Perfilado Redox Celular Utilizando Microscopía de Alto Contenido

El objetivo general de este método basado en microscopía de alto contenido es cuantificar simultáneamente la morfofunción mitocondrial y los niveles celulares de especies reactivas de oxígeno para establecer una huella digital redox robusta para líneas celulares expuestas a diferentes perturbaciones experimentales. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en biología redox, como si las condiciones patógenas o los tratamientos compuestos provocan estrés oxidativo, y en qué medida la forma y la función mitocondrial se ven afectadas. La principal ventaja de esta técnica es que todos los parámetros se pueden medir dentro de la misma celda al mismo tiempo.

Para comenzar el procedimiento, siembre de ocho a 10.000 fibroblastos dérmicos humanos en 60 pocillos internos de una placa negra de 96 pocillos con un fondo delgado de poliestireno o vidrio continuo. Cuando utilice diferentes condiciones, tratamientos o líneas celulares, distribuya sus ubicaciones de siembra de manera homogénea en la placa para minimizar los efectos de la placa. A continuación, siembra de ocho a 10.000 células más en el pocillo B01 para utilizarlas en el ajuste del enfoque.

Posteriormente, llene los pozos exteriores vacíos con medio para minimizar los gradientes entre los pozos y el medio ambiente. Golpee suavemente la placa tres veces antes de volver a colocarla en la incubadora para evitar que las células crezcan en parches. Cultive las células durante 24 horas, o hasta que alcancen el 70% de confluencia.

Después, guarde la información del tratamiento para el experimento en una hoja de cálculo llamada configuración. Para configurar el microscopio, primero calibre la etapa XY con el software. A continuación, cree un protocolo de imagen para una placa de pocillos múltiples utilizando el software de adquisición.

Este protocolo permite la adquisición automática de las posiciones establecidas y los pocillos seleccionados de una placa de 96 pocillos. Ahora, seleccione el tipo correcto de placa de pocillos múltiples de una lista de placas disponibles proporcionadas en el software. Como alternativa, defina el formato de placa de pocillos múltiples utilizando las dimensiones de la placa y el pocillo.

A continuación, alinee la placa de pocillos definiendo dos esquinas de los cuatro pocillos de las esquinas exteriores. A continuación, seleccione los pozos que deben adquirirse y defina un protocolo de adquisición que consista en una adquisición secuencial de longitud de onda. Asegúrese de que el canal GFP esté configurado primero.

A continuación, defina un bucle de placa de pocillo para adquirir cuatro imágenes espaciadas regularmente y no superpuestas colocadas alrededor del centro de cada pocillo seleccionado utilizando el protocolo de adquisición definido. En este paso, prepare la solución de tinción para 60 pocillos agregando CM-H2DCFDA y solución madre TMRM al tampón HBSS HEPES. A continuación, deseche el medio de cultivo de las células girando la placa boca abajo con un solo movimiento de fluido.

Lave suavemente las células dos veces con tampón HH. No te olvides de A01 con las celdas utilizadas para el ajuste de enfoque. Deseche el tampón HH entre los pasos de lavado.

A continuación, cargue las células con CM-H2DCFDA y TMRM añadiendo 100 microlitros de la solución de tinción a cada pocillo. De nuevo, no te olvides de A01. Incubar las células durante 25 minutos en la oscuridad a temperatura ambiente.

Después de 25 minutos, lave las celdas dos veces con 100 microlitros de tampón HH y agregue 100 microlitros de tampón HH a los 60 pocillos internos. Para realizar la medición real, instale la placa en el microscopio. Luego, encienda el sistema de enfoque automático basado en hardware y ajuste el desplazamiento del enfoque automático usando el pozo B01 y el canal TMRM hasta que tenga una imagen nítida.

A continuación, ejecute el protocolo de imágenes. El conjunto de datos de imágenes resultante proporcionará información sobre los niveles basales de ROS, el potencial de membrana mitocondrial y la morfología mitocondrial. A continuación, para medir los niveles de ROS inducidos, retire con cuidado la placa de 96 pocillos del microscopio.

Agregue 100 microlitros de solución de TBHP a 40 micromolares a cada pocillo y espere al menos tres minutos para permitir la reacción completa del TBHP con el CM-H2DCFDA. Durante este tiempo, agregue 100 microlitros de la solución de trabajo de anticuerpos al pocillo A01. Ahora, vuelva a montar la placa en el microscopio y vuelva a comprobar el enfoque con el pocillo B01.

A continuación, adquiera las mismas posiciones que en la primera ronda de imágenes utilizando el mismo protocolo de imágenes. El conjunto de datos de imagen resultante proporcionará información sobre los niveles de ROS inducidos. A continuación, adquiera imágenes de campo plano en el pozo A01.

Asegúrese de que las señales estén dentro del rango dinámico. Ajustando la configuración de adquisición. A continuación, exporte los conjuntos de datos adquiridos en una sola carpeta como archivos TIFF individuales utilizando una nomenclatura estandarizada.

Eso incluye la referencia a la placa, el tratamiento antes o después del TBHP, el pozo, el campo y el canal separados por guiones bajos. Además, guarde las imágenes de campo plano en la misma carpeta que los archivos TIFF individuales utilizando la nomenclatura estandarizada. En este paso, abra el software de procesamiento de imágenes e instale el conjunto de macros de métricas redox.

A continuación, abra la interfaz de configuración para establecer la configuración del análisis haciendo clic en el botón S. Seleccione el tipo de imagen, el número de canales y el pozo que se utilizó para adquirir las imágenes de campo plano. Después de eso, indique qué canal contiene células o mitocondrias.

Marque las casillas de verificación de fondo y mejora para realizar la sustracción de fondo y la ecualización de histograma adaptativo con contraste limitado, respectivamente. A continuación, defina un sigma para el gaussiano y el borronado de las células y el realce laplaciano de las mitocondrias. Seleccione un algoritmo de umbral automático y rellene los límites de exclusión de tamaño.

A continuación, pruebe la configuración de segmentación en algunas imágenes seleccionadas de los conjuntos de datos adquiridos abriéndolas y haciendo clic en los botones C o M en el menú de segmentación de células o mitocondrias, respectivamente. A continuación, desde el análisis por lotes en la carpeta de interés haciendo clic en el botón hash y seleccionando la carpeta con las imágenes. Verifique la configuración y presione OK.

Después del análisis por lotes, verifique visualmente el rendimiento de la segmentación en una pila de verificación haciendo clic en el botón V y seleccionando la carpeta con imágenes. Revise la pila de verificación para confirmar si la segmentación se realizó correctamente. El análisis inicial de los datos extraídos se realiza automáticamente con una aplicación Shiny complementaria.

Esto permite una rápida interpretación de los resultados. Para empezar, abra la aplicación en R Studio. Elija ejecutarlo en un navegador externo.

En la página de entrada, seleccione el directorio donde se encuentran los archivos de resultados. Asegúrese de que el archivo de instalación también esté presente en este directorio. Los archivos de resultados y la información de configuración se importan, compilan y visualizan automáticamente.

La página de configuración del experimento muestra el diseño del experimento. La página siguiente muestra los niveles de ROS, así como varios parámetros mitocondriales para cada placa por separado. Seleccione la placa que desea visualizar usando el menú desplegable.

Los datos se muestran en un formato de placa de pocillos múltiples, así como en diagramas de caja con valores atípicos etiquetados con el número de pocillo y la imagen. La página completa del experimento muestra los resultados normalizados de todas las placas combinadas, junto con un análisis estadístico básico. Si se proporciona un archivo de colocación a través de la página de entrada, se excluirán los puntos de datos especificados.

En la página de análisis de clúster, se compone un perfil redox confidencial mediante un componente principal y un análisis de datos de cinco parámetros. Por último, la página de descarga de datos permite guardar los datos procesados y reorganizados para su uso posterior. Aquí se muestran los resultados de un experimento en el que se trataron fibroblastos dérmicos humanos con el inhibidor de la proteasa del VIH Saquinavir.

Utilizando el protocolo descrito, se detectó un aumento significativo tanto para los niveles de ROS basales como para los inducidos. En comparación con las células de control, tratadas con DMSO. El saquinavir también afectó significativamente la morffunción mitocondrial.

El potencial de membrana mitocondrial medido como la señal TMRM promedio por píxel mitocondrial aumentó significativamente. Además, las mitocondrias adquirieron un patrón altamente fragmentado, indicado cuantitativamente por una mayor circularidad y un menor tamaño promedio de las mitocondrias individuales. Al combinar los parámetros antes mencionados mediante el análisis de componentes principales, tanto las condiciones de control como las de Saquinavir podrían estar claramente separadas entre sí por sus huellas dactilares redox.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar que la iluminación en sí misma causa estrés oxidado. Por lo tanto, las condiciones de exposición deben minimizarse y mantenerse constantes durante todo el experimento. Una vez dominado, se pueden teñir y adquirir hasta 20 placas de 96 pocillos en un día.

Después de la segunda ronda de imágenes, las células se pueden fijar y usar para una tinción inmunofluorescente posterior. Esto aumenta el número de parámetros medidos en las mismas celdas y permite responder preguntas adicionales. Después de ver este vídeo, debería ser capaz de realizar las mediciones combinadas de las ROS y la morfunción mitocondrial en cultivos celulares adherentes utilizando microscopía de alto contenido.