Alto rendimiento caracterización de células madre adultas de ingeniería para la entrega de los factores terapéuticos de estrategias neuroprotectoras

El objetivo general de este procedimiento es caracterizar rápidamente las células madre modificadas genéticamente utilizando un sistema de cribado de alto contenido o HCS. Esto se logra primero diseñando y preparando experimentos para una placa de 96 pocillos, y luego colocando las diferentes poblaciones de células madre modificadas. A continuación, el sistema de cribado de alto contenido se prepara para la obtención de imágenes de células vivas y, a continuación, se inicia la obtención de imágenes de lapso de tiempo durante el período de tiempo deseado.

Luego, después de completar las imágenes de lapso de tiempo, la placa de cultivo se prepara para los procedimientos de tinción celular como el yoduro de propidio, la tinción para la muerte celular o el etiquetado inmunológico KI 67 para caracterizar la proliferación celular. Finalmente, la placa de 96 pocillos se vuelve a cargar en el sistema de cribado de alto contenido para la obtención de imágenes de fluorescencia y adquisición de imágenes. En última instancia, el software de análisis de imágenes se utiliza para realizar análisis de datos para la determinación de diferentes parámetros de crecimiento celular.

Esta metodología puede ayudar a abordar cuestiones clave en el campo de la biología de las células madre, como la identificación y caracterización de los factores que estimulan la diferenciación de las células madre. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia las estrategias terapéuticas basadas en células debido a la importancia de caracterizar los tipos celulares antes de su uso in vivo. Este método puede proporcionar información sobre el comportamiento de las células y se puede aplicar a prácticamente cualquier otro tipo de célula que crezca bien en cultivo.

Además, estos enfoques pueden utilizarse potencialmente en organismos enteros como la larva de pez cebra. Para comenzar, cree un mapa como se muestra aquí de la placa de 96 pocillos que describa los diferentes sustratos y tipos de células que se examinarán bajo una campana de cultivo estéril. Prepare una estación de trabajo con diferentes sustratos y una placa de 96 pocillos.

Agregue 100 microlitros de solución de sustrato a cada uno, bien de acuerdo con el mapa. Luego use una tira de perfil para sellar la tapa y almacene a cuatro grados centígrados durante la noche después de aislar células madre mesenquimales de ratón e infectarlas con vectores lentivirales de acuerdo con el protocolo de texto, retire las soluciones de sustrato de la placa de 96 pocillos y use aproximadamente 200 microlitros de PBS estéril para lavar los pocillos dos veces. Una vez retirado el enjuague final a 200 microlitros de medio de cultivo celular y equilibrar la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono.

Mientras tanto, en condiciones estériles, coseche las MSC recogiendo primero el medio de crecimiento, ahora conocido como el medio acondicionado, del matraz en un tubo cónico de 15 mililitros. A continuación, añada ocho mililitros de PBS estéril al matraz y agite suavemente antes de aspirar el tampón Para separar las células del matraz, añada un mililitro de solución de tripsina al 0,05% y EDTA al 0,01%. Cuando las células se hayan desprendido, agregue ocho mililitros del medio acondicionado antes de recolectar la suspensión celular y volver a sembrar las células a aproximadamente 300 células por pocillo.

De acuerdo con el protocolo de texto, incube la placa durante dos horas para permitir que las MSC se adhieran al sustrato mientras las células se incuban. Inicie el sistema HCS y espere dos horas para que se equilibre. Ajuste el controlador ambiental a 37 grados centígrados y encienda con cuidado el cilindro de gas mezclado que contiene un 5% de dióxido de carbono en el aire al sistema HCS, cámara ambiental que suministra una fuente de aire constante.

A continuación, después del período de incubación de dos horas, retire la placa de 96 pocillos de la incubadora y colóquela directamente en la cámara ambiental del sistema HCS. Después de permitir que la placa se equilibre durante 30 minutos, inicie el software para configurar los ajustes de la placa. Una vez que se hayan configurado los parámetros de imagen, de acuerdo con el protocolo de texto, use el enfoque automático láser para enfocar el fondo del pozo y tome imágenes de prueba de múltiples sitios y múltiples pozos para encontrar un plano focal optimizado.

Una vez que se haya establecido el enfoque, comience a capturar imágenes cada cinco minutos durante 48 horas para los 60 pozos. Al final del experimento, retire la placa de 96 pocillos del sistema HCS en condiciones estériles, recoja muestras de medio acondicionado de cada pocillo y transfiéralas a una placa nueva de 96 pocillos. Estas muestras se pueden utilizar posteriormente para que un ELIZA lleve a cabo un ensayo de proliferación celular KI 67.

Utilice un tampón de fosfato molar de 0,1 molares para enjuagar los cultivos celulares durante un minuto. Después de repetir el lavado, use 4% de formaldehído o PFA a temperatura ambiente durante 20 minutos para fijar los cultivos después de la fijación. Retire el PFA y use PBS para enjuagar los pocillos tres veces durante siete minutos cada uno.

Después de bloquear las células de acuerdo con el protocolo de texto, aplique 100 microlitros de solución de anticuerpos primarios a cada una. Cubra bien el plato e incube a cuatro grados centígrados durante la noche. Después de lavar las celdas tres veces durante siete minutos.

Para cada lavado, aplique un anticuerpo secundario. Coloque las células en la oscuridad e incube a temperatura ambiente durante 90 minutos después de otros tres lavados. Cubra el plato y guárdelo a cuatro grados centígrados hasta la toma de imágenes.

Para realizar imágenes automatizadas, cargue la placa inmunomarcada en el sistema HCS y deje que la placa se equilibre durante 20 minutos. Abra el software de adquisición y análisis de imágenes del sistema HCS. Elija la configuración de adquisición para el objetivo 10 x utilizando la flexión de la cámara en uno y un ajuste de ganancia de dos.

Utilice la función de exposición automática para encontrar el plano Z en el que residen las celdas y calcular el desplazamiento para cada longitud de onda de interés para el análisis que se muestra aquí. Captura de imágenes para DAP, EGFP y S3. Elija el nivel de intensidad máximo en el que los pozos de control negativo no muestran ninguna señal para la adquisición de imágenes. Utilice la misma configuración de umbral para pozos positivos.

Por último, capture imágenes y guárdelas en una base de datos antes de realizar el análisis de imágenes. De acuerdo con el protocolo de texto, como se muestra aquí, cinco poblaciones diferentes de subtipos de MSC se sembraron en placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos precodificadas con diferentes sustratos en esta figura, anti KI 67, que identifica las células en proliferación, y DAPI se utilizó para evaluar si los diferentes sustratos influían en la proliferación de las diferentes poblaciones de MSC modificadas como se ilustra aquí, aunque hubo variación en los porcentajes de proliferación de MSCs, todos los sustratos soportaron una proliferación celular considerable para cada subtipo de MSC. Este gráfico muestra que el porcentaje de células con yoduro de propidio o tinción de PI, que identifica las células muertas en una población, es bajo en todos los sustratos examinados, las células tratadas con etanol al 70%, que mata a la mayoría de las células, exhibieron una alta tasa de marcaje de PI y sirve como control positivo para investigar el comportamiento de las MSC en diferentes sustratos.

La migración celular durante un período de 29 horas se analizó mediante microscopía digital de lapso de tiempo. La ruta de migración para la celda uno y la celda dos está marcada por la línea verde y azul respectivamente. Como se muestra aquí, todos los subtipos de MSC mostraron la tasa de migración más rápida en la matriz extracelular, las superficies recubiertas, y la más lenta en las superficies de poliestireno no recubiertas.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar planificar y diseñar cuidadosamente el experimento para un formato de placa de varios pocillos, como una placa de 96 pocillos. Otros métodos, como Eliza S, se pueden realizar en medios condicionados para responder preguntas adicionales sobre la producción y secreción de factores terapéuticos por parte de las células madre modificadas después de su desarrollo. Los procedimientos de cribado de alto contenido han allanado el camino para que los investigadores en los campos de la biología de las células madre y el descubrimiento de fármacos exploren sistemas biológicos complejos de forma eficaz.