Name: Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a usar inmunohistoquímica de montaje completo para visualizar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus. Este método sencillo permite analizar la distribución nerviosa en órganos viscerales pequeños o irregulares con alta tasa de éxito.

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Los autores no tienen reconocimientos.

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad Metropolitana de Tokio (IACUC). Los animales fueron alojados y manejados de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y la Guía para el Cuidado y Uso de Animales Experimentales del Consejo Canadiense de Cuidado de Animales. Utilizamos animales criados y mantenidos en el Laboratorio de Morfología Funcional, Departamento de Ciencias de la Salud Fronteriza, Universidad Metropolitana de Tokio, Japón. 1. Cuidado de Animales y Vivienda <ol><li> Obtener 7 S. murinus (3 hembras y 4 machos pesando 70-90 g) de una colonia de cría cerrada. </li><li> Cage el S. murinus individualmente después del destete (20 d después del nacimiento) en jaulas de plástico equipadas con un nido de madera que contiene tiras de papel. Manténgalos en una sala de animales acondicionado convencionalmente: 23-27 ° C, sin control de humedad, y un ciclo de 12:12 h light: dark. Suministro comercialPellets de trucha y agua ad libitum. </li></ol> 2. Preparación del tejido <ol><li> Para preparar paraformaldehído al 4% (p / v) (PFA), disolver 40 g de PFA en 1.000 ml de solución salina tamponada con fosfato 0,01 M (PBS, pH 7,4). En una campana de humos, mezclar con un vórtice hasta que la solución esté despejada. Guarde el 4% PFA O / N a 4 ° C. Precaución: Use equipo protector personal (PPE) apropiado cuando maneje PFA. </li><li> Para perfundir y fijar el animal, anestesiarlo con éter y luego darle una inyección intraperitoneal de somnopentilo (pentobarbital sódico, 0,6 ml / kg de peso corporal). </li><li> Después de que el animal esté completamente narcotizado, abra la cavidad abdominal con un bisturí, creando una incisión abdominal de línea media de 3 cm de largo. Mientras incisión de la vena cava inferior para exsanguinating, insertar un catéter retrogradely en la aorta abdominal en el nivel inmediatamente por encima de la bifurcación de esta arteria en las arterias ilíacas comunes. </li><li> Inyectar somnopentilo (pentobarbitalDium, 1,0 ml / kg de peso corporal). Después de la eutanasia completa, perfundir con PBS 0,01 M (pH 7,4) y luego con PFA al 4% en una chimenea. </li><li> Después de la perfusión, inyectar 2-3 ml de látex de neopreno blanco (látex de neopreno blanco diluido 3: 2 con agua destilada (DW)) para etiquetar los vasos sanguíneos. </li><li> Extraer los órganos abdominales, incluyendo el hígado, vesícula biliar, conducto biliar común, duodeno y páncreas en bloque, con los nervios y vasos relacionados. </li><li> Inyecte aproximadamente 0,1 ml de látex de neopreno azul (agregue una gota de tinta azul a 10 ml del látex de neopreno blanco diluido) a la vesícula biliar para etiquetar el sistema biliar. </li><li> Post-fijación durante toda la noche con 4% de PFA a 4 ° C para inmunotinción de montaje completo. Precaución: La PFA es tóxica. Evite manipular PFA directamente. La PFA debe utilizarse en una chimenea. </li></ol> 3. Inmunohistoquímica de montaje completo Nota: A lo largo del protocolo, incluyendo durante el lavado, incubación de anticuerpos y coloración,La muestra debe permanecer en el nutator, moviéndose suavemente a RT oa 4 ° C. <ol><li> Día 1: Tratamiento enzimático e inactivación de la peroxidasa endógena potencial <ol><li> Lavar el espécimen preparado con DW 4x durante 1 h cada uno a RT en un vial de vidrio de tamaño apropiado. Balancee el espécimen suavemente en el nutator para quitar el PFA. Evite dañar la muestra al intercambiar soluciones. </li><li> Para preparar ácido ortoperiódico al 1% (p / v), disolver 1 g de ácido ortopiódico en 100 ml de DW. </li><li> Incubar la muestra en ácido oroperiodico al 1% durante 20 min a TA para prevenir cualquier reacción intrínseca a la peroxidasa. </li><li> Preparar 0,004% (p / v) de papaína disolviendo 0,004 g de papaína en 100 ml de tampón Tris-HCl 0,025 mol / L (pH 7,6). </li><li> Lavar la muestra con DW durante 10 minutos a TA. </li><li> Incubar la muestra en papaína recién preparada al 0,004% durante 2 ha 37 ° C en un baño a temperatura constante con balanceo suave. </li><li> Lave la muestra con DW durante 50-60 minutos a TA. </li><li> Guarde la muestra en 4% de PFA a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Día 2: Tratamiento enzimático <ol><li> Lave el espécimen almacenado con DW 4 veces durante 1 h cada vez a RT. </li><li> Incubar la muestra en papaína recién preparada al 0,004% durante 2 ha 37 ° C en un baño a temperatura constante con balanceo suave. </li><li> Lave la muestra con DW durante 50-60 minutos a RT. Guarde la muestra en 4% de PFA a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Día 3: Tratamiento de congelación <ol><li> Lave el espécimen almacenado con DW 4x durante 1 h cada uno a RT, como se indica arriba. </li><li> Preparar una sacarosa al 2,5% (p / v), al 5% (p / v) y al 10% (p / v) disolviendo 2,5 g, 5 gy 10 g de sacarosa respectivamente en 100 ml de PBS 0,01 M PH 7,4). </li><li> Sumergir el espécimen en sacarosa al 2,5% (p / v), 5% (p / v) y 10% (p / v) durante 30 minutos cada uno. </li><li> Congelar la muestra a -20 ° C durante 30 - 60 min y luego descongelar completamente a RT; Repetir el ciclo 3x. </li><li> Parte superiorRepare 2% de Triton X-100 (v / v), agregue 2 mL de Triton X-100 a 100 mL de PBS 0,01 M (pH 7,4). </li><li> Guarde la muestra en Triton X-100 al 2% a 4 ° CO / N. </li></ol></li><li> Día 4: Incubación de anticuerpos primarios <ol><li> Preparar la disolución de dilución del anticuerpo primario disolviendo 0,2 g de albúmina de suero bovino (BSA), 0,3 ml de Triton X-100 y 0,1 g de azida de sodio en 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4). Precaución: La azida sódica es extremadamente tóxica. Se debe evitar la inhalación y el contacto. Use el EPP apropiado. </li><li> Diluir el anticuerpo primario (NFP) 1: 600 en el tampón de dilución anterior (etapa 3.4.1). Incubar la muestra con anticuerpo NFP a 4 ° C durante 3-6 días, manteniendo la muestra suavemente balanceando en el nutator. Los especímenes más grandes requerirán tiempos de incubación aumentados. </li></ol></li><li> Incubación de anticuerpos secundarios <ol><li> Lavar la muestra en PBS 4x durante 1 h cada vez a RT para eliminar el anticuerpo primario no unido. </lI&gt; <li> Preparar la solución de dilución para el anticuerpo secundario disolviendo 0,2 g de BSA y 0,3 ml de Triton X-100 en 100 ml de PBS 0,01 M (pH 7,4). </li><li> Diluir el anticuerpo secundario (conjugado con peroxidasa, IgG anti-ratón IgG-HRP purificado por afinidad) 1: 600 en el tampón de dilución (paso 3.5.2). Incubar la muestra con el anticuerpo secundario a 4 ° C durante 3 días, y mantener la muestra balanceando suavemente en el nutator. </li></ol></li><li> Coloración <ol><li> Preparar la solución de coloración DAB añadiendo 0,002 g de tetrahidrocloruro de 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB) a 100 mL de tampón Tris-HCl 0,05 mol / L (pH 7,6) bajo una campana de humos, manteniendo la solución en la oscuridad. </li><li> Lavar los especímenes a RT en PBS 4x durante 1 h cada uno. </li><li> Añadir 10 μl de H 2 O 2 al 30% en una solución de coloración DAB recién preparada e incubar con la solución a 4 ° CO / N o durante 3 d mientras se balancea suavemente sobre el nutator. </li><li> Detener la reacción por plaCing la muestra en PBS con azida sódica al 0,04% cuando se alcanza la intensidad óptima de tinción. NOTA: Evite el uso de azida de sodio hasta este paso, ya que inhibe la peroxidasa de rábano picante. </li></ol></li><li> Imaging el tejido manchado <ol><li> Transferir con cuidado la muestra a una placa de vidrio petri (5 cm de alto, 10 cm de diámetro) que contenga PBS. Capture imágenes de montaje completo usando una cámara montada en un estereomicroscopio. NOTA: El tejido manchado de toda la superficie debe ser fotografiado mientras se sumerge completamente en PBS en un plato de vidrio transparente. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kuratani, S., Tanaka, S., Ishikawa, Y., Zukeran, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+development+of+the+hypoglossal+nerve+in+the+chick+embryo+as+observed+by+the+whole-mount+nerve+staining+method%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Early development of the hypoglossal nerve in the chick embryo as observed by the whole-mount nerve staining method.</a> Am. J. Anat. 182 (2), 155-168 (1988).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+the+avian+vagus+nerve+with+special+reference+to+the+morphological+innervation+of+heart+and+lung%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol.+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of the avian vagus nerve with special reference to the morphological innervation of heart and lung.</a> Anat. Embryol. (Berl). 182 (5), 435-445 (1990).</li>
<li>Kuratani, S., Tanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peripheral+development+of+avian+trigeminal+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Anat%22%5BJournal%5D)">Peripheral development of avian trigeminal nerves.</a> Am. J. Anat. 187 (1), 65-80 (1990).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. House musk shrew, Suncus murinus: a novel and natural obesity-resistant animal model. Obes. Metab. 6, 22-28 (2010).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surgical+anatomy+of+innervation+of+the+gallbladder+in+humans+and+Suncus+murinus+with+special+reference+to+morphological+understanding+of+gallstone+formation+after+gastrectomy%5BTitle%5D)+AND+%22World+J.+Gastroenterol%22%5BJournal%5D)">Surgical anatomy of innervation of the gallbladder in humans and Suncus murinus with special reference to morphological understanding of gallstone formation after gastrectomy.</a> World J. Gastroenterol. 13 (14), 2066-2071 (2007).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+study+of+the+pancreas+in+the+house+musk+shrew%2C+Suncus+murinus%2C+with+special+reference+to+the+blood+supply+and+innervation%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Rec.+A+Discov.+Mol.+Cell+Evol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Anatomical study of the pancreas in the house musk shrew, Suncus murinus, with special reference to the blood supply and innervation.</a> Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell Evol. Biol. 273 (1), 630-635 (2003).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15782096">Surgical anatomy of the innervation of the major duodenal papilla in humans and Suncus murinus, from the perspective of preserving innervation in organ-saving procedures.</a> Pancreas. 30 (3), 211-217 (2005).</li>
<li>Yi, S. Q., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4087648/">Surgical anatomy of the innervation of the pylorus in humans and Suncus murinus, in relation to the surgical technique for pylorus-preserving pancreatoduodenectomy.</a> World J. Gastroenterol. 12 (14), 2209-2216 (2006).</li>
<li>Yi, S. Q., Ren, K., Kinoshita, M., Takano, N., Itoh, M., Ozaki, N. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26179953">Innervation of Extrahepatic Biliary Tract, With Special Reference to the Direct Bidirectional Neural Connections of the Gall Bladder, Sphincter of Oddi and Duodenum in Suncus murinus, in Whole-Mount Immunohistochemical Study.</a> Anat. Histol. Embryol. 45 (3), 184-188 (2016).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofilament+proteins+in+axonal+regeneration+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Regen.+Res%22%5BJournal%5D)">Neurofilament proteins in axonal regeneration and neurodegenerative diseases.</a> Neural Regen. Res. 7 (8), 620-626 (2012).</li>
<li>Wyatt, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relationship+of+the+sphincter+of+Oddi+to+the+stomach%2C+duodenum+and+gall-bladder%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">The relationship of the sphincter of Oddi to the stomach, duodenum and gall-bladder.</a> J. Physiol. 193 (2), 225-243 (1967).</li>
<li>Mawe, G. M., Kennedy, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duodenal+neurons+provide+nicotinic+fast+synaptic+input+to+sphincter+of+Oddi+neurons+in+guinea+pig%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Duodenal neurons provide nicotinic fast synaptic input to sphincter of Oddi neurons in guinea pig.</a> Am. J. Physiol. 277, G226-G234 (1999).</li>
<li>Seo, J. H., Cho, S. S., Lee, I. S., Lee, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anatomical+and+neuropeptidergic+properties+of+the+duodenal+neurons+projecting+to+the+gallbladder+in+the+golden+hamster%5BTitle%5D)+AND+%22Arch.+Histol.+Cytol%22%5BJournal%5D)">Anatomical and neuropeptidergic properties of the duodenal neurons projecting to the gallbladder in the golden hamster.</a> Arch. Histol. Cytol. 65 (4), 317-321 (2002).</li>
<li>Padbury, R. T., Furness, J. B., Baker, R. A., Toouli, J., Messenger, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projections+of+nerve+cells+from+the+duodenum+to+the+sphincter+of+Oddi+and+gallbladder+of+the+Australian+possum%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Projections of nerve cells from the duodenum to the sphincter of Oddi and gallbladder of the Australian possum.</a> Gastroenterology. 104 (1), 130-136 (1993).</li>
<li>White, J. J., Reeber, S. L., Hawkes, R., Sillitoe, R. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wholemount+immunohistochemistry+for+revealing+complex+brain+topography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Wholemount immunohistochemistry for revealing complex brain topography.</a> J. Vis. Exp. (62), e4042(2012).</li>
</ol>

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Este trabajo describe el procedimiento experimental para la visualización de la inervación del tracto biliar extrahepático utilizando un anticuerpo contra la proteína neurofilamento. Este protocolo fue adaptado a partir del protocolo descrito por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 . Para este experimento, planifique la línea de tiempo para cada uno de los experimentos, ya que el enfoque de tinción de monta...

La musaraña almizcle, Suncus murinus , pertenece a la orden Insectivora y la familia Soricidae. Este diminuto mamífero se distribuye por todo el sudeste asiático y habita en casas y zonas de césped situadas cerca de viviendas humanas o corrales de ganado 4 . Esta especie presenta características morfológicas generales más similares a las humanas que otros animales de laboratorio, como el ratón, la rata y el conejo 5 . Anteriormente, se utilizó inmunotinción de montaje completo con un marcador de neurona periférica para la proteína del neurofilamento de S. murinus (NFP) para marcar los nervios periféricos en el páncreas 6 , la papila duodenal principal 7 , el píloro 8 , la vesícula biliar 5 y el tracto biliar extrahepático 9 . NFP es un complejo macromolecular que forma parte del citoesqueleto neuronal maduro. Proteína relacionada con los neurofilamentosS median las interacciones entre NFP y el zygosome. Tanto la función enzimática como la estructura de las proteínas de unión están reguladas por el NFP 10 . El complejo NFP está compuesto por tres polipéptidos: NF-L (70 kDa), NF-M (150-160 kDa) y NF-H (200 kDa). NFP se puede encontrar en axones neuronales en el sistema nervioso central y periférico. Se ha demostrado que el anticuerpo anti-NFP humano marca los axones del sistema nervioso central y periférico. Las investigaciones anatómicas y electrofisiológicas han demostrado que el esfínter, la vesícula biliar y el tracto gastrointestinal proximal están conectados 11 , 12 , 13 , 14 . Sin embargo, las características morfológicas de sus conexiones neuronales aún no se han definido. Este trabajo demuestra el uso de un método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo para etiquetar la inervación de S. murinus bilCon un anticuerpo NFP.

<table><tbody><tr><td>ácido ortoperiódico</td><td>Wako</td><td>162-00732</td><td></td></tr><tr><td>papaína</td><td>Wako</td><td>164-00172</td><td></td></tr><tr><td>albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Wako</td><td>010-15131</td><td></td></tr><tr><td>azida sódica</td><td>Nacalai Tesque</td><td>312-33</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo de proteína de neurofilamento (NFP)</td><td>Dako</td><td>M0762, lote 089, clon: 2F11</td><td></td></tr><tr><td>conjugado con peroxidasa purificado por afinidad ovejas anti-ratón IgG-HRP</td><td>MBL</td><td>Código 330</td><td></td></tr><tr><td>3,3'-diaminobenzidina tetraclorhidrato (DAB)</td><td>Wako</td><td>349-00903 imidazol</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>I-0125</td><td></td></tr></tbody></table>

uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en<em&gt; suncus murinus</em

Using a Whole-mount Immunohistochemical Method to Study the Innervation of the Biliary Tract in Suncus murinus

Este trabajo describe el método de tinción inmunohistoquímica de montaje completo en detalle, usando anticuerpos de proteína de neurofilamento para marcar la inervación del tracto biliar en Suncus murinus ( S. murinus &#160; ). En primer lugar, se disecó el espécimen de S. murinus y se fijó en paraformaldehído al 4% (PFA). En segundo lugar, se realizó un tratamiento enzimático y la inactivación potencial de la peroxidasa endógena. La muestra se expuso entonces al anticuerpo primario, anticuerpo de proteína anti-neurofilamento, durante 3-6 días. A continuación se incubó con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante. La reacción de color se reveló haciendo reaccionar la muestra con un sustrato de 3,3&#39;-diaminobencidina (DAB). Este método se puede aplicar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales. Además, este protocolo también puede adaptarse para probar otros anticuerpos neuronales, pero la optimización de los anticuerposDebe hacerse primero. Este método fue introducido originalmente por Kuratani y Tanaka 1 , 2 , 3 .

Las Figuras 1 - 4 muestran resultados típicos para fibras nerviosas NFP-positivas en el tracto biliar extrahepático en S. murinus . El anticuerpo contra la NFP identificó de forma reproducible la inervación en toda la imagen del tracto biliar extrahepático ( Figura 1 ), la vesícula biliar ( Figura 2 ), el conducto biliar superior ( Figura 3 ) y el área de l...

Un enfoque inmunohistoquímico de montaje completo, para visualizar la expresión de la proteína neurofilamento en el tracto biliar extrahepático en Suncus murinus. Se presenta aquí. Este protocolo se puede utilizar para analizar la inervación de todos los órganos viscerales en S. murinus u otras especies.

Uso de un método inmunohistoquímico de montaje completo para estudiar la inervación del tracto biliar en<em&gt; Suncus murinus</em

This work describes the whole-mount immunohistochemistry staining method in detail, using neurofilament protein antibody to label the innervation of the ...

El objetivo general de este procedimiento es emplear la tinción de inmunohistoquímica en preparación completa para la visualización de la distribución de los nervios dentro del tracto biliar de Suncus murinus. Este método puede utilizarse para analizar la distribución nerviosa de órganos viscerales de muchas especies, particularmente órganos irregulares o pequeños que son difíciles de evaluar mediante métodos estándar. Las principales ventajas de esta técnica son que la operación es sencilla.No requiere procedimientos complicados y tiene una alta tasa de éxito. Realizando el procedimiento conmigo estarán Yidan Dai, una estudiante de posgrado, y Shuang-Qin Yi, una investigadora adjunta, ambos de mi laboratorio. Comience por perfundir al animal con PBS individual y perfusiones de paraformaldehído al 4 % en una campana extractora.Luego, inyecte de dos a tres mililitros de látex de neopreno blanco a través del catéter de perfusión en la aorta abdominal para etiquetar los vasos sanguíneos. Y cuando todos los tejidos de interés hayan sido etiquetados, extraiga los órganos abdominales y sus nervios y vasos asociados. A continuación, inyecte aproximadamente 0,1 mililitros de látex de neopr

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Investigación

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Biology

Biología

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Todo el montaje de la tinción de inmunofluorescencia del Neonatal ratón Retina de investigar Angiogénesis<em&gt; En vivo</em

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