Name: CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Aprende el protocolo CAPRRESI para ensamblar genes quiméricos mediante inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias sinónimas. Este método rápido y económico facilita la fusión de genes en investigación biotecnológica.

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Este trabajo fue apoyado por el Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología, CONACYT, México (otorgamiento número 154833) y la Universidad Nacional Autónoma de México. Los autores desean agradecer a Víctor González, Rosa I. Santamaría, Patricia Bustos y Soledad Juárez por su asesoramiento administrativo y técnico.

1. Protocolo CAPRRESI NOTA: La figura 1 representa el protocolo CAPRRESI general. Esta técnica se basa en un diseño in silico y la posterior construcción de las quimeras deseadas. <ol><li> Selección del plásmido de clonación, pUC18 o pUC19. <ol><li> Seleccione el vector pUC que mejor se adapte a las demandas técnicas. NOTA: Ambos vectores tienen la misma secuencia, excepto la orientación del sitio de clonación múltiple. Esto es importante para el diseño de oligonucleótidos y la ruptura del plásmido de PCR. </li></ol></li><li> Análisis in silico de los genes de tipo salvaje y secuencias pUC18 / 19. <ol><li> Obtener las secuencias de ADN de los genes de tipo salvaje y guardarlos en un archivo en formato FASTA ( por ejemplo, genes.fas). NOTA: Las secuencias de vectores pUC18 / 19 están contenidas en el archivo pUC.fas ( Figura 1 , etapa 1). </li><li> Determinar qué enzima de restricciónYmes no cortan los genes wildtype y las secuencias pUC18 / 19 ejecutando el script REsearch.pl. Alternativamente, realice una búsqueda de sitios de enzimas de restricción con una herramienta en línea ( Figura 1 , paso 2). <ol><li> Escriba lo siguiente en un terminal: Perl REsearch.pl genes.fas Perl REsearch.pl pUC.fas NOTA: Estos comandos crearán los siguientes archivos de salida: genes_lin.fas, genes_re.fas, pUC_lin.fas y pUC_re.fas. </li><li> Seleccione las enzimas de restricción apropiadas para clonar los genes de tipo salvaje en el sitio de clonación múltiple del vector pUC18 / 19 elegido comparando los archivos genes_re.fas y pUC.fas. Elija la orientación del inserto relativo al gen de resistencia a ampicilina ( ampR ) del vector pUC18 / 19. </li></ol></li><li> Diseñar oligonucleótidos directos e inversos para amplificar la región codificante de los genes de tipo salvaje (oligonucleótidos externos). Incluir el sitio de enzima de restricción adecuado en cada extremo 5 &#39;De los oligonucleótidos; Esto definirá la orientación del inserto. <ol><li> Incluir un sitio funcional de unión al ribosoma en los oligonucleótidos directos. </li><li> Insertar ambos genes de tipo salvaje en la misma orientación dentro del vector. </li></ol></li></ol></li><li> Selección de las regiones de ruptura para el ensamblaje de la quimera y la disrupción del plásmido. <ol><li> Obtenga la secuencia de aminoácidos de los genes wildtype y ampR ejecutando el script translate.pl ( Figura 1 , paso 3). <ol><li> Escriba lo siguiente en un terminal: Perl translate.pl genes.fas Perl translate.pl ampR.fas NOTA: Este script creará los siguientes archivos de salida: genes_aa.fas y ampR_aa.fas. </li></ol></li><li> Alinear globalmente las dos secuencias de aminoácidos de tipo salvaje con un software apropiado ( por ejemplo, MUSCULO) 9 . </li><li> Seleccione las regiones de rotura deseadas (3-6 aminoácidos) para chimera asseEn función de la alineación de la secuencia. Guárdelos en un archivo en formato FASTA ( por ejemplo , regions.fas). </li><li> Localice las secuencias de ADN que codifican los tramos de aminoácidos seleccionados en ambos genes de tipo salvaje. </li></ol></li><li> Generación in silico de secuencias de ADN sinónimas que contienen sitios de enzimas de restricción. <ol><li> Obtener todas las secuencias de ADN sinónimas que codifican para cada segmento de secuencia de aminoácidos seleccionado como regiones de ruptura ( Figura 1 , etapa 4); Estas secuencias se almacenaron en el archivo regions.fas. <ol><li> Escriba lo siguiente en un terminal: Perl synonym.pl regions.fas NOTA: Este script creará el archivo de salida regions_syn.fas. </li></ol></li><li> Búsqueda de sitios de enzimas de restricción encontrados en secuencias de ADN sinónimo. <ol><li> Escriba lo siguiente en un terminal: perl REsynonym.pl regions_syn.fas NOTA: Este script creará el archivo de salida regions_syn-re.fas. </li></ol></li><li> Elija una enzima de restricción que se comparta entre las secuencias sinónimas de ambos genes de tipo salvaje; Este sitio será utilizado para ensamblar quimeras a través de la digestión con enzimas de restricción. Verificar que la enzima de restricción escogida no corta ni los genes de tipo salvaje ni las secuencias de vectores pUC18 / 19. <ol><li> Compare las enzimas de restricción encontradas en los archivos genes_re.fas, pUC_re.fas y regions_syn-re.fas. </li></ol></li><li> In silico sustituye los originales por sus secuencias de ADN sinónimo en los loci correspondientes en ambos genes de tipo salvaje. Añadir secuencias de ADN sinónimo en el archivo de secuencia de tipo salvaje (genes.fas). </li><li> Obtenga la secuencia de aminoácidos de los genes contenidos en el archivo genes.fas ( perl translate.pl genes.fas ). </li><li> Alinear las secuencias de aminoácidos traducidas a partir de secuencias de ADN de tipo salvaje y sinónimas. Compruebe que ambas secuencias son iguales. </li><li> Repita todos los pasos de esta sección con el gen ampR presente en la pUC18 / 19 vector. NOTA: El objetivo es interrumpir el gen ampR (archivo ampR.fas) en dos partes complementarias. La enzima de restricción seleccionada para interrumpir el gen ampR debe ser diferente de la utilizada para el ensamblaje de la quimera. </li></ol></li><li> La clonación independiente de los dos genes de tipo salvaje en el vector pUC18 / 19 seleccionado (Figura 1, etapa 3). <ol><li> Purificar el ADN de plásmido pUC18 / 19 elegido usando un kit de purificación de ADN de plásmido. <ol><li> Por ejemplo, transformar E. coli DH5α con el plásmido pUC18 y cultivar los transformantes durante la noche a 37 ° C sobre LB sólido-0,3 mg / ml de ampicilina (Amp). Elija una colonia transformante, inocule una nueva placa Amp de LB-0,3 mg / mL, y cultive la noche a la mañana a 37 ° C. </li><li> Tomar parte del cultivo anterior y cultivarlo en líquido LB-0.3 mg / mL Amp durante 6-8 h a 37 ° C. Extraer el ADN del plásmido usando un kit. </li></ol></li><li> PCR amplificar los genes de tipo salvaje del ADN genómico total utilizando el appropOligonucleótidos externos externos. Utilice una ADN polimerasa de alta fidelidad, si es posible. Seleccione la DNA polimerasa que maximiza el rendimiento. Realizar la PCR de acuerdo con las directrices del fabricante y la temperatura de fusión de los oligonucleótidos. <ol><li> Ejecutar ciclos de PCR, dependiendo de la ADN polimerasa, tamaño del amplicón, molde y oligonucleótidos usados. Por ejemplo, para amplificar el ADN de rpoD , preparar una reacción de 50 μl: 5 μl de tampón 10x, 2 μl de MgSO4 50 mM, 1 μl de mezcla dNTP 10 mM, 2 μl de cada oligonucleótido 10 μM (Tabla 2), 2 Μl de ADN molde (ADN total de E. coli DH5α), 35,8 μl de agua ultrapura y 0,2 μl de ADN polimerasa de alta fidelidad. Se realizan los siguientes ciclos de PCR: 1 min a 94ºC para la desnaturalización inicial seguido de 30 ciclos de amplificación (30 s a 94ºC para desnaturalizar, 30 s a 60ºC para recocer los oligonucleótidos y 2 min a 68ºC extender). </li><li> Disolver 1,2 g deAgarosa en 100 ml de agua doblemente destilada calentándolos en el microondas. Ensamble una bandeja de gel y un peine y póngalos en el gel horizontal. Llenar la bandeja de gel con la solución de agarosa fundida y dejar que se solidifique. Quite el peine. </li><li> Coloque el gel en la cámara de electroforesis. Rellene la cámara con 1x tampón Tris-acetato-EDTA. Cargar 50 μL de productos de PCR en los pocillos de gel. Se electroforan las muestras ( por ejemplo , a 110 V durante 1 h). </li><li> Después de la electroforesis, colorear el gel en 100 ml de agua doblemente destilada que contiene 100 μl de solución de bromuro de etidio a 1 mg / ml durante 10 minutos con agitación lenta. Lavar el gel en agua doblemente destilada durante otros 10 min en agitación lenta; Utilice un agitador horizontal. Precaución: El bromuro de etidio es un compuesto tóxico; Use guantes protectores y una capa de laboratorio de algodón. </li><li> Purificar el ADN del gen de tipo salvaje de las bandas correspondientes del gel usando un kit. Visualice las bandas colocando el gel manchado en una cámara UV (Longitud de onda recomendada: 300 nm). Mantenga la exposición del gel a un mínimo. Utilice un kit de purificación de ADN y siga las instrucciones del fabricante. Precaución: La radiación UV es peligrosa; Use un escudo protector, gafas y una capa de laboratorio de algodón. </li></ol></li><li> Digest purificaron genes de tipo salvaje y pUC18 / 19 plásmido de ADN con las enzimas de restricción de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Use enzimas de digestión rápida cuando sea posible. Por ejemplo, digerir 6 μL de ADN de pUC18 (300 ng / μl) en 10 μl de agua ultrapura, 2 μl de tampón 10X, 1 μl de enzima de restricción Kpn I y 1 μl de enzima de restricción Xba I. Dejar la reacción a 37 ° C durante 30 min. <ol><li> Inactivar las enzimas de restricción de acuerdo con las directrices del fabricante. Por ejemplo, inactivar la reacción de doble digestión Kpn I - Xba I a 80 ° C durante 5 min. </li></ol></li><li> Mezcla de inserto: vector de ADN a una velocidad volumétricaO de 3: 1. Siga las instrucciones del fabricante para una reacción de ligadura. Utilice enzimas de ligación rápida cuando sea posible (deje la reacción a 25 ° C durante 10 min). NOTA: Típicamente, la concentración de ADN después de la purificación utilizando los kits es lo suficientemente buena para las reacciones de digestión y ligadura. Por ejemplo, añadir 6 μl de ADN rpoD ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 3 μl de ADN pUC18 ( Kpn I- Xba I, 150 ng / μl), 10 μl de tampón 2x, 1 μl de ultrapuro Agua, y 1 μl de T4 ADN ligasa. Dejar la reacción de ligadura a 25 ° C durante 10 min. </li><li> Transformar el E. coli DH5α con 2-4 μl de la reacción de ligación, como se describe en los Materiales Complementarios. Placa de las células transformadas en sólido LB / Amp / X-gal / IPTG placas. Dejar las placas durante una noche a 37ºC. </li><li> Seleccione las colonias de E. coli transformantes de color blanco y pétalas en una nueva placa LB / Amp. Dejar las placas durante la noche a 37 ° C. &lt;Li <li> Realizar una PCR de colonias para elegir candidatos para secuenciar la reacción, como se describe en los Materiales Complementarios. Extraer el ADN del plásmido de los candidatos. Alternativamente, digerir el ADN del plásmido candidato con las mismas enzimas de restricción usadas para clonar los insertos. </li><li> Secuencia de construcciones candidatas con un proveedor de servicios de secuenciación 10 . Ensamble la secuencia en silico usando un ensamblador de ADN 11 ( Figura 1 , paso 5). </li></ol></li><li> Interrupción del plásmido por PCR seguida por digestión con enzimas de restricción. <ol><li> Diseñar en silico oligonucleótidos directos e inversos en regiones de rotura para genes de tipo salvaje y ampR , respectivamente. Sustituir in silico el fragmento de tipo salvaje para su correspondiente secuencia de ADN sinónimo (obtenida en el paso 1.4). NOTA: Esta secuencia de ADN sinónimo contiene un sitio de enzima de restricción. Los oligonucleótidos hacia adelante y hacia atrás se solapan en tSitio de la enzima de restricción. Los oligonucleótidos deben oscilar entre 21-27 nucleótidos, terminar con una citosina o guanina, y contener un sitio de enzima de restricción. Un oligonucleótido directo tiene la misma secuencia que su región diana sobre el ADN molde. Un oligonucleótido inverso es la secuencia complementaria inversa de la región diana sobre el ADN molde. </li><li> Utilizar las dos construcciones de genes de tipo salvaje como la plantilla de ADN para reacciones de PCR ( por ejemplo, pUC18 rpoD y pUC18 sigA ). Obtener dos partes complementarias de cada construcción (pUC18 rpoD σ1-σ2, pUC18 rpoD σ3-σ4, pUC18 sigA σ1-σ2, y pUC18 sigA σ3-σ4) ( Figura 1 , etapa 6). </li><li> Cargar muestras de ADN en un gel de agarosa 1-1,2% [p / v]. Separar los productos de PCR de la plantilla de ADN mediante electroforesis ( por ejemplo, 110 V durante 1 h). Alternativamente, digerir las reacciones de PCR con Dpn I para romper la plantilla de ADN. NOTA: DpnI sólo reconoce secuencias de ADN metiladas (5&#39;-GATC-3 &#39;). <ol><li> Purificar las muestras utilizando un kit de purificación de ADN. Siga las instrucciones del fabricante. </li></ol></li><li> Doble digerir todos los fragmentos de ADN complementarios con las enzimas de restricción apropiadas de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Use enzimas de restricción de digestión rápida cuando sea posible. Por ejemplo, digerir doblemente el fragmento de ADN pUC18rpoDσ1-σ2 con Afl II y Spe I usando el protocolo del fabricante. Dejar la reacción de digestión a 37 ° C durante 15 min. </li><li> Inactivar las enzimas de restricción de acuerdo con las directrices del fabricante. Por ejemplo, inactivar Afl II- Spe I a 80 ° C durante 20 min. </li></ol></li><li> Recuperación de plásmido utilizando ligación de ADN y transformación bacteriana. <ol><li> Mezclar los fragmentos de ADN adecuados en una proporción volumétrica de 1: 1 para ensamblar el gen quimérico deseado ( Figura1, etapa 7). NOTA: De este modo, se restaura la integridad del gen ampR , produciendo una proteína funcional. <ol><li> Por ejemplo, mezclar 4 μL de ADN pUC18 rpoD σ1-σ2 (digerido con Afl II- Spe I, 150 ng / μl), 4 μl de ADN pUC18 sigA σ3-σ4 ( Afl II- Spe I, 150 ng / μl) 10 μl de 2x tampón, 2 μL de agua ultrapura y 1 μl de T4 DNA ligasa; La concentración de ADN después de la purificación del kit es suficiente para la digestión y posterior ligadura. Dejar la reacción de ligadura a 25 ° C durante 10 min. </li></ol></li><li> Transformar E. coli DH5α con 3-5 μL de la reacción de ligación del conjunto quimérico (Materiales Complementarios). Cultivar las células transformantes en LB / Amp / X-gal / IPTG placas durante la noche a 37 ° C durante la noche. </li><li> Seleccione las colonias de E. coli transformantes de color blanco y pétalas en una nueva placa LB / Amp. Dejar las placas durante la noche a 37ºC.DO. </li><li> Realice una PCR de colonia para elegir candidatos para una reacción de secuenciación, como se describe en los Materiales Complementarios. Visualizar las bandas en un gel de agarosa al 1-1,2% (p / v) realizando electroforesis (descrita en el paso 2.3.2.1). </li><li> Cultivar culturas de candidatos positivos. Extraer ADN de plásmido de ellos utilizando un kit de purificación de ADN plasmídico. </li></ol></li></ol> 2. Construcciones Quiméricas de Candidatos de Secuencia <ol><li> Asegúrese de que la calidad del ADN plasmídico es lo suficientemente buena para la reacción de secuenciación siguiendo las directrices de la secuencia del proveedor de servicios. Extraer el ADN utilizando kits de purificación. Por ejemplo, en la página de Internet de la secuencia del proveedor de servicios, preste especial atención a la concentración de ADN recomendada para las muestras. Obtener la concentración de muestras utilizando un instrumento de cuantificación de ADN. </li><li> Secuencia de construcciones quiméricas candidatas con un proveedor de servicios de secuenciación 10 . </li><li> Ensamblar<html> Quencing lee con un ensamblador de ADN in silico 11 . </li><li> Alinear secuencias quiméricas diseñadas ensambladas en silico usando herramientas de alineación de secuencias 9 , 12 . Verificar que el gen quimérico se fusionó satisfactoriamente. </li></ol> 3. Hacer Preparaciones NOTA: Todos los pasos que involucran células vivas deben realizarse en una campana de flujo laminar limpio con el quemador Bunsen encendido. <ol><li> Producción de células competentes de E. coli DH5α. <ol><li> Para producir células compatibles con E. coli , siga los protocolos publicados 13 o vea los Materiales Complementarios . Alternativamente, utilice células competentes comercialmente disponibles. </li></ol></li><li> Transformación de células competentes de DH5α de E. coli . <ol><li> Para la transformación química de cultivos de E. coli , siga los protocolos publicadosClass = &quot;xref&quot;&gt; 13 o vea los Materiales Complementarios . Alternativamente, use la electroporación para la transformación bacteriana. Si se utilizan células competentes comercialmente disponibles, siga las directrices del fabricante. </li></ol></li><li> Purificación de ADN genómico y plásmido de E. coli DH5α. <ol><li> Realizar la extracción de ácido nucleico, como se indica en los Materiales Complementarios , utilizando kits comercialmente disponibles o siguiendo protocolos publicados 13 . </li></ol></li><li> Realizar PCR de colonias. <ol><li> Utilice esta técnica para identificar las colonias transformantes candidatas para la posterior reacción de secuenciación. NOTA: Este método no representa una verificación final de la integridad de las secuencias. Una descripción detallada de esta técnica está disponible en los Materiales Complementarios . </li></ol></li><li> Preparación de las soluciones. <ol><li> Ver <sTrong&gt; Tabla 1 para más información sobre la preparación de la solución. </li></ol></li><li> Descargue los scripts y archivos de secuencia necesarios para el protocolo CAPRRESI. <ol><li> Descargue archivos de banco de genes que contengan la secuencia completa del genoma de la especie deseada, extraiga la secuencia de ADN del gen elegido usando un navegador genómico y guárdelo en formato de archivo fasta. Descargue los scripts Perl necesarios para el protocolo CAPRRESI. Guarde los scripts y los archivos de secuencia en el mismo directorio. </li></ol></li></ol>

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Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

CAPRRESI fue diseñado como una alternativa al PRM 2 . El PRM original es una técnica poderosa; Permite la fusión de secuencias de ADN a lo largo de cualquier parte de los genes seleccionados. Para PRM, los genes de tipo salvaje deben ser clonados en el mismo plásmido. Después de eso, los oligonucleótidos están diseñados dentro de genes de resistencia a antibióticos y de tipo salvaje encontrados en el plásmido. La ruptura del plásmido se consigue por PCR usando polimerasas de ADN de alta fidelidad...

El montaje de genes quiméricos ha sido ampliamente utilizado en biología molecular para elucidar la función de la proteína y / o para propósitos biotecnológicos. Existen diferentes métodos para fusionar genes, tales como la superposición de la amplificación del producto de PCR 1 , la recuperación 2 del plásmido, la recombinación homóloga 3 , los sistemas CRISPR-Cas9 4 , la recombinación dirigida 5 y el conjunto 6 de Gibson. Cada una de ellas ofrece diferentes ventajas técnicas; Por ejemplo, la flexibilidad del diseño de PCR superpuesto, la selección in vivo de construcciones durante la recuperación del plásmido o la alta eficiencia de los sistemas CRISPR-Cas9 y Gibson. Por otro lado, pueden surgir algunas dificultades al realizar algunos de estos métodos; Por ejemplo, los dos primeros enfoques se basan en fragmentos de ADN de extremos romos, y la ligadura de estos tipos de productos podría ser técnicamente difícil en comparación con sticKy-terminó ligadura. La recombinación dirigida puede dejar trazas de secuencias de ADN adicionales (cicatrices) en el original, como en el sistema CreloxP 5 . CRISPR-Cas9 a veces puede modificar otras regiones del genoma, además de la meta de sitio [ 4] . Aquí, se introduce el conjunto de quimeras mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo para fusionar genes que codifican proteínas que combina el método de recuperación de plásmidos (PRM) con la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas, . Para asegurar la integridad de la secuencia de aminoácidos, los sitios de enzimas de restricción se insertan en secuencias de secuencia de ADN sinónimo. Entre los beneficios de CAPPRESI cabe destacar que puede realizarse con reactivos / herramientas de laboratorio comunes ( por ejemplo , enzimas, células competentes, soluciones y termociclador) y que puede dar resultados rápidos (cuando se utilizan las enzimas apropiadas). Basándose en la restricciónLos sitios de enzimas que emergen de secuencias de ADN sinónimas pueden limitar la selección de los puntos de fusión exactos dentro de las proteínas de interés. En tales casos, los genes diana deben fusionarse usando oligonucleótidos superpuestos, y los sitios de enzimas de restricción deben insertarse en el gen de resistencia del vector. CAPRRESI consiste en siete pasos simples ( Figura 1 ): 1) selección del vector de clonación, pUC18 o pUC19 6 ; 2) análisis in silico de las secuencias de tipo salvaje a fusionar; 3) selección de las regiones de rotura para el montaje de la quimera y la interrupción del plásmido; 4) generación in silico de secuencias de ADN sinónimas que contienen sitios de enzimas de restricción; 5) clonación independiente de los genes de tipo salvaje en el plásmido seleccionado; 6) interrupción del plásmido por PCR, seguido de digestión con enzimas de restricción; Y 7) recuperación de plásmido usando ligación de ADN y transformación bacteriana. Los genes quiméricos producidos por esta técnica deben ser verificados wCon la secuenciación. Los vectores pUC18 / 19 ofrecen ventajas técnicas para la clonación y montaje de quimeras, tales como tamaño pequeño ( es decir, 2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial 7 . Aquí, un huésped de Escherichia coli se utilizó para ensamblar y manejar las quimeras porque los cultivos bacterianos son baratos y crecen rápidamente. Teniendo en cuenta esto, será necesaria la clonación subsiguiente de los fragmentos de fusión en los plásmidos diana finales ( por ejemplo, vectores de expresión como pRK415 en bacterias o pCMV en células de mamífero). CAPRRESI se ensayó por fusionar dos genes del factor sigma primario: E. colirpoD y Rhizobium etlisigA . Los factores sigma primarios son subunidades de ARN polimerasa responsables de la iniciación de la transcripción, y consisten en cuatro dominios ( es decir, σ1, σ2, σ3 y σ4) 8 . La longitud de la secuencia de aminoácidosH de proteínas codificadas por rpoD y sigA son 613 y 685, respectivamente. RpoD y SigA comparten 48% de identidad (98% de cobertura). Estos factores sigma primaria se dividieron en dos fragmentos complementarios entre las regiones σ2 y σ3. Se montaron dos genes quiméricos según este diseño: quimera 01 (RpoDσ1-σ2 + SigAσ3-σ4) y quimera 02 (SigAσ1-σ2 + RpoDσ3-σ4). Los productos de fusión de ADN se verificaron por secuenciación.

<table><tbody><tr><td>Platinum Taq DNA Polymerasa de alta fidelidad</td><td>Thermo Fisher</td><td>11304011</td><td>Produce una mezcla de productos de PCR con saliente romo/3'-A Kit de aislamiento de</td></tr><tr><td>plásmidos de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11754785001</td><td>Se utiliza para todas las reacciones de purificación de plásmidos</td></tr><tr><td>Kit de purificación de productos de PCR de alta pureza</td><td>Roche</td><td>11732676001</td><td>Se utiliza para todas las reacciones de purificación de PCR a partir de geles de</td></tr> <tr><td>agarosaEnzima de restricción AflII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0520L</td><td>Reconoce la secuencia 5'-CTTAAG-3' y corta a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>KpnI-HF enzima de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td>R3142L</td><td>Reconoce la secuencia 5'-GGTACC-3' y corta a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>SpeI-HF enzima de restricción</td><td>New England Biolabs</td><td>R3133L</td><td>Reconoce la secuencia 5'-ACTAGT-3' y corta a 37 &deg; Enzima</td></tr><tr><td>de restricción C XbaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0145L</td><td>Reconoce la secuencia 5'-TCTAGA-3' y corta a 37 &deg; C</td></tr><tr><td>Ampicilina sal sódica</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0166-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Ácido nalidíxico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>N8878-5G</td><td>Antibióticos</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Y1625-1KG</td><td>Cultivo de células bacterianas</td></tr><tr><td>Peptona de caseína</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70171-500G</td><td>Cultivo de células bacterianas</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9888-1KG</td><td>cloruro de sodio</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Sigma Aldrich</td><td>05040-1KG Cultivo de</td><td>células bacterianas</td></tr><tr><td>XbaI enzima de restricción</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0684</td><td>Digestión rápida XbaI enzima</td></tr><tr><td>KpnI enzima de restricción</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0524</td><td>Kit de ligadura rápida de digestión rápida KpnI enzyme</td></tr><tr><td></td><td>New England Biolabs</td><td>M2200S</td><td>Kit de ligadura rápida de ADN</td></tr><tr><td>AflII enzima de restricción</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD0834</td><td>Digestión rápida AflII enzyme</td></tr><tr><td>SpeI enzima de restricción</td><td>Thermo Fisher</td><td>FD1253</td><td>Enzima de digestión rápida SpeI enzyme</td></tr></tbody></table>

caprresi: ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

CAPRRESI: Chimera Assembly by Plasmid Recovery and Restriction Enzyme Site Insertion

En este caso, presentamos el ensamblaje de la quimera mediante la recuperación del plásmido y la inserción del sitio de la enzima de restricción (CAPRRESI). CAPRRESI se beneficia de muchas fortalezas del método original de recuperación de plásmidos e introduce la digestión con enzimas de restricción para facilitar las reacciones de ligación de ADN (necesarias para el montaje de quimeras). Para este protocolo, los usuarios clonan genes de tipo salvaje en el mismo plásmido (pUC18 o pUC19). Después de la selección in silico de las regiones de secuencia de aminoácidos en las que deberían montarse quimeras, los usuarios obtienen todas las secuencias de ADN sinónimas que las codifican. Los scripts Perl ad hoc permiten a los usuarios determinar todas las secuencias de ADN del sinónimo. Después de este paso, otro script Perl busca sitios de enzimas de restricción en todas las secuencias de ADN sinónimas. Este análisis in silico también se realiza usando el gen de resistencia a ampicilina ( ampR ) encontrado en plásmidos pUC18 / 19. Los usuarios diseñan oligonucleótidos dentro de regiones sinónimas para interrumpir genes de tipo salvaje y ampR por PCR. Después de obtY purificación de fragmentos de ADN complementarios, se lleva a cabo la digestión con enzimas de restricción. El montaje de la quimera se logra mediante ligación de fragmentos de ADN complementarios apropiados. Los vectores pUC18 / 19 se seleccionan para CAPRRESI porque ofrecen ventajas técnicas, tales como tamaño pequeño (2,686 pares de bases), alto número de copias, características de reacción de secuenciación ventajosas y disponibilidad comercial. El uso de enzimas de restricción para el montaje de quimeras elimina la necesidad de polimerasas de ADN que producen productos de extremos romos. CAPRRESI es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

La figura 1 representa CAPRRESI. Usando este método, se montaron dos genes quiméricos intercambiando los dominios de dos factores sigma bacterianos primarios ( es decir, E. coli RpoD y R. etli SigA). Las secuencias de ADN de los genes rpoD y sigA se obtuvieron utilizando el Artemis Genome Browser 14 de GenBank genoma ficheros NC_000913 y NC_007761, respectivamente. La secuencia de ADN del vector pUC18 se obtuvo ...

Aquí, se presenta el ensamblaje de quimeras mediante la recuperación de plásmidos y la inserción en el sitio de enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo basado en la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas y recuperación funcional de plásmidos. Este protocolo es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

Here, we present chimera assembly by plasmid recovery and restriction enzyme site insertion (CAPRRESI). CAPRRESI benefits from many strengths of the ...

Este video demuestra un procedimiento denominado Ensamblaje de Quimera mediante Recuperación de Plásmidos e Inserción de Sitios de Enzimas de Restricción o CAPRRESI, en el cual se generan dos genes quiméricos mediante la introducción de sitios específicos de enzimas de restricción en ADN sinónimo y, posteriormente, cortando e intercambiando las secuencias de ADN. En CAPRRESI, primero se insertan los genes de tipo salvaje de interés en los sitios de clonación múltiple del mismo vector. A continuación, se seleccionan las regiones de ruptura para cada gen con la misma secuencia de aminoácidos y se selecciona la región de ruptura para el gen de resistencia a la ampicilina.Se utilizan scripts Perl para determinar secuencias sinónimas que contienen sitios de restricción para cada región de ruptura. Mediante oligos especialmente diseñados, se realiza una PCR para producir cuatro fragmentos complementarios que contienen ADN sinónimo con los sitios de la enzima de restricción deseados. Los productos de PCR resultantes se purifican, digieren y luego se liguen para generar una secuencia quimérica.La principal ventaja de esta técnica es que facilita las fusiones génicas. Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el campo de la biología molecular, como, cuáles son las funciones de nuestra proteinzima. Comience este procedimiento con los genes de interés ya insertados en los sitios de clonación múltiple de los vectores.Aquí, los genes rpoD y sigA, que codifican factores de señal bacterianos necesarios para iniciar la síntesis de ARN, han sido clonados cada uno en pUC18 según se describe en el texto adjunto. Para diseñar el oligonucleótido para producir la proteína quimérica, primero ejecute el script perl translate.pl para obtener la secuencia de aminoácidos de los genes rpoD, sigA y ampR.Luego, utilizando el servidor web Muscle, alinee las secuencias de aminoácidos de rpoD y sigA. Para cada secuencia, seleccione una región de ruptura con la misma secuencia de tres a seis aminoácidos. Guarde las secuencias en el archivo regions.fas.A continuación, seleccione una secuencia de tres a seis aminoácidos de longitud dentro del gen ampR y guarde esta secuencia en el archivo regions.fas. Para determinar todas las secuencias de ADN sinónimas, ejecute el script de perl synonym.pl. Luego, para identificar qué enzimas de restricción cortan las secuencias sinónimas, ejecute el script resynonym.pl.A continuación, utilice las secuencias de ADN sinónimas para diseñar oligonucleótidos que incorporen el mismo sitio de enzima de restricción en las regiones de rotura de rpoD y sigA. Diseñe un oligonucleótido para interrumpir el gen ampR que incorpore un sitio diferente de enzima de restricción. Los oligonucleótidos directo e inverso se solaparán en el sitio de la enzima de restricción.Los oligonucleótidos deben tener entre 21 y 27 nucleótidos y contener citosina o guanina, así como un sitio para enzima de restricción. Un oligonucleótido directo tiene la misma secuencia que su región diana en el ADN molde. Un oligonucleótido inverso es la secuencia complementaria inversa de la región diana en el ADN molde.Pedir los oligonucleótidos a un proveedor de síntesis de ADN. Cuando lleguen los oligonucleótidos, utilícelos para realizar PCR usando los constructos rpoD y sigA en pUC18 como ADN molde. Esto producirá dos fragmentos complementarios para cada construcción.Después de la PCR, realice electroforesis en gel de agarosa para separar los productos de PCR de la plantilla de ADN. La purificación de las partes complementarias del plásmido es crucial para evitar la contaminación con plásmidos parentales. Los plásmidos parentales pueden eliminarse mediante la purificación en gel, como demostramos aquí, o mediante la digestión con la enzima de restricción DpnI, que puede utilizarse para degradar los plásmidos parentales.Después de la electroforesis, tiña el gel con solución de bromuro de etidio. Visualice las bandas colocando el gel teñido en una cámara de luz ultravioleta a 300 nanómetros. Mantenga la exposición del gel al mínimo.Luego, corte los tramos que contienen los productos de PCR y colóquelos en tubos de microcentrífuga. Utilice un kit para purificar las muestras de ADN, y luego, con las enzimas de restricción de digestión rápida apropiadas, realice una digestión doble sobre todos los fragmentos de ADN complementarios. Se utilizan AFL2 y SPE1 para fusionar las partes complementarias del plásmido.Incube la reacción de digestión a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, inactivar las enzimas de restricción según las indicaciones del fabricante. Por ejemplo, inactivar AFL2, SPE1 a 80 grados Celsius durante 20 minutos.A continuación, combine los fragmentos de ADN apropiados con tampón de ligación, agua y ligasa T4 de ADN. Incube la reacción de ligación a 25 grados Celsius durante 10 minutos. De este modo, se restaura la integridad del gen ampR, produciendo una proteína funcional.Después de la ligación, transforme E. coli DH5 alfa con tres a cinco microlitros de la reacción de ligación del ensamblaje de la quimera. Plaque las células transformantes en placas de LB con ampicilina, x-gal e IPTG e incube durante la noche a 37 grados Celsius. Al día siguiente, seleccione colonias blancas de E. coli transformantes y estríeles en una nueva placa de LB con ampicilina.Incubar las placas durante la noche a 37 grados Celsius. Para seleccionar los candidatos para la secuenciación, realizar una PCR de colonias. Visualizar las bandas en un gel de agarosa al 2% mediante electroforesis, como se realizó anteriormente.Seleccione colonias candidatas que muestren la curvatura de ADN del tamaño correcto para inocular cultivos. Al día siguiente, extraiga el ADN plasmídico de ellas utilizando un kit. Después de la purificación del plásmido, envíe las muestras para su secuenciación.Los constructos quiméricos rpoD sigA se generaron según se detalla en este video. Tras la secuenciación, se realizó el alineamiento de los genes de tipo salvaje y quiméricos utilizando el software muscle. Luego, las secuencias de los genes quiméricos se ensamblaron con el software mura como se muestra aquí.Las secuencias sinónimas aparecen en negro y el sitio AFL2 aparece subrayado. Estos datos de secuenciación demuestran el uso exitoso del método CAPRRESI para generar construcciones quiméricas. Después de ver este video, debería tener una buena opción para fusionar segmentos génicos.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

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CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

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