Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus

El objetivo general de este procedimiento es emplear la tinción inmunohistoquímica de montaje completo para la visualización de la distribución nerviosa dentro del tracto biliar de Suncus murinus. Este método se puede utilizar para analizar la distribución nerviosa de los órganos viscerales de muchas especies, en particular los órganos irregulares o pequeños que son difíciles de evaluar con métodos estándar. Las principales ventajas de esta técnica son que el funcionamiento es sencillo.

No requiere procedimientos complicados y tiene una alta tasa de éxito. Yidan Dai, un estudiante de posgrado, y Shuang-Qin Yi, un becario de investigación, ambos de mi laboratorio, demostrarán el procedimiento conmigo. Comience enjuagando al animal con PBS individuales y perfusiones de paraformaldehído al 4% en una vitrina de gases.

A continuación, inyecte de dos a tres mililitros de látex de neopreno blanco a través del catéter de perfusión en la aorta abdominal para marcar los vasos sanguíneos. Y cuando todos los tejidos de interés hayan sido marcados, extraiga los órganos abdominales y sus nervios y vasos relacionados. A continuación, inyecte aproximadamente 0,1 mililitros de látex de neopreno azul en la vesícula biliar para etiquetar el sistema biliar y fijar los tejidos en paraformaldehído al 4% durante la noche a cuatro grados centígrados para la inmunotinción de montaje completo.

A la mañana siguiente, transfiera la muestra a un frasco de vidrio durante cuatro lavados a temperatura ambiente de una hora en agua destilada en un nutator. Después del último lavado, incubar los tejidos en ácido ortoperiódico al 1% recién preparado durante 20 minutos a temperatura ambiente para evitar cualquier reacción intrínseca a la peroxidasa. A continuación, lavar la muestra en agua destilada durante 10 minutos a temperatura ambiente, seguido de la incubación en papillón al 0,004% recién preparado durante dos horas en un baño de agua a temperatura constante a 37 grados centígrados con un suave balanceo.

Al final de la incubación, lave la muestra con agua destilada durante 50 a 60 minutos. A continuación, almacene los tejidos en paraformaldehído al 4% a cuatro grados centígrados durante la noche. A la mañana siguiente, lave la muestra en agua destilada como se acaba de demostrar, seguido de otra incubación de dos horas en papillon recién preparado.

Lavar la muestra durante otros 50 a 60 minutos en agua destilada, seguido de una fijación nocturna en paraformaldehído al 4%. A la tercera mañana, lavar los tejidos cuatro veces en agua destilada, seguido de inmersión en tres incubaciones secuenciales ascendentes de sacarosa de 30 minutos. A continuación, congele la muestra a menos 20 grados centígrados durante 30 a 60 minutos, seguido de una descongelación completa a temperatura ambiente.

Después del tercer ciclo de congelación-descongelación, transfiera la muestra a Triton X-100 al 2% para una incubación nocturna de cuatro grados centígrados. A la mañana siguiente, transfiera la muestra a un recipiente del anticuerpo primario de interés para balancearla suavemente sobre el nutator a cuatro grados Celsius durante tres a seis días según el tamaño de la muestra. Después del período de etiquetado adecuado, retire el anticuerpo primario no unido con cuatro lavados de una hora en PBS a temperatura ambiente y etiquete la muestra con el anticuerpo secundario apropiado durante tres días con un balanceo suave a cuatro grados centígrados.

Al final del período de marcaje de anticuerpos secundarios, lave la muestra cuatro veces en PBS. A continuación, incubar los tejidos en 10 microlitros de peróxido de hidrógeno al 30% en 100 mililitros de solución de coloración 0,002%DAB recién preparada a cuatro grados centígrados durante 16 a 72 horas con un suave balanceo. Cuando se haya alcanzado la intensidad óptima de tinción, transfiera la muestra a azida de sodio al 0,04% en PBS para detener la reacción de coloración.

A continuación, sumerja cuidadosamente la muestra en una placa de Petri de 10 centímetros que contenga PBS fresco y capture imágenes de montaje completo de los tejidos utilizando una cámara montada en un microscopio estereoscópico. Además de la visualización de la inervación de la vía biliar extrahepática, el marcaje con anticuerpos contra fibras nerviosas positivas para neurofilamentos también permite la identificación inequívoca de la densidad de funcionamiento y distribución del nervio vago a lo largo del esófago y en el estómago. El marcaje de los vasos sanguíneos de la vesícula biliar con látex de neopreno blanco revela una fibrosis nerviosa delgada en alto contraste con los tejidos circundantes, observándose una mayor densidad de inervación en el cuello de la vesícula biliar que en el fondo de ojo.

En el conducto biliar superior, se etiquetan dos tipos de haces nerviosos, los haces nerviosos finos que forman una red irregular y densa de nervios y corren adhesivos residiendo sobre y dentro del tracto biliar y los haces neurales más gruesos que se distribuyen paralelos a la superficie del tracto biliar. El marcaje del colédoco con látex de neopreno azul y de los vasos con látex de neopreno blanco permite visualizar las finas fibras nerviosas al final del colédoco y la zona de la papila duodenal. Antes de intentar este procedimiento, tenga cuidado de reproducir la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, ya que todo el proceso requiere de dos a tres semanas para completarse.

Para evitar dañar la muestra al cambiar las soluciones, siempre vierta las soluciones en lugar de extraer la muestra con pinzas. Después de ver este video, debería poder aplicar esta técnica al etiquetado de una variedad de nervios dentro de varios órganos viscerales.