Funcionalización superficial de nanopartículas de Virus de Hepatitis E métodos de conjugación química

El objetivo general de la funcionalización química de la superficie de las nanopartículas HEV es proporcionar un enfoque repetible y coherente para la conjugación de moléculas inmunogénicas, terapéuticas y diagnósticas dirigidas a la superficie de las nanopartículas HEV con fines de diagnóstico y tratamiento. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la nanomedicina, como la forma de mejorar la focalización del cáncer y la distribución de nanoterapias. La principal ventaja de esta técnica es que es altamente reproducible, eficiente y mucho más fácil de lograr en comparación con la ingeniería genética generada.

Los encargados de demostrar los procedimientos estarán a cargo de Michelle Nguyen e Iván Ruiz, asistentes de investigación de nuestro laboratorio. Comience este protocolo con la producción y purificación de nanopartículas del virus de la hepatitis E como se describe en el protocolo de texto. Diluir las muestras de nanopartículas HEV entre 0,5 y dos miligramos por mililitro con MES de 10 milimolares, pH 6,2 para una imagen TEM.

Ionice las rejillas recubiertas de carbono con una descarga incandescente de 40 miliamperios durante 30 segundos para producir una superficie de carbono hidrófilo. La superficie de carbono hidrófilo de las rejillas solo puede durar 30 minutos después del tratamiento de descarga incandescente. Después de la ionización, sostenga la rejilla y las pinzas y agregue dos microlitros de la muestra de nanopartículas HEV a la rejilla.

Después de 15 a 30 segundos, seca la cuadrícula con papel de filtro. A continuación, lave inmediatamente la rejilla con agua destilada doble y vuelva a secar con papel de filtro. Agregue inmediatamente dos microlitros de acetato de uranilo al dos por ciento a la rejilla.

Después de 15 segundos, seca la cuadrícula con papel de filtro. Seque las rejillas de muestra colocándolas en un gabinete seco con deshumidificador electrónico durante la noche. Dependiendo de la muestra, puede ser necesaria la microscopía electrónica criogénica o la crio-EM para la visualización y caracterización de la estructura.

Transfiera la cuadrícula a un TEM y la imagen con un aumento de 10 a 80 K. Las nanopartículas HEV aparecen en TEM como proteínas icosaédricas vacías de aproximadamente 27 nanómetros de diámetro debido a la ausencia de ARN viral. Para realizar la conjugación en un solo paso de las nanopartículas HEV y la biotina ligada a la maleimida, primero aplique las nanopartículas HEV a las miniunidades de diálisis.

Diálisis las nanopartículas contra 0,01 molar PBS pH 7,4 a temperatura ambiente durante una hora según el protocolo del fabricante. Después de la diálisis, transfiera las nanopartículas HEV a tubos de 1,5 mililitros y mida la concentración de proteínas a 280 nanómetros con un espectrofotómetro. Mezcle las nanopartículas a un miligramo por mililitro con una cantidad igual de 100 micromolares de maleimida biotina y 0,01 molar de PBS pH 7,4 para hacer una proporción de uno a cinco molares.

Después de reaccionar durante la noche a cuatro grados centígrados, retire la biotina de maleimida no unida con un procedimiento de columna de desalinización de centrifugación de acuerdo con el protocolo del fabricante. Analice las muestras a través de una página SDS reductora estándar. Utilizando los procedimientos estándar, prepare un Western blot quimioluminiscente utilizando estreptavidina ligada a HRP y capture la señal quimioluminiscente mediante una película de rayos X.

Para realizar la conjugación en dos pasos del ligando específico de la célula de cáncer de mama, LXY30, con la cisteína expuesta a la superficie en nanopartículas HEV, primero aplique las nanopartículas a miniunidades de diálisis y dialice contra 0,01 molar PBS pH 7,4 a temperatura ambiente durante una hora. A continuación, transfiera las nanopartículas HEV a tubos de 1,5 mililitros y mida la concentración de proteínas a 280 nanómetros utilizando un espectrofotómetro. A continuación, combine 650 micromolares de maleimida azida y 650 micromolares de alquino LXY30 con 200 micromolares de sulfato de cobre y un milimolar de ácido ascórbico.

Esto forma LXY 30 ligado a maleimida a 650 micromolares. Incubar la mezcla a cuatro grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, mezcle las nanopartículas HEV a un miligramo por mililitro con aproximadamente un 10% de volumen de LXY 30 unido a maleimida para hacer una proporción de uno a tres molares.

Reacciona durante la noche a cuatro grados centígrados. Debido a la concentración relativamente alta de maleimida LXY 30, las concentraciones finales de los reactivos, como el sulfato de cobre, se reducen aproximadamente 10 veces después de la mezcla. Para evitar su daño a las nanopartículas del virus de la hepatitis E, otra opción es el método de contribución libre de cobre.

Retire la maleimida no unida haga clic LXY 30 con una columna de desalinización por centrifugado de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mantenga las nanopartículas HEV enlazadas con LXY 30 a cuatro grados centígrados. Para realizar la conjugación en un solo paso de las nanopartículas LXY 30 HEV y la etiqueta fluorescente Cy5.5, primero mezcle las nanopartículas vinculadas a LXY 30 a un miligramo por mililitro con un volumen igual de etiqueta fluorescente Cy5.5 para hacer una proporción de uno a cinco molares.

Después de hacer reaccionar la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados, retire el Cy5.5 NHS no unido con un procedimiento de columna de desalinización por centrifugación de acuerdo con el protocolo del fabricante. Mantenga las nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 a cuatro grados centígrados. Se intentaron dos métodos para la funcionalización LXY 30 de nanopartículas HEV para la diana de células tumorales.

Cuando las nanopartículas HEV 573C se unieron primero a la azida de maleimida, seguidas de una reacción química de clic al alquino LXY 30, las nanopartículas HEV 573C parecieron desensamblarse bajo la observación de TEM. Sin embargo, una reacción química inicial entre el alquino LXY 30 y la azida de maleimida para formar LXY 30 unido a maleimida, seguida de conjugación para ayudar a las nanopartículas HEV modificadas, no afectó su estructura y las nanopartículas HEV 573C permanecieron intactas. Las nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 y Cy5.5 se aplicaron a células de cáncer de mama cultivadas y se observaron mediante microscopía confocal.

Las imágenes de fluorescencia del infrarrojo cercano mediante microscopía confocal indican que las nanopartículas HEV ligadas a LXY 30 Cy5.5 tenían una mayor afinidad de unión para una mayor internalización en las células de cáncer de mama MDA MB 231 en comparación con las nanopartículas HEV unidas a Cy5.5. Las implicaciones de esta técnica se extienden hacia el examen de moléculas terapéuticas y de diana multimodal que permiten una diana y un diagnóstico precisos del tumor sin causar daño a las células normales. Aunque este método puede proporcionar información sobre el cáncer y la focalización tumoral a través de la modulación química de la superficie, se puede aplicar al diagnóstico temprano del cáncer, la detección y el tratamiento guiado por imágenes.