superficies no revestidas de poliestireno. <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" width="700" /> Figura 4:. De seguimiento de la célula y la migración MSC rastreados con adquisición de imágenes y software de análisis. Imágenes superpuestas de luz y fluorescencia de transmisión de imágenes (A) el inicio de time-lapse y (B) en 29 horas más tarde al final de la sesión de time-lapse (ver Suplementario Video 1). Pistas de migración celular se indican con el li colornes. Barra de escala:. 50 micras gráfico (C) de barras que ilustra las tasas de migración media (expresada como m / h) para los subtipos de MSC cultivadas en poliestireno (PS), poli-L-lisina (PLL), fibronectina, colágeno tipo I, laminina, o entactina-colágeno IV-laminina (ECL) sustratos para 2 días in vitro (DIV). N = un experimento. Cada barra representa la media de al menos 10 células fotografiados de 2 pozos para cada condición. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52242/52242fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> Tomados en conjunto, estos resultados proporcionan evidencia preliminar de que estas subpoblaciones de MSCs genéticamente modificados presentan propiedades de crecimiento similares. Estos resultados proporcionan evidencia convincente de que la lentiviral mediada modificaciones genéticas de estos MSC inducidos sin efectos deletéreos detectables dramáticos sobre los parámetros de crecimiento investigados utilizando esta plataforma de cribado. Suplementario vídeo 1. Time-lapse vídeo digital de MSC seguimiento utilizando el programa de software de adquisición y análisis de imágenes. La ruta de migración es para dos MSC [indicadas como 1 (línea de rastreo verde) y 2 (línea de rastreo azul)] se ilustran. Vídeo capturado durante un período de 29 horas. Las imágenes fueron capturadas cada 5 min. Las imágenes de fluorescencia de MSC que expresan GFP se utilizó para time-lapse en la elaboración del video. La barra de calibración = 50 micras. Este tipo de análisis es útil para la investigación de comportamientos celulares, incluyendo la migración celular y la división celular.

Este estudio describe una plataforma experimental para caracterizar rápidamente células madre modificadas y sus comportamientos antes de su aplicación en estudios de trasplante in vivo a largo plazo para el rescate y reparación del sistema nervioso.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

Mesenchymal stem cells (MSCs) derived from bone marrow are a powerful cellular resource and have been used in numerous studies as potential candidates to ...

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar rápidamente las células madre modificadas genéticamente utilizando un sistema de cribado de alto contenido o HCS. Esto se logra primero diseñando y preparando experimentos para una placa de 96 pocillos, y luego colocando las diferentes poblaciones de células madre modificadas. A continuación, el sistema de cribado de alto contenido se prepara para la obtención de imágenes de células vivas y, a continuación, se inicia la obtención de imágenes de lapso de tiempo durante el período de tiempo deseado.Luego, después de completar las imágenes de lapso de tiempo, la placa de cultivo se prepara para los procedimientos de tinción celular como el yoduro de propidio, la tinción para la muerte celular o el etiquetado inmunológico KI 67 para caracterizar la proliferación celular. Finalmente, la placa de 96 pocillos se vuelve a cargar en el sistema de cribado de alto contenido para la obtención de imágenes de fluorescencia y adquisición de imágenes. En última instancia, el software de análisis de imágenes se utiliza para realizar análisis de datos para la determinación de diferentes parámetros de crecimiento celular.Esta metodología puede ayudar a abordar cuestiones clave en el campo de la biología de las células madre, como la identificación y caracterización de los factores que estimulan la diferenciación de las células madre. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las estrategias terapéuticas basadas en células debido a la importancia de caracterizar los tipos celulares antes de su uso in vivo. Este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de las células y se puede aplicar a prácticamente cualquier otro tipo de célula que crezca bien en cultivo.Además, estos enfoques pueden utilizarse potencialmente en organismos enteros como la larva de pez cebra. Para comenzar, cree un mapa como se muestra aquí de la placa de 96 pocillos que describa los diferentes sustratos y tipos de células que se examinarán bajo una campana de cultivo estéril. Prepare una estación de trabajo con diferentes sustratos y una placa de 96 pocillos.Agregue 100 microlitros de solución de sustrato a cada uno, bien de acuerdo con el mapa. Luego use una tira de perfil para sellar la tapa y almacene a cuatro grados centígrados durante la noche después de aislar células madre mesenquimales de ratón e infectarlas con vectores lentivirales de acuerdo con el protocolo de texto, retire las soluciones de sustrato de la placa de 96 pocillos y use aproximadamente 200 microlitros de PBS estéril para lavar los pocillos dos veces. Una vez retirado el enjuague final a 200 microlitros de medio de cultivo celular y equilibrar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.Mientras tanto, en condiciones estériles, coseche las MSC recogiendo primero el medio de crecimiento, ahora conocido como el medio acondicionado, del matraz en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añada ocho mililitros de PBS estéril al matraz y agite suavemente antes de aspirar el tampón Para separar las células del matraz, añada un mililitro de solución de tripsina al 0,05% y EDTA al 0,01%. Cuando las células se hayan desprendido, agregue ocho mililitros del medio acondicionado antes de recolectar la suspensión celular y volver a sembrar las células a aproximadamente 300 células por pocillo.De acuerdo con el protocolo de texto, incube la placa durante dos horas para permitir que las MSC se adhieran al sustrato mientras las células se incuban. Inicie el sistema HCS y espere dos horas para que se equilibre. Ajuste el controlador ambiental a 37 grados centígrados y encienda con cuidado el cilindro de gas mezclado que contiene un 5% de dióxido de carbono en el aire al sistema HCS, cámara ambiental que suministra una fuente de aire constante.A continuación, después del período de incubación de dos horas, retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y colóquela directamente en la cámara ambiental del sistema HCS. Después de permitir que la placa se equilibre durante 30 minutos, inicie el software para configurar los ajustes de la placa. Una vez que se hayan configurado los parámetros de imagen, de acuerdo con el protocolo de texto, use el enfoque automático láser para enfocar el fondo del pozo y tome imágenes de prueba de múltiples sitios y múltiples pozos para encontrar un plano focal optimizado.Una vez que se haya establecido el enfoque, comience a capturar imágenes cada cinco minutos durante 48 horas para los 60 pozos. Al final del experimento, retire la placa de 96 pocillos del sistema HCS en condiciones estériles, recoja muestras de medio acondicionado de cada pocillo y transfiéralas a una placa nueva de 96 pocillos. Estas muestras se pueden utilizar posteriormente para que un ELIZA lleve a cabo un ensayo de proliferación celular KI 67.Utilice un tampón de fosfato molar de 0,1 molares para enjuagar los cultivos celulares durante un minuto. Después de repetir el lavado, use 4% de formaldehído o PFA a temperatura ambiente durante 20 minutos para fijar los cultivos después de la fijación. Retire el PFA y use PBS para enjuagar los pocillos tres veces durante siete minutos cada uno.Después de bloquear las células de acuerdo con el protocolo de texto, aplique 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada una. Cubra bien el plato e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de lavar las celdas tres veces durante siete minutos.Para cada lavado, aplique un anticuerpo secundario. Coloque las células en la oscuridad e incube a temperatura ambiente durante 90 minutos después de otros tres lavados. Cubra el plato y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta la toma de imágenes.Para realizar imágenes automatizadas, cargue la placa inmunomarcada en el sistema HCS y deje que la placa se equilibre durante 20 minutos. Abra el software de adquisición y análisis de imágenes del sistema HCS. Elija la configuración de adquisición para el objetivo 10 x utilizando la flexión de la cámara en uno y un ajuste de ganancia de dos.Utilice la función de exposición automática para encontrar el plano Z en el que residen las celdas y calcular el desplazamiento para cada longitud de onda de interés para el análisis que se muestra aquí. Captura de imágenes para DAP, EGFP y S3. Elija el nivel de intensidad máximo en el que los pozos de control negativo no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Utilice la misma configuración de umbral para pozos positivos.Por último, capture imágenes y guárdelas en una base de datos antes de realizar el análisis de imágenes. De acuerdo con el protocolo de texto, como se muestra aquí, cinco poblaciones diferentes de subtipos de MSC se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos precodificadas con diferentes sustratos en esta figura, anti KI 67, que identifica las células en proliferación, y DAPI se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influían en la proliferación de las diferentes poblaciones de MSC modificadas como se ilustra aquí, aunque hubo variación en los porcentajes de proliferación de MSCs, todos los sustratos soportaron una proliferación celular considerable para cada subtipo de MSC. Este gráfico muestra que el porcentaje de células con yoduro de propidio o tinción de PI, que identifica las células muertas en una población, es bajo en todos los sustratos examinados, las células tratadas con etanol al 70%, que mata a la mayoría de las células, exhibieron una alta tasa de marcaje de PI y sirve como control positivo para investigar el comportamiento de las MSC en diferentes sustratos.La migración celular durante un período de 29 horas se analizó mediante microscopía digital de lapso de tiempo. La ruta de migración para la celda uno y la celda dos está marcada por la línea verde y azul respectivamente. Como se muestra aquí, todos los subtipos de MSC mostraron la tasa de migración más rápida en la matriz extracelular, las superficies recubiertas, y la más lenta en las superficies de poliestireno no recubiertas.Al intentar este procedimiento, es importante recordar planificar y diseñar cuidadosamente el experimento para un formato de placa de varios pocillos, como una placa de 96 pocillos. Otros métodos, como Eliza S, se pueden realizar en medios condicionados para responder preguntas adicionales sobre la producción y secreción de factores terapéuticos por parte de las células madre modificadas después de su desarrollo. Los procedimientos de cribado de alto contenido han allanado el camino para que los investigadores en los campos de la biología de las células madre y el descubrimiento de fármacos exploren sistemas biológicos complejos de forma eficaz.

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Protocolos para la diferenciación neuronal de las células madre humanas pluripotentes (hPSCs) son a menudo mucho tiempo y requieren considerables conocimientos de cultivo de células. Aquí, hemos adaptado una molécula pequeña de un procedimiento basado en una diferenciación a un formato de placa de multititre, que permite la generación sencilla, rápida, y eficiente de las neuronas humanas de una manera controlada.

Generación rápida y eficiente de las neuronas a partir de células madre pluripotentes en un formato de placa Multititre

Fuente: Sharma, A. D., et.al. Caracterización de alto rendimiento de células madre adultas diseñada para la administración de factores terapéuticos para estrategias neuroprotectoras. J. Vis. Exp. (2015)Este video demuestra el proceso de caracterización de células madre mesenquimales transgénicas diseñadas para expresar factores neurotróficos terapéuticos. Describe los pasos involucrados en la fijación, permeabilización y tinción de las células con anticuerpos primarios y secundarios dirigidos a...

Caracterización de células madre mesenquimales modificadas genéticamente para aplicaciones neuroterapéuticas

Las células madre neurales cosechadas desde el cerebro adulto están aumentando utilizan en aplicaciones que van desde la investigación básica del desarrollo del sistema nervioso para la exploración de potenciales aplicaciones clínicas en medicina regenerativa. Esto hace que el control riguroso de las condiciones de aislamiento y cultivo utilizadas para cultivar estas células críticas para sonar los resultados experimentales.

Cultivo de células madre neurales de Regiones convencionales y no convencionales del cerebro adulto de roedores

Se desarrolló un método para derivar directamente las células madre neurales humanas a partir de células progenitoras hematopoyéticas enriquecidas a partir de células de sangre periférica.

La inducción directa de las células madre neurales humanas a partir de células de sangre periférica progenitoras hematopoyéticas

Generación de células madre pluripotentes inducidas ofrece perspectivas fascinantes para la derivación de los trasplantes autólogos. Sin embargo, la progresión a través de un estado pluripotente y laborioso re-diferenciación todavía dificulta traducción clínica. Aquí se describe la derivación de fibroblastos humanos de adultos y su conversión directa en células progenitoras neuronales inducidas y la posterior diferenciación en linajes neuronales.

Derivación de adultos fibroblastos humanos y de su conversión directa en células progenitoras neurales expandible

Aquí presentamos un método para un modelo humano en vitro de estiramiento lesiones en un formato de 96 pozos en una escala de tiempo pertinente al trauma de impacto. Esto incluye métodos para la fabricación de placas estirables, cuantificar el insulto mecánico, cultivo y lesionar las células, la proyección de imagen y alto contenido análisis para cuantificar daños.

Método para la lesión de estiramiento de alta velocidad de humanos inducida por las neuronas derivadas de células madre pluripotentes en formato de 96 pocillos

Presentamos un método genético modificado-libre (GM-libre) para obtener las células con un fenotipo neuronal de glóbulos periféricos reprogramados. La activación de una vía de señalización vinculada a la nueva proteína humana ligada a GPI revela un método eficiente libre de GM para la obtención de células madre pluripotentes humanas.

Generación Libre De Gm De Células Neuronales Derivadas De La Sangre

Describimos la producción de cultivos mixtos de astrocitos y células precursoras de oligodendrocitos derivadas de células madre neurales fetales o adultas que se diferencian en oligodendrocitos maduros, y el modelado in vitro de estímulos nocivos. El acoplamiento con una técnica de detección de alto contenido basada en células construye un sistema de detección de drogas confiable y robusto.

Diferenciación de cribado de alto contenido y análisis de maduración de cultivos de células precursoras de oligodendrocitos derivados de células madre neurales fetales y adultas

Se describe un protocolo para reprogramar fibroblastos derivados de la piel humana en células progenitoras neuronales inducidas (iNPCs), y su posterior diferenciación en astrocitos inducidos (iAs). Este método conduce a la generación rápida y reproducible de iNPCs e iAs en grandes cantidades.

Modelado in vitro para enfermedades neurológicas utilizando la conversión directa de fibroblastos a células progenitoras neuronales y la diferenciación en astrocitos

Aquí, describimos un sistema de nucleofección diseñado para mejorar la eficiencia de la entrega de genes en células madre neurales expandidas (NSC) aisladas de la zona subventricular murina adulta. Los hallazgos demuestran que este método mejora significativamente la perturbación génica en las NSC, superando la efectividad de los protocolos tradicionales de transfección y mejorando la tasa de supervivencia celular.

Aislamiento, expansión y nucleofección de células madre neurales de la zona subventricular murina adulta

Aquí, describimos un protocolo para diseñar células madre químicamente reprogramadas para lograr una modulación neuronal precisa mediante la diferenciación de estas células en células precursoras dopaminérgicas, trasplantándolas a modelos de ratón de la enfermedad de Parkinson y evaluando los resultados conductuales y electrofisiológicos para confirmar la integración exitosa y la efectividad funcional de las células trasplantadas.

Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Aprende a caracterizar células madre adultas de ingeniería mediante cribado de alto contenido en placas de 96 pocillos. Este método permite analizar proliferación y migración celular en tiempo real para aplicaciones terapéuticas neuroprotectoras.

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras (Video) | JoVE Journal

Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

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