Name: Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a cuantificar simultáneamente niveles de ROS intracelulares y morfofunción mitocondrial en células adherentes mediante microscopía de alto contenido. Este método establece huellas redox robustas para estudiar estrés oxidativo y salud celular.

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Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Amberes (TTBOF/29267, TTBOF/30112), el Fondo Especial de Investigación de la Universidad de Gante (proyecto BOF/11267/09), NB-Photonics (código de proyecto 01-MR0110) y la iniciativa CSBR (Centros de Investigación en Biología de Sistemas) de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO; No: CSBR09/013V). Partes de este manuscrito han sido adaptadas de otra publicación1, con permiso de Springer. Los autores agradecen a Geert Meesen por su ayuda con el microscopio de campo amplio.

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<li>Iannetti, E. F., Smeitink, J. A. M., Beyrath, J., Willems, P. H. G. M., Koopman, W. J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-content+analysis+of+mitochondrial+morphofunction+using+live-cell+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-content analysis of mitochondrial morphofunction using live-cell microscopy.</a> Nat Protoc. 11 (9), 1693-1710 (2016).</li>
<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
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<li>Black, C. B., Duensing, T. D., Trinkle, L. S., Dunlay, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-Based+Screening+Using+High-Throughput+Flow+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Assay+Drug+Dev+Technol%22%5BJournal%5D)">Cell-Based Screening Using High-Throughput Flow Cytometry.</a> Assay Drug Dev Technol. 9 (1), 13-20 (2011).</li>
</ol>

Los autores afirman que no hay intereses financieros en competencia ni otros conflictos de intereses. El autor correspondiente también asegura que a todos los autores se les ha pedido que revelen todos y cada uno de los conflictos de interés.

Este artículo describe un método de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS y morfofonción mitocondrial en NHDF. Su desempeño se demostró con un estudio de caso sobre NHDF tratado con SQV. Los resultados apoyan la evidencia anterior de la literatura en la que se han observado niveles elevados de ROS o disfunción mitocondrial después del tratamiento con inhibidores de la proteasa del VIH de tipo 1, aunque en experimentos separados 19 <su...

<html> La concentración de ROS intracelular se regula meticulosamente a través de una interacción dinámica entre la producción de ROS y ROS sistemas de desactivación. El desequilibrio entre los dos provoca un estado de estrés oxidativo. Entre las principales fuentes de ROS están las mitocondrias 1 . Dado su papel en la respiración celular, son responsables de la mayor parte de las moléculas de superóxido intracelular (O 2 • - ) 2 . Esto se debe principalmente a la fuga de electrones a O 2 en el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones bajo condiciones de fuerte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), es decir , hiperpolarización mitocondrial. Por otra parte, la despolarización mitocondrial también se ha correlacionado con una mayor producción de ROS apuntando a múltiples modos de acción 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Además, a través de modificaciones redox en las proteínas de la fisión-fusión maquinaria, ROS co-regular la morfología mitocondrial 9. Por ejemplo, la fragmentación se correlaciona con el aumento de la producción de ROS y apoptosis [ 10 , 11] , mientras que las mitocondrias filamentosas se han vinculado a la inanición de nutrientes y protección contra Mitófago 12 . Dada la intrincada relación entre el ROS celular y la morfofunción mitocondrial, ambos deberían idealmente ser cuantificados simultáneamente en células vivas. Para ello, se desarrolló un ensayo de imagen de alto contenido basado en microscopía automatizada de campo ancho y análisis de imágenes de cultivos celulares adherentes teñidos con las sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (mitocondrial Δψ m y morfología). Imágenes de alto contenido se refiere a la extracción de spAtiotemporally rico ( es decir , un gran número de características descriptivas) información sobre fenotipos celulares utilizando múltiples marcadores complementarios y análisis de imagen automatizada. Cuando se combinan con microscopía automatizada, muchas muestras pueden ser examinadas en paralelo ( es decir, de alto rendimiento), aumentando así el poder estadístico del ensayo. De hecho, un activo principal del protocolo es que permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros en la misma célula, y esto para un gran número de células y condiciones. El protocolo se divide en 8 partes (descritas en detalle en el siguiente protocolo): 1) siembra de células en una placa de 96 pocillos; 2) Preparación de soluciones madre, soluciones de trabajo y tampón de formación de imágenes; 3) Montaje del microscopio; 4) Carga de las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM; 5) Primer ciclo de imágenes en vivo para medir los niveles basales de ROS y la morfofunción mitocondrial; 6) Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir los niveles de ROS inducidos; 7) Análisis automatizado de imágenes; 8) Análisis de Datos, Control de Calidad y Visualización. El ensayo se desarrolló originalmente para fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Dado que estas células son grandes y planos, que son muy adecuados para la evaluación de la morfología mitocondrial en 2D imágenes widefield [ 13 , 14] . Sin embargo, con modificaciones menores, este método es aplicable a otros tipos de células adherentes. Por otra parte, junto a la combinación de CM-H 2 DCFDA y TMRM, el flujo de trabajo cumple con una variedad de pares de tintes fluorescentes con diferentes especificidades moleculares [ 1 , 15] .

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></</td>tetrametilrodamina fuerte, éster >metílico<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (indicador general de estrés oxidativo)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-Pocillos Fondo de Vidrio MicroPlato 630 &micro; L-Negro 0.17 mm Tapa de vidrio bajo</td><td>Brooks sistemas de ciencias de la vida</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin Rojo Fenol 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa con L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina buferizada con fosfato (PBS) sin Ca y Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-verseno (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Anticuerpo utilizado para la adquisición de imágenes de campo plano</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Anticuerpo utilizado para la adquisición de imágenes de campo plano</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipo</td>Microscopio de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>campo amplio Nikon Ti eclipse</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Basado en hardware de Nikon</td><td></td><td> sistema de enfoque automático</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objetivo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 con módulo JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Este software se utiliza para dirigir el microscopio y programar/realizar la adquisición automática de imágenes prototocol</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Versión 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Versión 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R versión 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

perfilado redox celular utilizando microscopía de alto contenido

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.

El ensayo se ha comparado utilizando varios experimentos de control, cuyos resultados se describen en Sieprath et al. 1 . En resumen, se ha cuantificado la respuesta de fluorescencia de CM-H 2 DCFDA y TMRM a cambios inducidos por extrano en ROS intracelular y Δψ m respectivamente para determinar el rango dinámico. Para CM-H 2 DCFDA, el NHDF mostró un incremento lineal en la señal de fluorescencia cuando se trató con concen...

Este trabajo presenta un flujo de trabajo de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles de ROS intracelular, así como el potencial de membrana mitocondrial y la morfología -conocidas conjuntamente como morfofonción mitocondrial- en células adherentes vivas utilizando las moléculas reportero fluorescentes permeantes a las células 5- 6) - clorometil - 2 &#39;, 7&#39; - diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM - H _ { 2 } DCFDA) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

El objetivo general de este técnica basada en microscopía de alto contenido es cuantificar simultáneamente la morfofunción mitocondrial y los niveles celulares de especies reactivas de oxígeno, con el fin de establecer una huella dactilar redox robusta para líneas celulares expuestas a diferentes perturbaciones experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología redox, como si las condiciones patógenas o los tratamientos con compuestos provocan estrés oxidativo, y en qué medida se ven afectadas la forma y función mitocondriales. La principal ventaja de esta técnica es que todos los parámetros pueden medirse dentro de la misma célula al mismo tiempo.Para comenzar el procedimiento, siembre entre ocho y 10.000 fibroblastos dérmicos humanos en los 60 pozos internos de una placa negra de 96 pozos con fondo de poliestireno continuo delgado o de vidrio. Cuando se utilicen diferentes condiciones, tratamientos o líneas celulares, distribuya sus ubicaciones de siembra de forma homogénea en la placa para minimizar los efectos de placa. Luego, siembre además entre ocho y 10.000 células en el pozo B01 para su uso en el ajuste de enfoque.Posteriormente, llene los poz

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Nivel de especies reactivas del oxígeno se eleva cuando las células encuentran condiciones de estrés. Aquí se muestra el ejemplo de la tinción Diaminobencidina 3'-3 ', así como el etiquetado cysTMT y espectrometría de masas para perfilar el proteoma redox...

Creación de perfiles proteoma redox tiol Uso del etiquetado de espectrometría de masas

Fuente: Katsalifis, A., et al. Imágenes en vivo del estado redox del glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador radiométrico. J. Vis. Exp. (2021)Este video demuestra la imagen del estado redox mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador fluorescente radiométrico. Mediante la aplicación de dos longitudes de onda de excitación bajo un microscopio de fluorescencia, se mide la relación de intensidad de fluorescencia para evaluar la oxidación mitocondrial. El...

Imágenes del estado redox mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador radiométrico

Este manuscrito describe el uso de reporteros fluorógenos genéticamente codificados en una aplicación de imágenes de células vivas para el examen de estrés oxidativo inducido por xenobióticos. Este enfoque experimental ofrece inigualable resolución espaciotemporal, la sensibilidad y especificidad evitando muchas de las deficiencias de los métodos convencionales usados para la detección de estrés oxidativo toxicológica.

Enfoques de evaluación de estrés oxidativo toxicológico mediante sensores codificados genéticamente fluorógenos la proyección de imagen

Aquí, presentamos un protocolo para detectar especies totales de oxígeno reactivo celular (ROS) usando 2',7'-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA). Este método puede visualizar la localización de ROS celular en células adherentes con un microscopio de fluorescencia y cuantificar la intensidad ROS con un lector de placas de fluorescencia. Este protocolo es simple, eficiente y rentable.

Detección de especies totales reactivas de oxígeno en células adherentes por 2',7'-Dichlorodihydrofluorescein Diacetate Staining

Este protocolo describe la evaluación del estado redox subcelular específico del compartimento dentro de la célula. Una sonda fluorescente sensible al redox permite un análisis ratiométrico conveniente en las células intactas.

Evaluación de la oxidación celular utilizando una proteína fluorescente verde sensible al redox específica del compartimento subcelular

Describimos protocolos para medir el pH, los eventos oxidativos y la digestión de proteínas en macropinosomas individuales en células vivas. Se hace hincapié en la microscopía ratiométrica de fluoróforos duales y las ventajas que ofrece sobre las técnicas basadas en la población.

Medición del pH, las químicas redox y la capacidad degradativa de los macropinosomas mediante microscopía ratiométrica de fluoróforo dual

Este artículo describe un protocolo para determinar las diferencias en el estado redox basal y las respuestas redox a las perturbaciones agudas en las neuronas primarias del hipocampo y cortical utilizando microscopía viva confocal. El protocolo se puede aplicar a otros tipos de células y microscopios con modificaciones mínimas.

Imágenes en vivo del estado redox de glutatión mitocondrial en neuronas primarias utilizando un indicador ratiométrico

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Aquí, proponemos un protocolo sistematizado, accesible y reproducible para detectar especies reactivas celulares de oxígeno (ROS) utilizando una sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína (DCFH-DA) en células gliales de Müller (MGC). Este método cuantifica los niveles totales de ROS celulares con un citómetro de flujo. Este protocolo es muy fácil de usar, adecuado y reproducible.

Cuantificación de especies reactivas de oxígeno utilizando sonda de dicacetato de 2′,7′-diclorofluoresceína y citometría de flujo en células gliales de Müller

Este protocolo describe un método novedoso para cuantificar las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares utilizando dihidroetidio (DHE) como sonda de colorante de fluorescencia utilizando un enfoque de cribado de alto rendimiento. El protocolo describe los métodos para la evaluación cuantitativa de las especies reactivas de oxígeno (ROS) intracelulares en las tres líneas celulares diferentes de carcinoma hepatocelular.

Evaluación de cribado de alto rendimiento de la generación de especies reactivas de oxígeno (ROS) mediante colorante de fluorescencia de dihidroetidio (DHE)

Utilizando una plataforma multimodal que combina modalidades de imágenes ópticas sin etiquetas, hemos desarrollado un protocolo para visualizar y cuantificar la dinámica y el metabolismo celular. A través de imágenes a través de fluorescencia multifotónica, generación de segundos armónicos y microscopía de dispersión Raman estimulada, podemos generar una visión holística del entorno celular y molecular.

Plataforma de imagen óptica multimodal para el estudio del metabolismo celular

Aprende a cuantificar simultáneamente niveles de ROS intracelulares y morfofunción mitocondrial en células adherentes mediante microscopía de alto contenido. Este método establece huellas redox robustas para estudiar estrés oxidativo y salud celular.

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