Name: Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-03-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 58 s
Description: Aprende a evaluar conjugados de anticuerpos para acumulación en células tumorales usando imágenes PET y líneas celulares TF1A. Este método mejora el desarrollo de terapias oncológicas dirigidas con localización nuclear eficiente.

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Este trabajo fue financiado por la sociedad de investigación del cáncer (Canadá) y el CIMS. Los autores agradecen ayuda Dr. Samia Ait-Mohand y Jean-Francois Beaudoin. Dr. Ángel López (Universidad del sur de Australia) para mAb A14.

Los autores no tienen nada que revelar

Objetivos principales de la entrega sistémica de agentes contra el cáncer son aumentar la acumulación en el sitio del tumor y la absorción dentro de las células cancerosas y reducir los efectos secundarios no deseados en los tejidos sanos. Entrega de AC dirigido de cargas moleculares a las células tumorales es un enfoque muy prometedor para tratar y detectar tumores. Sin embargo, la falta de eficacia causada por atrapamiento del endosome y por degradación lisosomal de corriente sigue siendo un reto importante. Si bien es...

Conjugados de anticuerpos (ACs) son productos biofarmacéuticos que están madurando en una clase transformadora de medicamentos eficaces para mejorar los tratamientos contra el cáncer y para detectar tumores. Compuesta por un anticuerpo monoclonal (mAb) conjugado con la moleculares cargas tales como radioisótopos, moléculas pequeñas y las toxinas biológicas, ACs son capaces de entregar las cargas útiles a las células cancerosas con destino exquisito antígeno afinidad y especificidad. Así, ACs tienen el potencial para reducir toxicidad inespecífica considerablemente y aumentar la actividad de carga en el sitio del tumor. Terapéutico, ACs transporte citotóxicas moléculas pequeñas (comúnmente contempladas como fármacos de anticuerpos conjugados) han sido aprobados para el tratamiento de pacientes con cáncer de mama y linfoma de Hodgkin, que han fracasado los tratamientos convencionales 1, 2. Además, radioisótopos transporte ACs (comúnmente contempladas como radioimmunoconjugates) también están en desarrollo. CA transporte de radioisótopos para la proyección de imagen está aprobado para la identificación de metástasis de cáncer de próstata 3. Con muchos ACs más terapéutico presentado para aprobación 4, el optimismo es alto para el futuro de ACs para mejorar la atención de cáncer 5.
Sin embargo, cuando ofrecer quimioterapia o radioisótopos, ACs tener dificultad con eficacia acumulando estas cargas dentro de las células diana. Este aspecto contribuye significativamente en muchos casos la imposibilidad de ACs para proporcionar larga duración de supervivencia libre de enfermedad o tumor de alto contraste proyección de imagen de 6,7. En general, una vez que ACs se unen su antígeno blanco se internalizan a través de un proceso conocido como endocitosis mediada por receptor. Los ACs son atrapados dentro de endosomas y trata a los lisosomas para su degradación y liberación de carga 8. El proceso de tráfico intracelular plantea desafíos para el ACs lograr una carga alta especificidad y eficacia contra las células cancerosas de destino. Por ejemplo, muchos antígenos como Her2 (target para terapéutica AC Trastuzumab-emtansine) puede reciclar hasta un 85% de los anticuerpos encuadernados en los primeros 30 min 9. Además, una vez que se produce degradación, quimioterápicos liberado y radioisótopos pueden ser activamente exportados por aumento de la expresión o actividad de transporte de membrana asociada proteínas 10,11. Degradación del lisosoma también impide la entrega de novela cargas biológicas tales como enzimas terapéuticas y oligonucleótidos que pueden ser desactivado de 12,13. En esencia, la célula cancerosa es altamente efectiva en abrogar la necesaria acumulación intracelular de cargas por ACs.
Este protocolo describe cómo implementar el concepto de ACs-unida a péptidos derivados de virus, especialmente para escapar captura endosome y localizar al núcleo celular. Con tal sofisticación para manipular sistemas host de la célula, no es sorprendente que el desarrollo de péptidos y proteínas derivadas del virus como potenciales biofármacos durante mucho tiempo ha sido arraigado en investigación terapéutica 14. Durante millones de años los virus han evolucionado para adquirir una colección excepcional de proteínas capaces de explotar los sistemas fisiológico normal de la célula mamífera para entrar eficazmente en las células del huésped. Para virus que son internalizados por endocitosis mediada por receptor, son también desafiaron con escape trata al lisosoma donde el embate de una concentración localizada de proteasas puede ser problemático para la supervivencia. Un bien caracterizado péptido viral derivados utilizado en la entrega de la droga para escapar captura endosome es el virus de inmunodeficiencia humana transactivator de transcripción (Tat) proteína 15. TAT es capaz de escapar captura endosome detectando en qué punto cambios conformacionales de la proteína ocurren Tat propicio para insertarse en y alterar la membrana endosomal del 16de pH bajo. Esto resulta en conjugados de Tat-carga útil acceder al citoplasma. El segundo elemento de manipulación viral relacionada con este protocolo es el enfoque utilizado para entregar genes terapéuticos y medicamentos para la de núcleo 17. Virus han evolucionado para manipular con éxito maquinaria de la célula huésped para progresar más allá de la membrana nuclear pasando a través del poro nuclear complejo (NPC). Macromoléculas celulares contienen (o se unen a proteínas que contienen) transportan de señales de localización nuclear (NLSs) necesarias para atar a nuclear proteínas (e.g. carioferinas α y β), que proporcionan los movimientos requeridos a través de la APN. Virus han desarrollado proteínas para contener secuencias NLS que les proporcionen la capacidad para utilizar proteínas de transporte de la célula anfitrión para realizar la transición en el núcleo 18.
Numerosos ACs previamente han sido funcionalizados con péptidos derivados de Tat y NLS y probados por su capacidad para acumular dentro de las células cancerosas y para apuntar tumores 19,20,21,22 ,23,24,25,26,27,28,29,30 (tabla 1). Entrega de cargas citotóxicos los estudios han demostrado que ACs modificado con péptidos derivados de virus son capaces de aumentar significativamente la acumulación celular, citotoxicidad y tumor matando sobre si ACs 22,26. Una característica común de esta nueva clase de AC es su construcción. Por lo general, péptidos contienen una cisteína terminal proporciona un grupo sulfhidrilo libre. MAbs se reaccionó primero con un crosslinker bifuncional de noncleavable que contiene N- hydroxysuccinimide (NHS) y grupos de maleimida en extremos opuestos. Los ésteres de NHS reaccionan con aminas primarias en el mAb para formar enlaces amida. El mAb reaccionado con los grupos de maleimida gratis es entonces reaccionado con los grupos sulfhidrilo de los péptidos para formar un thioester enlace y así une el péptido y el mAb. Aunque homobifunctional reticulados han utilizado 28, heterobifunctional crosslinker son más comúnmente utilizados en la construcción de 22,23,de péptido derivado de virus-ACs26, 31,32. Este protocolo utiliza específicamente el crosslinker sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl) ciclohexano-1-carboxilato (sulfo-SMCC) por su facilidad de uso y porque se utiliza en el conjugado de anticuerpo-medicamento aprobado Trastuzumab-emtansine y en muchos 22, 8,23,26,de péptido derivado de virus-ACs de31,32. Electroforesis en gel de poliacrilamida sodio dodecil sulfato (SDS-PAGE) es el método principal para determinar inicialmente la eficiencia verbal y para la cuantificación del número de péptidos por mAb. La microscopia confocal utiliza un anticuerpo secundario marcado con fluorescencia específico para el mAb suele ser el método para evaluar inicialmente la propiedades de la distribución intracelular de ACs de péptido modificado derivado de virus. Hasta el momento, radioisótopos son las cargas primarias por virus derivados péptidos modificados ACs. Radioisótopos son ventajosas porque la radioactividad en las células se cuantifica fácilmente contando gamma. Además, ACs que se traducen en modelos de ratón de los cánceres humanos proporcionan los investigadores con la capacidad de evaluar tumor targeting mediante modalidades de proyección de imagen moleculares, tales como emisión de fotón único tomografía computada y tomografía por emisión de positrones (PET) 23 , 32 , 33. en general, la construcción y validación de métodos utilizados principalmente por los investigadores de pruebas proporcionan una muy buena evaluación de ACs modificado con péptidos derivados de virus durante la fase de desarrollo inicial con eficacia y entregar los capacidad de carga interior de las células diana y atacan tumores.
TAT y NLS-modificado ACs tienen iluminadas áreas clave para mejorar aún más la entrega de la carga útil dentro de las células cancerosas y tumores. Con respecto a ACs NLS-modificado, la eficiencia en la acumulación intracelular puede ser modesta 23,31,34. Ineficaz acumulación intracelular es causada por compresión continuada endosomal. En vivo tumor targeting puede también disminuir con tanto Tat y NLS-modificado ACs. Las secuencias activas de Tat y NLS contienen varios residuos cargados positivas. Cuando sujeta a mAbs, la carga total catiónica puede ser significativamente mayor de 35. Como consecuencia, el Tat y NLS-modificado ACs han aumentado absorción en tejidos sanos y aumenta la separación rápida de la sangre.
Nuestro grupo desarrolló un compuesto compuesto compuesto de ácido cólico relacionado con NLS (ChAcNLS; Figura 1). Modificado de ChAcNLS ACs son capaces de aumentar la acumulación intracelular de radioisótopos entregados y mejorar tumor targeting en comparación con el tradicional y modificado de NLS ACs 33,34. El mecanismo detrás de ácido cólico se inspira en la capacidad de seleccionarlos nonenveloped virus que no puede confiar en la fusión de la membrana a utilizar ácido cólico para activar endosome escape a través de la formación de ceramida. Por ejemplo, virus entérico porcino reclutas de ácido cólico que activa la esfingomielinasa, que cataliza la hidrólisis de esfingomielina a ceramida 36,37,38. Esto desestabiliza la membrana endosomal y permite el escape del virus. Así, el ácido cólico es otro componente derivado de virus que complementa NLS.
Como este campo se mueve hacia adelante y el futuro los avances se producen en la entrega de la carga de ACs con péptidos derivados de virus, es un momento oportuno para ofrecer las manifestaciones visuales de sus características bioquímicas y funcionales durante el desarrollo inicial. Aquí, describimos nuestro protocolo para la evaluación inicial de los derivados del virus modificado de péptido ACs para la determinación simple pero eficaz de acumulación intracelular y tumor orientación durante el desarrollo temprano de la etapa. Usamos los mAbs comercialmente disponibles 7 3 y A14 como sistemas modelo de ejemplo. Procedimiento 1 describe el uso de SDS-PAGE como un método que permite las decisiones ' go/no go' de ACs construido. Procedimiento 2 describe un método mediante tripsinización permitiendo mejor visualización de la acumulación y la distribución intracelular de AC. Procedimiento 3 describe un método para mejorar fraccionamiento intracelular determinar con precisión la localización nuclear. En este procedimiento utilizamos la carga 64Cu (t1/2 = 12,7 h) ya que es vulnerable a la emanación celular y es un emisor de positrones 10. Así, 4 procedimiento describe en vivo tumor a caracterización por animal doméstico proyección de imagen para visualizar la captación del tumor en relación con el fondo (es decir, tejidos sanos no objetivo) y determinar si el ejemplo AC puede específicamente y con eficacia atacan tumores. Estos métodos son suficientes para los investigadores desarrollar ACs modificado con péptidos derivados de virus para identificar a candidatos para más adelanto.

<table><tbody><tr><td>Sulfo-SMCC</td><td>Thermo Scientific</td><td>22122</td><td>Hay muchos reticulantes de maleimida homo y heterobifuncionales entre los que elegir.</td></tr><tr><td>Filtros centrífugos Amicon Ultra-0.5 mL EMD</td><td>Millipore</td><td>UFC505096</td><td>Hay tamaños de paquete de 8, 24 y 96. Elige según tus necesidades.</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td><td>BioRad</td><td>1610375EDU</td><td>Proteínas recombinantes Mulicolor de 10 a 250 kDa.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,25%), rojo de fenol,</td><td>Thermo Scientific 25200056</td><td></td><td>volúmenes de 100 o 500 mL a elegir.</td></tr><tr><td>Anticuerpo secundario IgG (H+L) anti-ratón de cabra, conjugado Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Scientific</td><td>A-21235</td><td>1 - 10 &mu; g/mL recomendado</td></tr><tr><td>NOTA-NHS</td><td>CheMatech</td><td>C100</td><td></td></tr><tr><td>Lamin A/C anticuerpo (N-18)</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-6215</td><td></td></tr><tr><td>Rab7 anticuerpo</td> Santa <td>Cruz Biotechnology</td><td>sc-376362</td><td></td></tr><tr><td>A14 mAb</td><td>BD Biosciences</td><td>555902</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampón de muestra (4x)</td><td>Thermo Scientific</td><td>NP0007</td><td></td></tr><tr><td>2- Mercaptoetanol</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Celdas TF-1a</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-2003</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 medio</td><td>ATCC</td><td>ATCC 30-2001</td><td></td></tr><tr><td>RIPA tampón de lisis y extracción</td><td>Thermo Scientific</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>AMIDE software de imágenes médicas</td><td>disponible en amide.sourceforge.net</td><td></td><td>Descarga</td></tr> <tr><td>completamente gratuitaMicroscopio confocal FluoView FV1000</td><td>Olympus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software Fluoview</td><td>Olympus</td><td></td><td>www.olympus-lifescience.com</td></tr><tr><td>Tiras ITLC Biodex</td><td></td><td>150-771</td><td></td></tr></tbody></table>

evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar tumor targeting

Initial Evaluation of Antibody-conjugates Modified with Viral-derived Peptides for Increasing Cellular Accumulation and Improving Tumor Targeting

Conjugados de anticuerpos (ACs) modificados con péptidos derivados de virus son una clase potencialmente poderosa de tumor de la célula entrega agentes de cargas moleculares utilizadas en el tratamiento del cáncer y la proyección de imagen debido a la creciente acumulación celular sobre ACs actual. Durante el temprano AC en vitro desarrollo, técnicas de fluorescencia y radioinmunoanálisis son suficientes para determinar la localización intracelular, la acumulación eficiencia y especificidad de la célula blanco. En la actualidad, no existe consenso en los métodos estandarizados para la preparación de las células para evaluar la localización y acumulación intracelular de AC. Las pruebas iniciales de ACs modificado con péptidos derivados de virus es fundamental sobre todo si se han construido varios candidatos. Determinar la acumulación intracelular de fluorescencia puede ser afectado por la señal de fondo de ACs en la superficie celular y complicar la interpretación de la acumulación. Para radioinmunoanálisis, células tratadas normalmente se fracciona y midió la radiactividad en compartimentos celulares diferentes. Sin embargo, lisis celular varían de célula a célula y compartimientos a menudo citoplasmáticos y nucleares no están adecuadamente aislados. Esto puede producir la engañosos datos sobre propiedades de entrega de carga. La inyección intravenosa de radiactivos ACs de péptido modificado derivado de virus en ratones seguidos por gammagrafía del cojinete del tumor es un método eficaz para determinar propiedades de tumor targeting y carga entrega en la fase de en vivo de desarrollo. Sin embargo, esto es un avance relativamente reciente y pocos grupos han evaluado derivados de virus ACs péptido modificado de esta manera. Describimos el tratamiento de células tratadas para evaluar con mayor precisión derivados de virus modificado de péptido AC la acumulación cuando se utiliza el radioinmunoanálisis y microscopía confocal. Específicamente, un método para quitar la superficie de la célula de las células trypsinizing bound ACs. También proporcionamos un método para mejorar el fraccionamiento celular. Por último, este protocolo proporciona un método en vivo utilizando tomografía por emisión de positrones (PET) para evaluar el tumor inicial dirigida a propiedades en ratones con tumores. Utilizamos el radioisótopo 64Cu (t1/2 = 12,7 h) como una carga de ejemplo en este protocolo.

Para el procedimiento 1, la construcción de 7 3 modificado con ChAcNLS uso de sulfo-SMCC como un crosslinker es muy confiable. Por lo general, cuando se cargan en un gel de 12% y analizadas por SDS-PAGE, esto se traduce en aumentos progresivo distinguibles en MW proporcional al aumento de ratios de sulfo-SMCC-a - 7 3 usa y permite para que las cadenas pesadas y ligeras para evaluarse individualmente para ChAcNLS verbal (figura 3). 7G 3 reaccionaron en 10, 20, 25-y ratios ...

Péptidos virales derivados juntados a conjugados de anticuerpos (ACs) es un enfoque ganando impulso debido a la posibilidad de entregar cargas moleculares con la acumulación de células de tumores aumentado. Utilizando métodos comunes para evaluar verbal de péptido, AC y acumulación intracelular de carga útil y tumor targeting, este protocolo ayuda a los investigadores durante las fases de desarrollo inicial clave.

Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

Antibody-conjugates (ACs) modified with virus-derived peptides are a potentially powerful class of tumor cell delivery agents for molecular payloads used ...

El objetivo general de estos procedimientos es evaluar la especificidad y la eficacia de los conjugados de anticuerpos para acumularse en el interior de las células diana y los tumores durante las etapas iniciales de desarrollo para que finalmente puedan ser utilizados en la clínica. Este método puede ayudar a responder a preguntas clave sobre los campos conjugados, como la eficiencia de la localización nuclear y la acumulación intercelular general. Una ventaja de esta técnica es que, a través de imágenes PET, los investigadores pueden evaluar la eficacia y la selectividad de los conjugados de anticuerpos candidatos.Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia la terapia y el diagnóstico del cáncer, ya que la acumulación ineficaz de células tumorales es una limitación importante de estas aplicaciones para los conjugados de anticuerpos. Después de sintetizar un conjugado de anticuerpo de secuencia de localización nuclear de ácido cólico de acuerdo con el protocolo de texto, trate las células TF1A diana con 200 conjugados de anticuerpos MLS de ácido cólico 7G3 de 200 nanomolares. Incluyen células tratadas con anticuerpos monoclonales de control modificados.Incubar cinco vec

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JoVE Journal

Bioengineering

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Fuente: Heidbuechel, J. P., et al.. Paramixovirus para la inmunomodulación dirigida a tumores: diseño y evaluación ex vivo. J. Vis. Exp. (2019).Este video demuestra un ensayo celular para evaluar la actividad inmunomoduladora específica frente al blanco de un enganchador bispecífico de células T (BTE) codificado por un virus. El BTE une células tumorales que expresan un receptor diana con células T, desencadenando la lisis tumoral y la liberación de enzimas. Una lectura colorimétrica, basada en...

Evaluación de la actividad inmunomoduladora de un enganchador de células T bispecífico codificado viralmente

Este video muestra el proceso de evaluación de la distribución intracelular de conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados de virus utilizando microscopía confocal. La secuencia de localización nuclear derivada del virus dirige los conjugados de anticuerpos dentro del citoplasma, lo que se confirma mediante inmunotinción y medición de fluorescencia.

Evaluación de la distribución intracelular de conjugados de anticuerpos modificados con péptidos derivados de virus

Aquí, los autores presentan un protocolo simple y eficiente para definir un epítopo antigénico lineal utilizando un anticuerpo monoclonal purificado y escaneo de péptidos a través de hibridación dot-blot. El epítopo identificado puede utilizarse en aplicaciones terapéuticas y diagnósticas.

La identificación de un epítopo lineal de células B reconocido por anticuerpos monoclonales péptido Escaneo-asistida

Hemos diseñado la proteína de la cápside del virus de la hepatitis E como una nanopartícula de teranosis (HEVNP). HEVNP uno mismo-monta en una jaula icosaédrica estable en la prestación de la mucosa. Aquí, describimos la modificación de HEVNPs para el tumor por mutando residuos superficie expuesta a las cisteínas, que conjugan sintético ligandos que se unen específicamente a las células del tumor.

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Incorporar un cyclopropene derivado de la lisina de anticuerpos permite la vinculación específica, rápida y eficiente de moléculas tetrazina-cojinete para generar fármacos de anticuerpos conjugados.

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En este protocolo, se describe la síntesis de las vainas, un reactivo phenyoxadiazolyl metil sulfona-basado para el acoplamiento selectivo sitio de cargos a los tioles de biomoléculas, especialmente de anticuerpos. Además, se describen la síntesis y caracterización de un quelante bifuncional de rodamiento de las vainas y su conjugación a un anticuerpo de modelo.

Síntesis y Bioconjugation de tioles reactivos reactivos para la creación de sitio selectivamente modificados Immunoconjugates

El método de localización de inmunofluorescencia in vivo (IVIL) se puede utilizar para examinar la biodistribución in vivo de anticuerpos y conjugados de anticuerpos con fines oncológicos en organismos vivos utilizando una combinación de segmentación tumoral in vivo e inmunostainización ex vivo Métodos.

Localización de Inmunofluorescencia In Vivo para la Evaluación de la Biodistribución de Anticuerpos Terapéuticos y Diagnóstico en la Investigación del Cáncer

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Conjugación química de un anticuerpo purificado dirigido por DEC-205 con proteína de longitud completa para atacar células dendríticas de ratón in vitro e in vivo

Aprende a evaluar conjugados de anticuerpos para acumulación en células tumorales usando imágenes PET y líneas celulares TF1A. Este método mejora el desarrollo de terapias oncológicas dirigidas con localización nuclear eficiente.

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Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

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