Evaluación inicial de los conjugados de anticuerpos modificados con péptidos virales derivados para aumentar la acumulación celular y mejorar Tumor Targeting

El objetivo general de estos procedimientos es evaluar la especificidad y la eficacia de los conjugados de anticuerpos para acumularse en el interior de las células diana y los tumores durante las etapas iniciales de desarrollo para que finalmente puedan ser utilizados en la clínica. Este método puede ayudar a responder a preguntas clave sobre los campos conjugados, como la eficiencia de la localización nuclear y la acumulación intercelular general. Una ventaja de esta técnica es que, a través de imágenes PET, los investigadores pueden evaluar la eficacia y la selectividad de los conjugados de anticuerpos candidatos.

Las implicaciones de estas técnicas se extienden hacia la terapia y el diagnóstico del cáncer, ya que la acumulación ineficaz de células tumorales es una limitación importante de estas aplicaciones para los conjugados de anticuerpos. Después de sintetizar un conjugado de anticuerpo de secuencia de localización nuclear de ácido cólico de acuerdo con el protocolo de texto, trate las células TF1A diana con 200 conjugados de anticuerpos MLS de ácido cólico 7G3 de 200 nanomolares. Incluyen células tratadas con anticuerpos monoclonales de control modificados.

Incubar cinco veces 10 a la sexta célula antígeno positivo con los conjugados a 37 grados centígrados durante una hora. Luego retire el sobrenadante y use un mililitro de PBS helado para lavar las células tres veces. Agregue medio fresco e incube las células a 37 grados centígrados durante una hora más.

A continuación, agregue 0,5 mililitros de PBS, que contiene 0,25% de tripsina y EDTA, e incube las células a 37 grados centígrados durante un máximo de 30 minutos. A continuación, utilice 1,5 mililitros de medio RPMI1640 con un 10%FBS para neutralizar la tripsina. Centrifugar las células a 500 veces G durante cinco minutos, eliminar el sobrenadante y utilizar 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las células tres veces más.

Agregue 0,5 mililitros de 1% de PFA y 1% de sacarosa y PBS a las células, y colóquelas en hielo durante 30 minutos para fijarlas. A continuación, utilice 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las células tres veces y centrifugar las muestras a 250 veces G durante cinco minutos. A continuación, agregue 0.15%Triton X-100 y PBS a las celdas, y permeablelas en hielo durante cinco minutos.

Luego, con PBS helado, lave las células y repita la centrifugación. Suspenda las células en 0,1 mililitros de PBS, que contienen dos microgramos por mililitro de un anticuerpo policlonal secundario FC antiespejo conjugado con Alexa Fluor 647, e incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante una hora. Centrifugar las células a 250 veces G durante cinco minutos y utilizar 0,5 mililitros de PBS helado para lavar las células tres veces.

A continuación, suspenda las células en 0,5 mililitros de PBS. Agregue 10 microgramos por mililitro de yoduro de propidio a las células. A continuación, utilice el medio de montaje para montar una vez 10 en la quinta celda en portaobjetos de vidrio antes de cubrir la muestra con un cubreobjetos de vidrio.

Examine las células con un objetivo de inmersión en aceite Plan APO 60X, apertura numérica 1,42, en un microscopio confocal de barrido láser invertido. Detecte la fluorescencia PI utilizando el láser de argón de 488 nanómetros y el prisma de escaneo espectral configurado para 600 a 650 nanómetros. Para la fluorescencia AF 647, utilice el láser de helio-neón de 633 nanómetros y el prisma de escaneo espectral configurado para 650 a 700 nanómetros.

Recopile imágenes de PI y AF 647 secuencialmente, 1024 por 1024 píxeles, con un promedio de línea 2X, tomadas a intervalos de 0,5 micras a través de todo el grosor de la celda. Presente las imágenes como proyecciones Z. Para analizar las células, evalúe y registre si la fluorescencia intracelular en el citoplasma está agrupada y cerca de la superficie celular o es difusa y homogénea.

Evalúe también la intensidad relativa de fluorescencia por célula. Después de preparar y concentrar el conjugado de anticuerpo NLS contra el cólico y el ácido radiomarcado de acuerdo con el protocolo de texto, determine la eficiencia del radiomarcaje aplicando 0,5 microlitros de citrato de sodio PH5,5 0,1 molar, o eluyente ITLC, a una tira de ITLC. Forme una autorradiografía de la tira y obtenga una imagen digital.

Realizar densitometría para obtener la proporción de Cobre-64 unido y libre. Si el contenido de Cobre-64 libre es superior al 5%, concentre aún más la muestra. Para los estudios de acumulación celular de cobre-64, trate las células con 100 nanomolares de conjugados A14 marcados con cobre-64 a 37 grados Celsius durante una, seis y 24 horas, como se describió anteriormente.

Tratar las células con A14 no modificado para bloquear los alfacitos IL5R y a cuatro grados Celsius para bloquear la internalización mediada por receptores. Después de lavar las células e incubar con medio fresco, como se demostró anteriormente en este video, agregue 0,5 mililitros de PBS que contenga 0,25% de tripsina y EDTA, e incube a 37 grados centígrados durante 15 minutos. Luego, después de neutralizar y lavar las células como antes, agregue tampón de lisis de membrana plasmática a las células e incube en hielo durante 10 minutos.

Centrifugar las células lisadas por membrana plasmática a 90 veces G durante cinco minutos. Retire el sobrenadante y transfiéralo a un tubo nuevo. Representa la fracción citoplasmática.

Luego use PBS helado para lavar los núcleos tres veces y agregue los lavados a la fracción citoplasmática. Asegúrese de que los viales que contienen las fracciones nuclear y citoplasmática estén sellados, luego colóquelos en un contador gamma calibrado para Cobre-64 con el fin de convertir los recuentos brutos a megabecaril. Determinar la calidad del aislamiento de núcleos mediante la realización de análisis de Western Blot para la lamina AC, una proteína nuclear restringida; y Rab-7, una proteína citoplasmática abundante, en fracciones de lisado al por mayor, nucleares y citoplasmáticas.

Trate cinco veces 10 a las seis células con 500 microlitros de ensayo de radio-aminoprecipitación, o tampón RIPA, y tampón de lisis de membrana plasmática que contenga 1%2% y 4%NP-40. Además, tratar los núcleos aislados con 500 microlitros de tampón RIPA para obtener proteínas nucleares aisladas. Agregue cuatro veces el volumen de muestra de acetona fría a las proteínas nucleares, citoplasmáticas y mayoristas aisladas, e incube durante 60 minutos a menos 20 grados Celsius.

Centrifugar las muestras a 13.000 veces G durante 10 minutos. Decantar el sobrenadante, teniendo cuidado de no desalojar la bolita de proteína. Luego agregue 100 microlitros de PBS para disolver las proteínas.

Después de realizar la Western Blotting como se describió anteriormente, corte la membrana por la mitad en el marcador de peso molecular de 40 kilodalton. Use anticuerpos específicos de lamina-AC para sondear la transferencia que contiene las proteínas de mayor peso molecular, y use anticuerpos específicos de Rab-7 para sondear la mitad inferior de la membrana. En grupos que contengan cuatro ratones nodskit, inyecte en la vena de la cola de 20 a 30 microgramos de conjugado de anticuerpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado, A14 NLS radiomarcado y A14 radiomarcado.

El mismo día, coloque un maniquí cilíndrico que contenga cinco megabecaril de cobre-64 en el escáner PET para convertir los recuentos radiactivos por segundo en dosis inyectadas por gramo de tejido. 48 horas más tarde, después de anestesiar a los ratones de acuerdo con el protocolo de texto, transfiera rápidamente un ratón a una mesa de escáner PET en la posición prona de cabeza con una nariz para isoflurano. Inicie la adquisición de datos PET utilizando una configuración de modo de muestreo regular y una ventana de energía de 250 a 650 kiloelectronvoltios.

Después del escaneo, retire el mouse del escáner y vuelva a colocarlo en la jaula. Como se muestra en esta figura, las flechas muestran la diferencia al evaluar la acumulación de conjugados de anticuerpos con y sin tripsinización. En las células que no están tripsinizadas, la acumulación y distribución intracelular es difícil de evaluar debido a la sobreexpresión de los receptores de superficie de la célula diana.

Las flechas muestran la diferencia en la acumulación intracelular y la distribución de dos candidatos a conjugados de anticuerpos cuando las células están debidamente tripsinizadas. El conjugado de anticuerpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado muestra afinidad nanomolar por IL5R alfa. Con el aumento de las concentraciones de conjugado de anticuerpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado, la unión específica del conjugado de anticuerpo NLS de ácido cólico A14 se acercó a la saturación a concentraciones de 3,5 nanomolares en las células HT-1376 y HT-B9.

El recuento gamma revela que el aumento de la radiactividad en el núcleo y en el citoplasma del conjugado del anticuerpo NLS de ácido cólico A14 radiomarcado es específico y aumenta con el tiempo. Las células HT-1376 y HT-B9 se incubaron con tampón de lisis de membrana plasmática que contenía 1%2%o 4%NP-40. Para las células HT-1376 y HT-B9, el tampón de lisis que contiene uno o 2% de NP-40 Rap-7 no se detectó en la fracción nuclear, y la lamina AC no se detectó en la fracción citoplasmática.

La PET permite evaluar los conjugados de anticuerpos candidatos por su capacidad para dirigirse a tumores con antígeno positivo, flechas rojas y azules y sus propiedades de biodistribución asociadas en comparación con el anticuerpo parental no modificado con péptidos. Se puede ver la acumulación de señales en el tumor para ayudar a seleccionar el potencial de un conjugado de anticuerpos desarrollado. La PET también permite evaluar la captación de conjugados de anticuerpos candidatos en tejidos sanos como el hígado.

Después de dominar estas técnicas, los investigadores en el campo de la administración de tumores dirigidos a cargas moleculares podrán explorar agentes adicionales donde la acumulación de células tumorales se ve obstaculizada debido al atrapamiento del endosoma.