Name: Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Aprende a cuantificar simultáneamente niveles de ROS intracelulares y morfofunción mitocondrial en células adherentes mediante microscopía de alto contenido. Este método establece huellas redox robustas para estudiar estrés oxidativo y salud celular.

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Esta investigación fue apoyada por la Universidad de Amberes (TTBOF/29267, TTBOF/30112), el Fondo Especial de Investigación de la Universidad de Gante (proyecto BOF/11267/09), NB-Photonics (código de proyecto 01-MR0110) y la iniciativa CSBR (Centros de Investigación en Biología de Sistemas) de la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO; No: CSBR09/013V). Partes de este manuscrito han sido adaptadas de otra publicación1, con permiso de Springer. Los autores agradecen a Geert Meesen por su ayuda con el microscopio de campo amplio.

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<li>Sieprath, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sustained+accumulation+of+prelamin+A+and+depletion+of+lamin+A%2FC+both+cause+oxidative+stress+and+mitochondrial+dysfunction+but+induce+different+cell+fates%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Sustained accumulation of prelamin A and depletion of lamin A/C both cause oxidative stress and mitochondrial dysfunction but induce different cell fates.</a> Nucleus. 6 (3), 236-246 (2015).</li>
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</ol>

Los autores afirman que no hay intereses financieros en competencia ni otros conflictos de intereses. El autor correspondiente también asegura que a todos los autores se les ha pedido que revelen todos y cada uno de los conflictos de interés.

Este artículo describe un método de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS y morfofonción mitocondrial en NHDF. Su desempeño se demostró con un estudio de caso sobre NHDF tratado con SQV. Los resultados apoyan la evidencia anterior de la literatura en la que se han observado niveles elevados de ROS o disfunción mitocondrial después del tratamiento con inhibidores de la proteasa del VIH de tipo 1, aunque en experimentos separados 19 <su...

<html> La concentración de ROS intracelular se regula meticulosamente a través de una interacción dinámica entre la producción de ROS y ROS sistemas de desactivación. El desequilibrio entre los dos provoca un estado de estrés oxidativo. Entre las principales fuentes de ROS están las mitocondrias 1 . Dado su papel en la respiración celular, son responsables de la mayor parte de las moléculas de superóxido intracelular (O 2 • - ) 2 . Esto se debe principalmente a la fuga de electrones a O 2 en el complejo 1 de la cadena de transporte de electrones bajo condiciones de fuerte potencial negativo interno de membrana mitocondrial (Δψ m ), es decir , hiperpolarización mitocondrial. Por otra parte, la despolarización mitocondrial también se ha correlacionado con una mayor producción de ROS apuntando a múltiples modos de acción 3 , 4 , 5 ,&gt; 6 , 7 , 8 . Además, a través de modificaciones redox en las proteínas de la fisión-fusión maquinaria, ROS co-regular la morfología mitocondrial 9. Por ejemplo, la fragmentación se correlaciona con el aumento de la producción de ROS y apoptosis [ 10 , 11] , mientras que las mitocondrias filamentosas se han vinculado a la inanición de nutrientes y protección contra Mitófago 12 . Dada la intrincada relación entre el ROS celular y la morfofunción mitocondrial, ambos deberían idealmente ser cuantificados simultáneamente en células vivas. Para ello, se desarrolló un ensayo de imagen de alto contenido basado en microscopía automatizada de campo ancho y análisis de imágenes de cultivos celulares adherentes teñidos con las sondas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (mitocondrial Δψ m y morfología). Imágenes de alto contenido se refiere a la extracción de spAtiotemporally rico ( es decir , un gran número de características descriptivas) información sobre fenotipos celulares utilizando múltiples marcadores complementarios y análisis de imagen automatizada. Cuando se combinan con microscopía automatizada, muchas muestras pueden ser examinadas en paralelo ( es decir, de alto rendimiento), aumentando así el poder estadístico del ensayo. De hecho, un activo principal del protocolo es que permite la cuantificación simultánea de múltiples parámetros en la misma célula, y esto para un gran número de células y condiciones. El protocolo se divide en 8 partes (descritas en detalle en el siguiente protocolo): 1) siembra de células en una placa de 96 pocillos; 2) Preparación de soluciones madre, soluciones de trabajo y tampón de formación de imágenes; 3) Montaje del microscopio; 4) Carga de las células con DCFDA CM-H 2 y TMRM; 5) Primer ciclo de imágenes en vivo para medir los niveles basales de ROS y la morfofunción mitocondrial; 6) Segunda ronda de imágenes en vivo después de la adición de terc -butilPeróxido (TBHP) para medir los niveles de ROS inducidos; 7) Análisis automatizado de imágenes; 8) Análisis de Datos, Control de Calidad y Visualización. El ensayo se desarrolló originalmente para fibroblastos dérmicos humanos normales (NHDF). Dado que estas células son grandes y planos, que son muy adecuados para la evaluación de la morfología mitocondrial en 2D imágenes widefield [ 13 , 14] . Sin embargo, con modificaciones menores, este método es aplicable a otros tipos de células adherentes. Por otra parte, junto a la combinación de CM-H 2 DCFDA y TMRM, el flujo de trabajo cumple con una variedad de pares de tintes fluorescentes con diferentes especificidades moleculares [ 1 , 15] .

<table><tbody><tr><td><reactivos fuertes></</td>tetrametilrodamina fuerte, éster >metílico<td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>, perclorato (TMRM)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T668</td><td></td></tr><tr><td>CM-H2DCFDA (indicador general de estrés oxidativo)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C6827</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma)Aldrich</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>MatriPlate 96-Pocillos Fondo de Vidrio MicroPlato 630 &micro; L-Negro 0.17 mm Tapa de vidrio bajo</td><td>Brooks sistemas de ciencias de la vida</td><td>MGB096-1-2-LG-L</td><td></td></tr><tr><td>HBSS sin Rojo Fenol 500 mL</td><td>Lonza</td><td>BE10-527F</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa con L-glutamina</td><td>Lonza</td><td>BE12-604F</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina buferizada con fosfato (PBS) sin Ca y Mg</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td></td></tr><tr><td>HEPES 1 M 500 mL</td><td>Lonza</td><td>17-737F</td><td></td></tr><tr><td>Solución de tripsina-verseno (EDTA)</td><td>Lonza</td><td>BE17-161E</td><td></td></tr><tr><td>Cy3 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-166-152</td><td>Anticuerpo utilizado para la adquisición de imágenes de campo plano</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure F(ab')2 Fragmento Burro Anti-Conejo IgG (H+L)</td><td>Jackson</td><td>711-546-152</td><td>Anticuerpo utilizado para la adquisición de imágenes de campo plano</td></tr><tr><td>Nombre</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</strong</td></tr><tr><td>>Equipo</td>Microscopio de <td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>campo amplio Nikon Ti eclipse</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Perfect Focus System (PFS)</td><td>Basado en hardware de Nikon</td><td></td><td> sistema de enfoque automático</td></tr><tr><td>CFI Plan Apo Lambda 20X objetivo</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentarios</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Elelements Advanced Research 4.5 con módulo JOBS</td><td>Nikon</td><td></td><td>Este software se utiliza para dirigir el microscopio y programar/realizar la adquisición automática de imágenes prototocol</td></tr><tr><td>ImageJ (FIJI) Versión 2.0.0-rc-43/1.50g</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>RStudio Versión 1.0.44</td><td>Rstudio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>R versión 3.3.2</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

perfilado redox celular utilizando microscopía de alto contenido

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Las especies de oxígeno reactivo (ROS) regulan los procesos celulares esenciales incluyendo la expresión génica, la migración, la diferenciación y la proliferación. Sin embargo, los niveles excesivos de ROS inducen un estado de estrés oxidativo, que se acompaña de daño oxidativo irreversible al ADN, lípidos y proteínas. Por lo tanto, la cuantificación de ROS proporciona un proxy directo para la condición de salud celular. Dado que las mitocondrias están entre las principales fuentes celulares y objetivos de ROS, el análisis conjunto de la función mitocondrial y la producción de ROS en las mismas células es crucial para comprender mejor la interconexión en condiciones fisiopatológicas. Por lo tanto, se desarrolló una estrategia basada en la microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles intracelulares de ROS, el potencial de membrana mitocondrial (ΔΨ m ) y la morfología mitocondrial. Se basa en microscopía de fluorescencia de campo ancho automatizada y análisis de imágenes de células adherentes vivas, crecidas en placas de pocillos múltiples, y staineD con las moléculas fluorescentes CM-H 2 DCFDA (ROS) y TMRM (ΔΨm y morfología mitocondrial) permeables a las células. En contraste con la fluorimetría o la citometría de flujo, esta estrategia permite cuantificar los parámetros subcelulares a nivel de la célula individual con alta resolución espacio-temporal, tanto antes como después de la estimulación experimental. Es importante destacar que la naturaleza basada en imágenes del método permite extraer parámetros morfológicos además de intensidades de señal. El conjunto combinado de características se utiliza para el análisis exploratorio y estadístico de datos multivariados para detectar diferencias entre subpoblaciones, tipos de células y / o tratamientos. Aquí, se proporciona una descripción detallada del ensayo, junto con un ejemplo de experimento que demuestra su potencial para la discriminación inequívoca entre los estados celulares después de la perturbación química.

El ensayo se ha comparado utilizando varios experimentos de control, cuyos resultados se describen en Sieprath et al. 1 . En resumen, se ha cuantificado la respuesta de fluorescencia de CM-H 2 DCFDA y TMRM a cambios inducidos por extrano en ROS intracelular y Δψ m respectivamente para determinar el rango dinámico. Para CM-H 2 DCFDA, el NHDF mostró un incremento lineal en la señal de fluorescencia cuando se trató con concen...

Este trabajo presenta un flujo de trabajo de microscopía de alto contenido para la cuantificación simultánea de los niveles de ROS intracelular, así como el potencial de membrana mitocondrial y la morfología -conocidas conjuntamente como morfofonción mitocondrial- en células adherentes vivas utilizando las moléculas reportero fluorescentes permeantes a las células 5- 6) - clorometil - 2 &#39;, 7&#39; - diclorodihidrofluoresceína, éster acetilico (CM - H _ { 2 } DCFDA) y éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM).

Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

El objetivo general de este técnica basada en microscopía de alto contenido es cuantificar simultáneamente la morfofunción mitocondrial y los niveles celulares de especies reactivas de oxígeno, con el fin de establecer una huella dactilar redox robusta para líneas celulares expuestas a diferentes perturbaciones experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología redox, como si las condiciones patógenas o los tratamientos con compuestos provocan estrés oxidativo, y en qué medida se ven afectadas la forma y función mitocondriales. La principal ventaja de esta técnica es que todos los parámetros pueden medirse dentro de la misma célula al mismo tiempo.Para comenzar el procedimiento, siembre entre ocho y 10.000 fibroblastos dérmicos humanos en los 60 pozos internos de una placa negra de 96 pozos con fondo de poliestireno continuo delgado o de vidrio. Cuando se utilicen diferentes condiciones, tratamientos o líneas celulares, distribuya sus ubicaciones de siembra de forma homogénea en la placa para minimizar los efectos de placa. Luego, siembre además entre ocho y 10.000 células en el pozo B01 para su uso en el ajuste de enfoque.Posteriormente, llene los pozos externos vacíos con medio para minimizar los gradientes entre los pozos y el entorno. Toque suavemente la placa tres veces antes de colocarla nuevamente en el incubador para evitar que las células crezcan en parches. Incube las células durante 24 horas, o hasta que alcancen una confluencia del 70 %.A continuación, guarde la información del tratamiento para el experimento en una hoja de cálculo llamada setup. Para configurar el microscopio, primero calibre el escenario XY utilizando el software. Luego, cree un protocolo de adquisición de imágenes para una placa de múltiples pocillos utilizando el software de adquisición.Este protocolo permite la adquisición automática de posiciones establecidas y pozos seleccionados de una placa de 96 pozos. Ahora, seleccione el tipo correcto de placa de múltiples pozos de una lista de placas disponibles proporcionada dentro del software. Alternativamente, defina el formato de la placa de múltiples pozos utilizando las dimensiones de la placa y de los pozos.Luego, alinee la placa de pocillos definiendo dos esquinas de los cuatro pocillos en las esquinas externas. A continuación, seleccione los pocillos que deben adquirirse y defina un protocolo de adquisición que consista en una adquisición secuencial de longitudes de onda. Asegúrese de que el canal GFP se configure primero.A continuación, defina un bucle de placa de pocillos para adquirir cuatro imágenes espaciadas regularmente y sin superposición, posicionadas alrededor del centro de cada pocillo seleccionado, utilizando el protocolo de adquisición definido. En este paso, prepare la solución de tinción para 60 pocillos añadiendo las soluciones stock de CM-H2DCFDA y TMRM al tampón HBSS HEPES. A continuación, deseche el medio de cultivo de las células volteando la placa boca abajo en un único movimiento fluido.Lave suavemente las células dos veces con tampón HH. No olvide el pocillo A01 con las células utilizadas para el ajuste de enfoque. Deseche el tampón HH entre los pasos de lavado.Luego, cargue las células con CM-H2DCFDA y TMRM agregando 100 microlitros de la solución de tinción a cada pocillo. Nuevamente, no olvide el pocillo A01. Incube las células durante 25 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.Después de 25 minutos, lave las células dos veces con 100 microlitros de tampón HH y agregue 100 microlitros de tampón HH a todos los 60 pozos internos. Para realizar la medición real, coloque la placa en el microscopio. Luego, encienda el sistema de enfoque automático basado en hardware y ajuste el desplazamiento del enfoque automático utilizando el pozo B01 y el canal TMRM hasta obtener una imagen nítida.Posteriormente, ejecute el protocolo de adquisición de imágenes. El conjunto de datos de imágenes resultante proporcionará información sobre los niveles basales de ERO, el potencial de membrana mitocondrial y la morfología mitocondrial. A continuación, para medir los niveles inducidos de ERO, retire cuidadosamente la placa de 96 pocillos del microscopio.Añada 100 microlitros de solución de TBHP a 40 micromolar a cada pocillo y espere al menos tres minutos para permitir la reacción completa del TBHP con el CM-H2DCFDA. Durante este tiempo, añada 100 microlitros de la solución de trabajo del anticuerpo al pocillo A01. Ahora, coloque nuevamente la placa en el microscopio y verifique el enfoque utilizando el pocillo B01.A continuación, adquiera las mismas posiciones que en la primera ronda de imágenes utilizando el mismo protocolo de adquisición. El conjunto de datos de imagen resultante proporcionará información sobre los niveles de ERO inducidos. A continuación, adquiera imágenes de campo plano en el pocillo A01.Asegúrese de que las señales estén bien dentro del rango dinámico. Ajustando la configuración de adquisición. Posteriormente, exporte los conjuntos de datos adquiridos en una sola carpeta como archivos TIFF individuales utilizando una nomenclatura estandarizada.Esto incluye la referencia a la placa, antes o después del tratamiento con TBHP, pocillo, campo y canal separados por guiones bajos. Además, guarde las imágenes de campo plano en la misma carpeta como archivos TIFF individuales utilizando la nomenclatura estandarizada. En este paso, abra el software de procesamiento de imágenes e instale el conjunto de macros de métricas redox.A continuación, abra la interfaz de configuración para establecer los ajustes de análisis haciendo clic en el botón S. Seleccione el tipo de imagen, el número de canales y la poceta utilizada para adquirir las imágenes del campo plano. Después, indique qué canal contiene células o mitocondrias.Marque las casillas "Fondo" y "Mejora" para realizar la sustracción del fondo y la ecualización adaptativa del histograma con límite de contraste, respectivamente. A continuación, defina un valor sigma para el suavizado gaussiano de las células y la mejora laplaciana de las mitocondrias. Seleccione un algoritmo automático de umbralización y complete los límites de exclusión de tamaño.Luego, pruebe la configuración de segmentación en algunas imágenes seleccionadas de los conjuntos de datos adquiridos abriéndolas y haciendo clic en los botones C o M del menú para la segmentación de células o mitocondrias, respectivamente. A continuación, realice el análisis por lotes en la carpeta de interés haciendo clic en el botón de almohadilla y seleccionando la carpeta con las imágenes. Verifique la configuración y presione aceptar.Después del análisis por lotes, verifique visualmente el rendimiento de la segmentación en una pila de verificación haciendo clic en el botón V y seleccionando la carpeta con las imágenes. Recorra la pila de verificación para confirmar si la segmentación fue exitosa. El análisis inicial de los datos extraídos se realiza automáticamente con una aplicación Shiny complementaria.Esto permite una interpretación rápida de los resultados. Para comenzar, abra la aplicación en R Studio. Elija ejecutarla en un navegador externo.En la página de entrada, seleccione el directorio donde se encuentran los archivos de resultados. Asegúrese de que el archivo de configuración también esté presente en este directorio. Los archivos de resultados y la información de configuración se importan, compilan y visualizan automáticamente.La página de configuración del experimento muestra la distribución del experimento. La siguiente página muestra los niveles de ERO, así como varios parámetros mitocondriales para cada placa por separado. Seleccione la placa que desea visualizar utilizando el menú desplegable.Los datos se muestran en un formato de placa de múltiples pocillos, así como en gráficos de caja con valores atípicos etiquetados con el número del pocillo y de la imagen. La página de resultados del experimento completo muestra los resultados normalizados de todas las placas combinadas, junto con un análisis estadístico básico. Si se proporciona un archivo de exclusión mediante la página de entrada, se excluirán los puntos de datos especificados.En la página de análisis de agrupamiento, se compone un perfil redox sensible mediante un análisis de componentes principales sobre datos de cinco parámetros. Finalmente, la página de descarga de datos permite guardar los datos procesados y reorganizados para su uso posterior. Aquí se muestran los resultados de un experimento en el que fibroblastos dérmicos humanos fueron tratados con el inhibidor de la proteasa del VIH Saquinavir.Mediante el protocolo descrito, se detectó un aumento significativo tanto en los niveles basales como en los inducidos de ERO. En comparación con las células control, tratadas con DMSO. La saquinavir también afectó significativamente la morfofunción mitocondrial.El potencial de la membrana mitocondrial, medido como la señal promedio de TMRM por píxel mitocondrial, aumentó significativamente. Además, las mitocondrias adquirieron un patrón altamente fragmentado, indicado cuantitativamente por una mayor circularidad y un tamaño promedio más pequeño de las mitocondrias individuales. Al combinar los parámetros mencionados anteriormente mediante análisis de componentes principales, tanto el control como las condiciones con Saquinavir pudieron separarse claramente entre sí por sus huellas redox.Al realizar este procedimiento, es importante recordar que la iluminación en sí provoca estrés oxidativo. Por lo tanto, las condiciones de exposición deben minimizarse y mantenerse constantes durante todo el experimento. Una vez dominado, se pueden teñir y adquirir hasta 20 placas de 96 pocillos en un solo día.Después de la segunda ronda de imágenes, las células pueden fijarse y utilizarse para una tinción inmunofluorescente posterior. Esto aumenta el número de parámetros medidos en las mismas células exactas y permite responder preguntas adicionales. Después de ver este video, debería ser capaz de realizar mediciones combinadas de ERO y morfofunción mitocondrial en cultivos celulares adherentes utilizando microscopía de alto contenido.

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Biología

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